Name: Membrane basale nanofibrillaire en soie d’araignée fonctionnalisée recombinante dans des inserts de culture tissulaire sur mesure (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 17 s
Description: Découvrez la préparation de membranes en soie d'araignée fonctionnalisée pour des modèles tissulaires in vitro plus physiologiques. Cette méthode améliore la culture cellulaire et réduit les tests animaux.

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<meta charset="utf8"></head><body>Formation et fixation de membranes FN-Silk à des inserts de culture cellulaire

<ol><li>Kumar, P., Kedaria, D., Mahapatra, C., Mohandas, M., Chatterjee, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+designer+cell+culture+insert+with+a+nanofibrous+membrane+toward+engineering+an+epithelial+tissue+model+validated+by+cellular+nanomechanics%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale+Adv%22%5BJournal%5D)">A designer cell culture insert with a nanofibrous membrane toward engineering an epithelial tissue model validated by cellular nanomechanics.</a> Nanoscale Adv. 3 (16), 4714-4725 (2021).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrathin+and+handleable+nanofibrous+net+as+a+novel+biomimetic+basement+membrane+material+for+endothelial+barrier+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Colloids+Surf+B+Biointerfaces%22%5BJournal%5D)">Ultrathin and handleable nanofibrous net as a novel biomimetic basement membrane material for endothelial barrier formation.</a> Colloids Surf B Biointerfaces. 219, 112775(2022).</li>
<li>Jain, P., Rauer, S. B., Möller, M., Singh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mimicking+the+natural+basement+membrane+for+advanced+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Mimicking the natural basement membrane for advanced tissue engineering.</a> Biomacromolecules. 23 (8), 3081-3103 (2022).</li>
<li>Eom, S., Park, S. M., Han, S. J., Kim, J. W., Kim, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+fabrication+of+a+tunable+nanofibrous+well+insert+via+electrolyte-assisted+electrospinning%5BTitle%5D)+AND+%22RSC+Advances%22%5BJournal%5D)">One-step fabrication of a tunable nanofibrous well insert via electrolyte-assisted electrospinning.</a> RSC Advances. 7 (61), 38300-38306 (2017).</li>
<li>Kim, D., Eom, S., Park, S. M., Hong, H., Kim, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+collagen+gel-coated%2C+aligned+nanofiber+membrane+for+enhanced+endothelial+barrier+function%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">A collagen gel-coated, aligned nanofiber membrane for enhanced endothelial barrier function.</a> Sci Rep. 9 (1), 1-11 (2019).</li>
<li>Ebrahim, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Porous+honeycomb+film+membranes+enhance+endothelial+barrier+integrity+in+human+vascular+wall+bilayer+model+compared+to+standard+track-etched+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Mater+Res+A%22%5BJournal%5D)">Porous honeycomb film membranes enhance endothelial barrier integrity in human vascular wall bilayer model compared to standard track-etched membranes.</a> J Biomed Mater Res A. 111 (5), 701-713 (2023).</li>
<li>Zakharova, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transwell-integrated+2+%C2%B5m+thick+transparent+polydimethylsiloxane+membranes+with+controlled+pore+sizes+and+distribution+to+model+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Materials+Technologies%22%5BJournal%5D)">Transwell-integrated 2 µm thick transparent polydimethylsiloxane membranes with controlled pore sizes and distribution to model the blood-brain barrier.</a> Advanced Materials Technologies. 6 (12), 2100138(2021).</li>
<li>Park, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+elastic%2C+porous%2C+and+ultrathin+co-culture+membranes+to+control+the+endothelial+barrier+function+via+cell+alignment%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Functional+Materials%22%5BJournal%5D)">Use of elastic, porous, and ultrathin co-culture membranes to control the endothelial barrier function via cell alignment.</a> Advanced Functional Materials. 31 (9), 2008172(2021).</li>
<li>Youn, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Facile+and+adhesive-free+method+for+bonding+nanofiber+membrane+onto+thermoplastic+polystyrene+substrate+to+fabricate+3D+cell+culture+platforms%5BTitle%5D)+AND+%22Materials+Today+Bio%22%5BJournal%5D)">Facile and adhesive-free method for bonding nanofiber membrane onto thermoplastic polystyrene substrate to fabricate 3D cell culture platforms.</a> Materials Today Bio. 20, 100648(2023).</li>
<li>Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrohydrodynamic+jet-printed+ultrathin+polycaprolactone+scaffolds+mimicking+Bruch%E2%80%99s+membrane+for+retinal+pigment+epithelial+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Bioprint%22%5BJournal%5D)">Electrohydrodynamic jet-printed ultrathin polycaprolactone scaffolds mimicking Bruch’s membrane for retinal pigment epithelial tissue engineering.</a> Int J Bioprint. 8 (3), 550(2022).</li>
<li>Dogan, A. A., Dufva, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Customized+3D-printed+stackable+cell+culture+inserts+tailored+with+bioactive+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Customized 3D-printed stackable cell culture inserts tailored with bioactive membranes.</a> Sci Rep. 12 (1), 1-12 (2022).</li>
<li>Rohde, F., Danz, K., Jung, N., Wagner, S., Windbergs, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrospun+scaffolds+as+cell+culture+substrates+for+the+cultivation+of+an+in+vitro+blood%E2%80%93brain+barrier+model+using+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Electrospun scaffolds as cell culture substrates for the cultivation of an in vitro blood–brain barrier model using human induced pluripotent stem cells.</a> Pharmaceutics. 14 (6), 1308(2022).</li>
<li>Slater, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+model+of+the+glomerular+capillary+wall+using+electrospun+collagen+nanofibres+in+a+bioartificial+composite+basement+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">An in vitro model of the glomerular capillary wall using electrospun collagen nanofibres in a bioartificial composite basement membrane.</a> PLoS ONE. 6 (6), e20802(2011).</li>
<li>Harris, T. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utilizing+recombinant+spider+silk+proteins+to+develop+a+synthetic+Bruch%E2%80%99s+membrane+for+modeling+the+retinal+pigment+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Biomater+Sci+Eng%22%5BJournal%5D)">Utilizing recombinant spider silk proteins to develop a synthetic Bruch’s membrane for modeling the retinal pigment epithelium.</a> ACS Biomater Sci Eng. 5 (8), 4023-4036 (2019).</li>
<li>Hjelm, L. C., Hedhammar, M., Löfblom, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+blood%E2%80%93brain+barrier+model+based+on+recombinant+spider+silk+protein+nanomembranes+for+evaluation+of+transcytosis+capability+of+biomolecules%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">In blood–brain barrier model based on recombinant spider silk protein nanomembranes for evaluation of transcytosis capability of biomolecules.</a> Biochem Biophys Res Commun. 669, 77-84 (2023).</li>
<li>Gustafsson, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+spider+silk+forms+tough+and+elastic+nanomembranes+that+are+protein-permeable+and+support+cell+attachment+and+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Functional+Materials%22%5BJournal%5D)">Recombinant spider silk forms tough and elastic nanomembranes that are protein-permeable and support cell attachment and growth.</a> Advanced Functional Materials. 30 (40), 2002982(2020).</li>
<li>Tasiopoulos, C. P., Gustafsson, L., Van Der Wijngaart, W., Hedhammar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibrillar+nanomembranes+of+recombinant+spider+silk+protein+support+cell+co-culture+in+an+in+vitro+blood+vessel+wall+model%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Biomater+Sci+Eng%22%5BJournal%5D)">Fibrillar nanomembranes of recombinant spider silk protein support cell co-culture in an in vitro blood vessel wall model.</a> ACS Biomater Sci Eng. 7 (7), 3332-3339 (2021).</li>
<li>Marino, A., Baronio, M., Buratti, U., Mele, E., Ciofani, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Porous+optically+transparent+cellulose+acetate+scaffolds+for+biomimetic+blood-brain+barrier+in+vitro+models%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Bioeng+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Porous optically transparent cellulose acetate scaffolds for biomimetic blood-brain barrier in vitro models.</a> Front Bioeng Biotechnol. 9, 630063(2021).</li>
<li>Schramm, R. A., Koslow, M. H., Nelson, D. A., Larsen, M., Castracane, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+impedance+biosensor+for+measurement+of+trans-epithelial+resistance+in+cells+cultured+on+nanofiber+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors%22%5BJournal%5D)">A novel impedance biosensor for measurement of trans-epithelial resistance in cells cultured on nanofiber scaffolds.</a> Biosensors. 7 (3), 35(2017).</li>
<li>Qi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+a+human+iPSC-+and+nanofiber-based+microphysiological+blood-brain+barrier+system%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Appl+Mater+Interfaces%22%5BJournal%5D)">Establishment of a human iPSC- and nanofiber-based microphysiological blood-brain barrier system.</a> ACS Appl Mater Interfaces. 10 (26), 21825-21835 (2018).</li>
<li>Rickabaugh, E., Weatherston, D., Harris, T. I., Jones, J. A., Vargis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+a+biomimetic+in+vitro+model+of+Bruch%E2%80%99s+membrane+using+hagfish+slime+intermediate+filament+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Biomater+Sci+Eng%22%5BJournal%5D)">Engineering a biomimetic in vitro model of Bruch’s membrane using hagfish slime intermediate filament proteins.</a> ACS Biomater Sci Eng. 9 (8), 5051-5061 (2023).</li>
<li>Choi, J. W., Youn, J., Kim, D. S., Park, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+iPS-derived+blood-brain+barrier+model+exhibiting+enhanced+barrier+properties+empowered+by+engineered+basement+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Human iPS-derived blood-brain barrier model exhibiting enhanced barrier properties empowered by engineered basement membrane.</a> Biomaterials. 293, 121983(2023).</li>
<li>Widhe, M., Shalaly, N. D., Hedhammar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fibronectin+mimetic+motif+improves+integrin+mediated+cell+biding+to+recombinant+spider+silk+matrices%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">A fibronectin mimetic motif improves integrin mediated cell biding to recombinant spider silk matrices.</a> Biomaterials. 74, 256-266 (2016).</li>
<li>Johansson, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+of+functionalized+silk+together+with+cells+to+obtain+proliferative+3D+cultures+integrated+in+a+network+of+ECM-like+microfibers%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Assembly of functionalized silk together with cells to obtain proliferative 3D cultures integrated in a network of ECM-like microfibers.</a> Sci Rep. 9 (1), 1-13 (2019).</li>
<li>Widhe, M., Johansson, U., Hillerdahl, C. O., Hedhammar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+spider+silk+with+cell+binding+motifs+for+specific+adherence+of+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Recombinant spider silk with cell binding motifs for specific adherence of cells.</a> Biomaterials. 34 (33), 8223-8224 (2013).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td><PRODUITS CHIMIQUE>S</FORT></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen ; Thermo Fisher Scientific</td><td>A-21121</td><td>Chèvre anti-souris, Dilution 1:500</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Phalloïdine</td><td>Invitrogen ; Thermo Fisher Scientific</td><td>A12379</td><td>Dilution 1:400</td></tr><tr><td>anticorps anti-ZO-1 (1A12)</td><td>Invitrogen ; Thermo Fisher Scientific</td><td>&nbsp ; 33-9100</td><td>Souris anti-humaine, monoclonale, dilution 1:200</td></tr><tr><td>Dextran, Alexa Fluor 680 ; 3 000 MW,</td><td>Invenzogène anionique ; Thermo Fisher Scientific</td><td>D34681</td><td>Dilué à 2,5 % (p/v) dans 200 ul de milieu de culture</td></tr><tr><td>DMEM/F-12</td><td>Gibco ; Thermo Fisher Scientific</td><td>31330095</td><td>Supplémenté avec 5 % v/v de FBS et 1 % v/v de pénicilline-streptomycine</td></tr><tr><td>éthanol.</td><td>Solveco</td><td>1326</td><td>70 % (n° CAS 64-17-5)</td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal, qualifié, inactivé par la chaleur, États-Unis</td><td>Gibco ; Thermo Fisher Scientific</td><td>16140071</td><td></td></tr><tr><td>FN-silk</td><td>Spiber technologies AB</td><td></td><td>Boutique à -80 &deg ; C</td></tr><tr><td>Isopropanol, réactif analytique EMPARTA ACS</td><td>Supelco</td><td>1096342511</td><td>&ge ; 99,5 % (n° CAS 67-63-0)</td></tr><tr><td>Kit de viabilité/cytotoxicité</td> vivant/mort <td>Invitrogen ; Thermo Fisher Scientific</td><td>L3224</td><td></td></tr><tr><td>PBS&nbsp ;</td><td>Agence vétérinaire suédoise / Statens veterin&auml ; rmedicinska anstalt</td><td>992420</td><td>&nbsp ; sans Ca et Mg,</td></tr><tr><td>pénicilline-streptomycine filtrée (10 000 U/mL)</td><td>Gibco ; Thermo Fisher Scientific</td><td>11548876<</td><td></td></tr><tr><td>STRONG>MATERIAL</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dental LT</td><td>Denthouse</td> en résine transparente<td>#DLCL-01</td><td></td></tr><tr><td>Cellules HaCaT</td><td>CLS</td><td>300493</td><td></td></tr><tr><td>Nunc Multidishes traités pour culture cellulaire 24 puits</td><td>Fisher Scientific</td><td>10604903</td><td></td></tr><tr><td>Nunc Multiplats traités pour culture cellulaire 48- Insert</td><td>Fisher Scientific</td><td>10644901</td><td></td></tr><tr><td>TC, pour plaques à 24 puits, PET, transparent</td><td>Sarstedt</td><td>83.3932.041</td><td>taille des pores : 0,4 & micro ; m</td></tr><tr><td>ThinCert Inserts de culture cellulaire, membrane translucide (PET)</td><td>Greiner</td><td>662640</td><td>taille des pores : 0,4 & micro ; </td></tr><tr><td>m<EQUIPMENT>EQUIPMENT</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>compteur EVOM avec baguettes&nbsp ;</td><td>World Precision Instruments (WPI) Allemagne, GMBH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Form 3B</td><td>FormLabs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Form Wash</td><td>FormLabs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Form Cure</td><td>FormLabs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isotemp General Purpose Deluxe Water Baths</td><td>Fisherbrand</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscope à fluorescence inversée Eclipse Ti</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscope à fluorescence inversée DMI6000 B</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hotte à flux laminaire Ninosafe, classe II</td><td>Labolutions</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Midi CO2&nbsp ; Incubateur, 40 L</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

membrane basale nanofibrillaire en soie d’araignée fonctionnalisée recombinante dans des inserts de culture tissulaire sur mesure

Nanofibrillar Basement Membrane Mimic Made of Recombinant Functionalized Spider Silk in Custom-Made Tissue Culture Inserts

Photographies représentatives des encarts Des photographies des inserts avant et après leur libération de la plate-forme d’impression sont illustrées aux figures 3A et B. La figure 3C montre l’image d’un insert fini dont le support a été retiré. Le résultat est un lot d’inserts imprimés en 3D, prêts pour la stérilisation et l’utilisation ultérieure.
Levage et manutention des membranes FN-silk Un schéma général de la formation de la membrane FN-soie et du levage manuel est illustré à la figure 1. Le résultat est un certain nombre d’inserts avec une membrane FN-silk attachée. Pour garantir le taux de réussite le plus élevé avec le levage des membranes intactes, les étapes décrites dans le protocole doivent être suivies avec précision. La figure 4 montre des photographies d’une membrane intacte (A, D) et après déchirure (B, E, F). La déchirure peut être visualisée à l’aide de la microscopie à fond clair (Figure 4E, F) et/ou par l’écoulement d’un liquide à travers la membrane (Figure 4B). Il est important de soulever et d’abaisser les inserts perpendiculairement à la membrane, pour s’assurer que la membrane adhère uniformément et s’étire sous les inserts. L’adhérence de la membrane peut être observée visuellement, comme le montre la figure 4A. Si l’insert est abaissé comme indiqué et que les niveaux de liquide sont maintenus comme indiqué à la figure 2, la membrane reste attachée à l’insert pendant de longues périodes de culture.
Ici, la fixation de la membrane à l’insert est validée en menant une expérience de perméation 15,16,17 sur des membranes qui avaient été conservées dans des conditions de culture cellulaire standard pendant 9 jours. En bref, lors de l’ajout d’une molécule fluorescente sur le dessus de la membrane et de la mesure du signal dans la solution en dessous, le profil de perméation des membranes de soie suit celui d’un insert de culture tissulaire disponible dans le commerce (Figure 4C), ne montrant aucune fuite sur 36 h de perméation et indiquant que la membrane reste à la fois intacte et attachée à l’insert. Des expériences similaires ont déjà été menées avec des cellules ensemencées sur l’un des15 ou les deux côtés de la membrane de soie17. La force de l’adhérence a déjà été démontrée à l’aide de la macro-indentation16 et des tests de gonflage 16,17. Dans le cadre des expériences de macro-indentation, un stylet a été utilisé pour étirer la membrane, qui s’est rompue sous une force de 1,4 mN, tout en restant attachée à l’insert16.
Il convient de noter que le taux de réussite du levage des membranes intactes est lié au matériau et au post-traitement des inserts. Avec ce protocole, 95 % des membranes soulevées à l’aide d’inserts imprimés avec la résine utilisée étaient appropriées pour l’ensemencement cellulaire, contre 74 % lorsqu’une résine comparable était utilisée à la place. Nous supposons que l’adhérence est favorisée par les interactions hydrophobes et les forces de van der Waals, et donc que la modification des propriétés du matériau modifie la force de l’adhérence. Ceci est également étayé par le fait que les membranes n’adhèrent pas bien aux matériaux hydrophiles (données non présentées).
Résultats représentatifs de la culture cellulaire sur les membranes FN-soie La figure 5 montre des images d’immunofluorescence de kératinocytes (HaCaT) cultivés sur la face apicale ou basale de la membrane. On a observé que les cellules adhérentes (Figure 5D.i) couvraient uniformément la zone de culture le jour 1 tout en acquérant la morphologie typique des galets kératinocytes (Figure 5A.i-B.i). Au jour 3, les kératinocytes avaient établi une couche confluente (Figure 5A.ii-B.ii) et formé un réseau de jonctions serrées (Figure 5D.ii), indiquant qu’ils assumaient des fonctions épithéliales physiologiques. Les niveaux élevés de viabilité cellulaire atteints dans les matrices de soie FN 15,17,23,24 ont également été mis en évidence dans la configuration de culture à insertion de membrane de soie décrite ici. Après 3 jours de culture, les kératinocytes sont restés très viables (Figure 5C.i-iv). De plus, aucune différence dans la distribution des cellules mortes n’a été observée entre le centre (Figure 5C.i-ii) et la périphérie de la membrane (Figure 5C.iii-iv), ne révélant aucun effet significatif du matériau d’insertion sur la viabilité de HaCaT. Dans l’ensemble, le système de culture à insert en soie offrait une viabilité kératinocytaire similaire (Figure 5i-ii, v-vi) sinon améliorée (Figure 5iii-iv, vii-viii) à celle d’un système commercial d’insertion à membrane en PET.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67116/67116fig01.jpg"> Figure 1 : Illustration détaillée de la formation et du soulèvement de membranes singulières en soie FN. (A) Remplissez un puits sur deux (évitez la rangée/colonne extérieure) dans une plaque de 48 puits avec une solution de protéine de soie FN où (B) elle s’auto-assemble en une membrane à l’interface liquide-air pendant la nuit. (C) Saisissez l’insert à l’aide d’une pince à épiler et abaissez-le lentement sur la membrane à l’aide des guides (D,E) sur l’insert imprimé en 3D pour vous assurer que l’insert est abaissé perpendiculairement à la membrane. Grossissement de l’adhérence de la membrane de soie montrant une section transversale de l’insert (F) juste au-dessus de la membrane et (G) lorsqu’il touche la membrane de soie. Au cours de la période d’incubation de 2 h, (H) la membrane de soie se fixe spontanément à l’insert, qui est ensuite (I) utilisé pour soulever la membrane de l’interface. Abréviations : FN = fibronectine ; PBS = solution saline tamponnée au phosphate. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67116/67116fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67116/67116fig02.jpg"> Figure 2 : Illustration détaillée montrant comment manipuler la membrane FN-soie après l’avoir soulevée de la plaque de formation. (A) L’insert (gris) avec la membrane (violette) directement après le levage. (B) Le liquide (bleu) est ajouté sur le côté apical de la membrane, qui est ensuite placé dans une plaque (C) à 24 puits où la partie la plus longue des bras d’insertion est suspendue aux parois, et la partie la plus courte maintient l’insert positionné au centre de la plaque. (D) Du liquide est ajouté dans le puits, en veillant à ce que le niveau de liquide soit équilibré et au-dessus du bord de la membrane. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67116/67116fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67116/67116fig03.jpg"> Figure 3 : Photographies des inserts imprimés en 3D. (A) Les inserts directement après avoir été retirés de l’imprimante 3D, toujours fixés à la plaque de construction. (B) Un insert après avoir été retiré de la plaque de construction, avant de casser les supports. (C) Un insert après que les supports ont été retirés. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67116/67116fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67116/67116fig04.jpg"> Figure 4 : Une membrane en soie FN avant et après la rupture. (A) Photographie d’une membrane intacte portant 200 μL de PBS teint (bleu) sur la face apicale. Le bord de la membrane enroulé autour de l’insert est indiqué par des flèches blanches. (B) Photographie de la même membrane après déchirure. Le PBS fuit à travers la membrane. (C) Graphique montrant la perméation d’une molécule fluorescente de 3 kDa pendant 36 h à travers une membrane de soie ou une membrane PET disponible dans le commerce et conservée dans des conditions de culture cellulaire standard pendant 9 jours. (D) Image en fond clair d’une membrane avant déchirure. (E) Image en fond clair de la même membrane après déchirure. La zone défectueuse est indiquée par le contour en pointillés bleus. (F) Vue agrandie de la déchirure représentée en D avec le bord de la membrane déchirée indiqué par des flèches bleues. Barres d’échelle = 1 mm (D,E), 200 μm (F). Abréviations : FN = fibronectine ; PBS = solution saline tamponnée au phosphate ; PET = poly(téréphtalate d’éthylène). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67116/67116fig04large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67116/67116fig05.jpg"> Figure 5 : Kératinocytes (HaCaT) cultivés sur la membrane de soie FN. Au jour 1, les kératinocytes ont adhéré et recouvert uniformément la surface de la membrane sur la face apicale (A.i) ou basale (B.i) (phalloïdine, verte). Au jour 3, une monocouche confluente s’établit sur le côté apical (A.ii) ou basal (B.ii) (phalloïdine, vert). (C) Évaluation de la viabilité cellulaire sur la membrane de soie (i-iv) par rapport à une membrane PET commerciale (v-viii) au centre (i, ii, v, vi) et à la périphérie (iii, iv, vii, viii) de la couche cellulaire. Les cellules vivantes sont indiquées en vert (i, iii, v, vii) et les cellules mortes en rouge (i, iii, v, vii) ou en blanc (ii, iv, vi, viii). La ligne pointillée marque l’interphase entre la membrane et l’insert. (D) Zoom en détail, (i) indiquant (flèches blanches) l’adhésion cellulaire à la membrane (phalloïdine, blanc) et (ii) un réseau de jonctions serrées formé après 3 jours de culture (ZO-1, blanc). Barres d’échelle = 1 mm (rangée du haut : A, B), 100 m (rangée du bas : A, B, Ci, ii, v, vi), 500 m (C iii, iv, vii, viii), 50 m (D). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67116/67116fig05large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
Tableau 1 : Vue d’ensemble des travaux antérieurs où des membranes ont été intégrées dans des inserts de culture cellulaire. Abréviations : PCL = polycaprolactone ; PEGDA = diacrylate de poly (éthylène glycol) ; PLGA = poly(acide lactique-co-glycolique) ; PDMS = Polydiméthylsiloxane ; PC = Polycarbonate ; RSS = Protéine de soie d’araignée recombinante ; PLCL = Poly(lactide-co-caprolactone) ; RHSIF = Protéines de filament intermédiaire de bave de myxine recombinante <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67116/67116_Table%20I.xlsx" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.</a>
Tableau 2 : Vue d’ensemble des travaux antérieurs résumant les différents types de cellules cultivées sur les membranes FN-soie. FN-4repCT (FN-silk) est une version courte de la soie de dragline d’Euprosthenops australis, qui est produite de manière recombinante et fonctionnalisée avec un motif RGD de la fibronectine au niveau génétique. Cette protéine est utilisée dans tous les cas résumés ici. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67116/67116_Table%20II.xlsx" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.</a>
Tableau 3 : Dépannage. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67116/67116_Talble%20III.xlsx" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.</a>
Dossier supplémentaire 1 : Fichier de conception (.stl) pour l’impression 3D des inserts. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67116/JoVe_Silk_Insert.zip" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>
Dossier supplémentaire 2 : Protocole d’impression, de post-traitement et de stérilisation lors de l’utilisation de l’imprimante et de la résine spécifiées dans la table des matériaux. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67116/67116_Supplemental%20File%202.zip" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>
Figure supplémentaire S1 : Schéma du motif suggéré pour le placement de la solution de soie FN dans la plaque à 48 puits. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67116/67116_Supplemental%20Fig%20S1.zip" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>

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