Name: Analyse spécifique des brins des protéines lors de brins d’ADN réplicatifs par enrichissement et séquençage de la méthode de l’ADN naissant associé aux protéines (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-05-02T12:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: Découvrez la méthode eSPAN pour analyser le recyclage des histones parentales lors de la réplication de l'ADN chez la levure et les cellules souches embryonnaires de souris. Cette approche révèle les mécanismes de l'héritage épigénétique.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ce travail a été soutenu par des subventions des National Institutes of Health R35GM118015 (Z.Z.), R01GM130588 (C.Y.) et le Hormel Startup Fund (C.Y.).

<ol><li>Bell, S. P., Stillman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATP-dependent+recognition+of+eukaryotic+origins+of+DNA+replication+by+a+multiprotein+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">ATP-dependent recognition of eukaryotic origins of DNA replication by a multiprotein complex.</a> Nature. 357 (6374), 128-134 (1992).</li>
<li>Fragkos, M., Ganier, O., Coulombe, P., Mechali, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+replication+origin+activation+in+space+and+time%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">DNA replication origin activation in space and time.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (6), 360-374 (2015).</li>
<li>Burgers, P. M. J., Kunkel, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eukaryotic+DNA+replication+fork%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Eukaryotic DNA replication fork.</a> Annu Rev Biochem. 86, 417-438 (2017).</li>
<li>Pursell, Z. F., Isoz, I., Lundstrom, E. B., Johansson, E., Kunkel, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+DNA+polymerase+epsilon+participates+in+leading-strand+DNA+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Yeast DNA polymerase epsilon participates in leading-strand DNA replication.</a> Science. 317 (5834), 127-130 (2007).</li>
<li>Nick Mcelhinny, S. A., Gordenin, D. A., Stith, C. M., Burgers, P. M., Kunkel, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Division+of+labor+at+the+eukaryotic+replication+fork%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Division of labor at the eukaryotic replication fork.</a> Mol Cell. 30 (2), 137-144 (2008).</li>
<li>Daigaku, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+global+profile+of+replicative+polymerase+usage%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">A global profile of replicative polymerase usage.</a> Nat Struct Mol Biol. 22 (3), 192-198 (2015).</li>
<li>Koyanagi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+landscape+of+replicative+DNA+polymerase+usage+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Global landscape of replicative DNA polymerase usage in the human genome.</a> Nat Commun. 13 (1), 7221(2022).</li>
<li>Clausen, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+replication+enzymology+in+vivo+by+genome-wide+mapping+of+ribonucleotide+incorporation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Tracking replication enzymology in vivo by genome-wide mapping of ribonucleotide incorporation.</a> Nat Struct Mol Biol. 22 (3), 185-191 (2015).</li>
<li>Reijns, M. aM., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lagging-strand+replication+shapes+the+mutational+landscape+of+the+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Lagging-strand replication shapes the mutational landscape of the genome.</a> Nature. 518 (7540), 502-506 (2015).</li>
<li>Koh, K. D., Balachander, S., Hesselberth, J. R., Storici, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribose-seq%3A+Global+mapping+of+ribonucleotides+embedded+in+genomic+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Ribose-seq: Global mapping of ribonucleotides embedded in genomic DNA.</a> Nat Methods. 12 (3), 253 p following 257 251-257 (2015).</li>
<li>Stillman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+polymerases+at+the+replication+fork+in+eukaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">DNA polymerases at the replication fork in eukaryotes.</a> Mol Cell. 30 (3), 259-260 (2008).</li>
<li>Zhou, Z. X., Lujan, S. A., Burkholder, A. B., Garbacz, M. A., Kunkel, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+for+DNA+polymerase+delta+in+initiating+and+terminating+leading+strand+DNA+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Roles for DNA polymerase delta in initiating and terminating leading strand DNA replication.</a> Nat Commun. 10 (1), 3992(2019).</li>
<li>Yu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strand-specific+analysis+shows+protein+binding+at+replication+forks+and+PCNA+unloading+from+lagging+strands+when+forks+stall%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Strand-specific analysis shows protein binding at replication forks and PCNA unloading from lagging strands when forks stall.</a> Mol Cell. 56 (4), 551-563 (2014).</li>
<li>Gan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mcm2-ctf4-polalpha+axis+facilitates+parental+histone+h3-h4+transfer+to+lagging+strands%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">The mcm2-ctf4-polalpha axis facilitates parental histone h3-h4 transfer to lagging strands.</a> Mol Cell. 72 (1), 140-151.e3 (2018).</li>
<li>Yu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mechanism+for+preventing+asymmetric+histone+segregation+onto+replicating+DNA+strands%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A mechanism for preventing asymmetric histone segregation onto replicating DNA strands.</a> Science. 361 (6409), 1386-1389 (2018).</li>
<li>Petryk, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mcm2+promotes+symmetric+inheritance+of+modified+histones+during+DNA+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Mcm2 promotes symmetric inheritance of modified histones during DNA replication.</a> Science. 361 (6409), 1389-1392 (2018).</li>
<li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+polymerase+alpha+interacts+with+H3-H4+and+facilitates+the+transfer+of+parental+histones+to+lagging+strands%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Adv%22%5BJournal%5D)">DNA polymerase alpha interacts with H3-H4 and facilitates the transfer of parental histones to lagging strands.</a> Sci Adv. 6 (35), eabb5820(2020).</li>
<li>Solomon, M. J., Larsen, P. L., Varshavsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+protein-DNA+interactions+in+vivo+with+formaldehyde%3A+Evidence+that+histone+h4+is+retained+on+a+highly+transcribed+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mapping protein-DNA interactions in vivo with formaldehyde: Evidence that histone h4 is retained on a highly transcribed gene.</a> Cell. 53 (6), 937-947 (1988).</li>
<li>Kaya-Okur, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cut%26tag+for+efficient+epigenomic+profiling+of+small+samples+and+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Cut&tag for efficient epigenomic profiling of small samples and single cells.</a> Nat Commun. 10 (1), 1930(1930).</li>
<li>Lengronne, A., Pasero, P., Bensimon, A., Schwob, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+S+phase+progression+globally+and+locally+using+brdu+incorporation+in+tk%28%2B%29+yeast+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Monitoring S phase progression globally and locally using brdu incorporation in tk(+) yeast strains.</a> Nucleic Acids Res. 29 (7), 1433-1442 (2001).</li>
<li>Viggiani, C. J., Aparicio, O. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+vectors+for+simplified+construction+of+brdu-incorporating+strains+of+saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">New vectors for simplified construction of brdu-incorporating strains of saccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 23 (14-15), 1045-1051 (2006).</li>
<li>Yu, C., Gan, H., Zhang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strand-specific+analysis+of+DNA+synthesis+and+proteins+association+with+DNA+replication+forks+in+budding+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Strand-specific analysis of DNA synthesis and proteins association with DNA replication forks in budding yeast.</a> Methods Mol Biol. 1672, 227-238 (2018).</li>
<li>Li, Z., Hua, X., Serra-Cardona, A., Xu, X., Zhang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+and+strand-specific+profiling+of+replicating+chromatin+with+enrichment+and+sequencing+of+protein-associated+nascent+DNA+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Efficient and strand-specific profiling of replicating chromatin with enrichment and sequencing of protein-associated nascent DNA in mammalian cells.</a> Nat Protoc. 16 (5), 2698-2721 (2021).</li>
<li>Rosebrock, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+budding+yeast+cell+cycle+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Analysis of the budding yeast cell cycle by flow cytometry.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2017 (1), (2017).</li>
<li>Brogaard, K., Xi, L., Wang, J. P., Widom, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+map+of+nucleosome+positions+in+yeast+at+base-pair+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A map of nucleosome positions in yeast at base-pair resolution.</a> Nature. 486 (7404), 496-501 (2012).</li>
<li>Petryk, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+landscape+of+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Replication landscape of the human genome.</a> Nat Commun. 7, 10208(2016).</li>
<li>Foltman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eukaryotic+replisome+components+cooperate+to+process+histones+during+chromosome+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Eukaryotic replisome components cooperate to process histones during chromosome replication.</a> Cell Rep. 3 (3), 892-904 (2013).</li>
<li>Jia, J., Yu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+MCM2-7+helicase+subunit+MCM2+in+epigenetic+inheritance%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">The role of the MCM2-7 helicase subunit MCM2 in epigenetic inheritance.</a> Biology (Basel). 13 (8), 572(2024).</li>
<li>Alabert, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nascent+chromatin+capture+proteomics+determines+chromatin+dynamics+during+DNA+replication+and+identifies+unknown+fork+components%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Nascent chromatin capture proteomics determines chromatin dynamics during DNA replication and identifies unknown fork components.</a> Nat Cell Biol. 16 (3), 281-293 (2014).</li>
<li>Sirbu, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+protein+dynamics+at+active%2C+stalled%2C+and+collapsed+replication+forks%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Analysis of protein dynamics at active, stalled, and collapsed replication forks.</a> Genes Dev. 25 (12), 1320-1327 (2011).</li>
<li>Zardoni, L., Nardini, E., Liberi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2d+gel+electrophoresis+to+detect+DNA+replication+and+recombination+intermediates+in+budding+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">2d gel electrophoresis to detect DNA replication and recombination intermediates in budding yeast.</a> Methods Mol Biol. 2119, 43-59 (2020).</li>
<li>Ramachandran, S., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mince-seq%3A+Mapping+in+vivo+nascent+chromatin+with+edu+and+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Mince-seq: Mapping in vivo nascent chromatin with edu and sequencing.</a> Methods Mol Biol. 1832, 159-168 (2018).</li>
<li>Petryk, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+and+sister+chromatid-resolved+profiling+of+protein+occupancy+in+replicated+chromatin+with+CHOR-seq+and+SCAR-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Genome-wide and sister chromatid-resolved profiling of protein occupancy in replicated chromatin with CHOR-seq and SCAR-seq.</a> Nat Protoc. 16 (9), 4446-4493 (2021).</li>
<li>Zhong, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+nanogram-range+immunoprecipitated+DNA+in+chip-seq+application%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Purification of nanogram-range immunoprecipitated DNA in chip-seq application.</a> BMC Genomics. 18 (1), 985(2017).</li>
<li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asymmetric+distribution+of+parental+h3k9me3+in+s+phase+silences+l1+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Asymmetric distribution of parental h3k9me3 in s phase silences l1 elements.</a> Nature. 623 (7987), 643-651 (2023).</li>
<li>Kanev, P. B., Atemin, A., Stoynov, S., Aleksandrov, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parp1+roles+in+DNA+repair+and+DNA+replication%3A+The+basi%28c%29s+of+parp+inhibitor+efficacy+and+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Parp1 roles in DNA repair and DNA replication: The basi(c)s of parp inhibitor efficacy and resistance.</a> Semin Oncol. 51 (1-2), 2-18 (2023).</li>
<li>Hanzlikova, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+importance+of+poly%28adp-ribose%29+polymerase+as+a+sensor+of+unligated+Okazaki+fragments+during+DNA+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">The importance of poly(adp-ribose) polymerase as a sensor of unligated Okazaki fragments during DNA replication.</a> Mol Cell. 71 (2), 319-331.e3 (2018).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

La détection des protéines associées aux brins de réplication avancés et en retard est importante pour comprendre les mécanismes de réplication de la chromatine et le processus associé, qui sont directement pertinents pour la recherche sur le cancer humain et les mécanismes de résistance aux médicaments. Plusieurs méthodes, telles que le gel 2D, l’immunoprécipitation native de la chromatine (nChIP), l’iPOND et la capture naissantede la chromatine 29,30,31, ont été employées pour étudier la réplica...

Chez les organismes eucaryotes, la duplication du génome est initiée à partir de plusieurs sites appelés origines de réplication, où le complexe de reconnaissance des origines (ORC) se lie et initie la machinerie protéique de recrutement, y compris l’hélicase CMG, pour initier la réplication del’ADN 1. La machine à réplisomes à chaque origine de réplication forme deux fourches de réplication qui se déplacentbidirectionnellement 2,3. Les fourches de réplication jumelles répliquent les deux brins parents d’ADN par la synthèse continue du brin principal et la synthèse discontinue du brin retardatif. Étant donné cette nature asymétrique de chaque fourche de réplication, les composants de réplication, y compris les ADN polymérases sur les brins avant et en retard, sont différents. Des analyses génétiques antérieures basées sur des ADN polymérases mutantes montrent que la ε de l’ADN Pol et la δ de l’ADN Pol sont les principales polymérases responsables respectivement de la réplication des brinages de retard et de retard, 4,5. Plusieurs méthodes ont été développées pour détecter la préférence de brin de la polymérase d'ADN, notamment Pu-seq 6,7, HydEn-seq8, et emRiboSeq ou RiboSeq 9,10. Ces méthodes génétiques pour disséquer la spécificité du brin se limitent aux ADN polymérases et nécessitent d’introduire des mutations sur chaqueprotéine 4,5,11,12. Suivre l’association de toute protéine cible avec les brins avancés et retardés des fourches de réplication de l’ADN fournira des informations précieuses sur la réplication de l’ADN. Dans ce domaine, nous avons d’abord développé la technique eSPAN (enrichissement et séquençage de l’ADN naissant associé à une protéine, Figure 1) dans des cellules de levure. En tant qu’étude de preuve de principe, nous avons d’abord montré que les δ Pol et Pol δ sont enrichies respectivement sur les brins avant et en retard. Nous avons également découvert la préférence de brin pour les composants clés de la réplication de l’ADN, notamment l’hélicase réplicative de l’ADN, la protéine de liaison à l’ADN simple brin (protéine de réplication A), ainsi que la lampe à antigène nucléaire cellulaire proliférant (PCNA) ainsi que son facteur de réplication chargeur C (RFC)13. Il est important de noter que nous et d’autres avons utilisé cette méthode pour découvrir les mécanismes du transfert parental des histones, un processus qui a été intractable pendant plus de 4 décennies14, 15, 16, 17.
La méthode eSPAN comprend deux étapes séquentielles : l’enrichissement de la protéine cible par ChIP18 ou CUT&Tag 19 et l’enrichissement de l’ADN naissant associé à la protéine par immunoprécipitation BrdU. Dans une souche de levure standard (W303 ou S288C), les BrdU ou EdU extracellulaires ne peuvent pas pénétrer dans les cellules ni s’incorporer dans les chromosomes. Ces souches manquent d’un transporteur nucléoside approprié pour l’absorption de la thymidine ainsi que de la thymidine kinase nécessaire pour phosphoryler la thymidine en TMP, qui convertit BrdU (ou EdU) en BrdUMP (EdUMP). L’expression du transporteur nucléoside équilibré humain 1 (hENT1) et du virus de l’herpès simplex thymidine kinase (HSV-TK) augmente l’absorption de thymidine et la conversion de BrdU (ou EdU) en BrdUMP (EdUMP)20. Par conséquent, pour réaliser l’expérience eSPAN sur la levure, les souches devaient être insérées avec une structure BrdU-Incorporant (BrdU-Inc) (HSV-TK et hENT1)13,21.
Auparavant, nous fournissions le protocole eSPAN pour les protéines de réplication de l’ADN chez lalevure 22. Récemment, nous avons intégré la méthode CUT&Tag au protocole eSPAN dans les cellules de mammifères afin de traiter des étapes techniquement complexes nécessitant une optimisation, telles que la réticulation, le cisaillement de la chromatine, et pour minimiser le nombre de cellules de départ17,23. Ici, nous avons fourni l’eSPAN des histones pour la visualisation à l’aide de cellules de levure (Figure 2). Cette méthode est principalement utilisée pour analyser la distribution de formes modifiées d’histones sur les brins d’ADN en réplication. Bien que nous ayons testé plusieurs marques d’histones, nous avons utilisé H3K4me3, une marque sur l’histone parentale H3, comme exemple. Pour analyser les composants et facteurs réplicotiques impliqués dans la réparation de l’ADN aux fourches de réplication, nous recommandons de cisailler la chromatine en petits fragments par sonication, comme décrit dans notre première publication22. Pour les cellules de mammifères, nous avons adopté les procédures modifiées Cut&Tag pour remplacer l’étape ChIP décrite dans lalevure 23. Cette modification réduit la quantité de matière de départ (cellules) et, surtout, permet la génération de bibliothèques eSPAN pour le séquençage sans recourir à des kits de préparation d’ADN simple brin. Pour le protocole de levure, nous avons choisi de ne pas utiliser la méthode Cut&Tag car la quantité de matière de départ était suffisante. Plus important encore, nous avons constaté que les procédures Cut&Tag n’étaient pas systématiquement efficaces pour les cellules de levure dans nos mains.

<table><tbody><tr><td>0,5 M EDTA, pH 8,0</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15575020</td><td></td></tr><tr><td>1,5 mL de tubes à faible liaison d’ADN &nbsp ;</td><td>Eppendorf</td><td>22431021</td><td></td></tr><tr><td>Tampon Ampligase 10x</td><td>Lucigen</td><td>A1905B</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS & nbsp ;</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>10x TBS</td><td>BioRad</td><td>1706435</td><td></td></tr><tr><td>16 G x 1-1/2 in. BD PrécisionAiguille glissante</td><td>BD Biosciences</td><td>305198</td><td></td></tr><tr><td>KIT DE BIBLIOTHÈQUE ACCEL-NGS 1S PLUS ADN</td><td>Technologies ADN intégrées</td><td>10009817</td><td>kit de préparation de la bibliothèque d’ADN ssDNA et à faible entrée &nbsp ;</td></tr><tr><td>Bioanalyseur Agilent 2100 &nbsp ;</td><td>Agilent</td><td>Bioanalyse 2100</td><td></td></tr><tr><td>Kit Agilent DNA 1000 &nbsp ;</td><td>Agilent</td><td>5607-1504</td><td></td></tr><tr><td>Ampligase&nbsp ;</td><td>Lucigen</td><td>A0110K</td><td>Manipulez le paraformol avec précaution, il est inflammable, solide et dangereux.</td></tr><tr><td>AMPure XP</td><td>Beckman</td><td>A63881</td><td></td></tr><tr><td>Réactif SPRI XP AMPure</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63882</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps anti-BrdU &nbsp ;</td><td>BD Biosciences</td><td>555627</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps anti-H3K4me3 & nbsp ;</td><td>Abcam</td><td>ab8580</td><td></td></tr><tr><td>Compteur de cellules automatisé&nbsp ;, modèle TC10</td><td>BioRad</td><td>145-0001</td><td></td></tr><tr><td>Bacitracine &nbsp ;</td><td>Sigma</td><td>11702</td><td></td></tr><tr><td>Bacto peptone&nbsp ;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>211830</td><td></td></tr><tr><td>Chlorhydrate de benzamidine &nbsp ;</td><td>Sigma</td><td>B2417</td><td>Solides combustibles</td></tr><tr><td>BrdU&nbsp ;</td><td>Sigma</td><td>B5002</td><td>Manipulez le BrdU avec précaution, car il s’agit d’un mutagène et d’un tératogène potentiel.</td></tr><tr><td>BSA</td><td>New England Biolabs</td><td>B9000S</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>C4901</td><td></td></tr><tr><td>Incubateur de cultures cellulaires & nbsp ;</td><td>Thermo Fisher Scientific & nbsp ; Incubateur de CO2 à chemise d’eau modèle Forma série II</td><td>3140</td><td></td></tr><tr><td>Milieu de culture cellulaire & nbsp ;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lignée cellulaire ES-E14&nbsp ;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chelex-100&nbsp ;</td><td>BioRad</td><td>1422842</td><td>200&ndash ; Taille 400 en maille sèche</td></tr><tr><td>Chloroforme&nbsp ;</td><td>Sigma</td><td>366919</td><td></td></tr><tr><td>Billes magnétiques recouvertes de concanavaline A (ConA) &nbsp ;</td><td>Polysciences</td><td>86057-10</td><td></td></tr><tr><td>Digitonin</td><td>Millipore</td><td>300410-5MG</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>E. coli&nbsp ; ARNt & nbsp ;</td><td>Sigma</td><td>10109541001</td><td></td></tr><tr><td>Éthanol & nbsp ;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP2818100</td><td>Manipulez l’éthanol avec précaution, il est inflammable</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>Glycérol &nbsp ;</td><td>Sigma</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>HCl&nbsp ;</td><td>Sigma</td><td>H1758</td><td></td></tr><tr><td>HEPES&nbsp ;</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol&nbsp ;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP26324</td><td>Manipulez l’isopromoteur avec précaution, il est inflammable</td></tr><tr><td>KAPA HiFi HotStart Ready Mix</td><td>Roche</td><td>7958889001</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>sigma</td><td>221473</td><td>Manipulez le KOH avec précaution, c’est corrosif</td></tr><tr><td>Vide à basse vitesse</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stand magnétique &nbsp ;</td><td>Millipore</td><td>LSKMAGS08</td><td></td></tr><tr><td>Mastercycler Gradient PCR Thermal Cycler</td><td>Eppendorf</td><td>5331</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>Nucléase microcoque &nbsp ; (MNase)</td><td>Worthington</td><td>LS004798</td><td></td></tr><tr><td>Kit de purification PCR MinElute & nbsp ;</td><td>Qiagen</td><td>28006</td><td></td></tr><tr><td>Batteur à mini-perles</td><td>Mini BeadBeater 24 Disrupteur</td><td>607</td><td></td></tr><tr><td>Mini-centrifugeuse & nbsp ;</td><td>Eppendorf</td><td>5424R</td><td></td></tr><tr><td>MnCl2</td><td>Sigma</td><td>244589</td><td></td></tr><tr><td>Vibrateur multiplateforme</td><td>Fisherbrand</td><td>02-217-765</td><td></td></tr><tr><td>Incubateur à vibrateurs multiplateformes</td><td>Référence</td><td>INCU-SHAKER 10L</td><td></td></tr><tr><td>Bloc thermique multithermique & nbsp ;</td><td>Eppendorf</td><td>Thermomélangeur C</td><td></td></tr><tr><td>N-[Tris(hydroxyméthyl)méthyl]-3-acide aminopropanesulfonique &nbsp ; (TAPOTEMENTS)</td><td>Sigma</td><td>T5130</td><td>200&ndash ; Taille 400 en maille sèche</td></tr><tr><td>NaCl&nbsp ;</td><td>Sigma</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>NaOH&nbsp ;</td><td>Sigma</td><td>S8045</td><td>Manipulez le NaOH avec précaution, il est corrosif</td></tr><tr><td>NEBNext HiFi 2 fois ; Mix maître PCR</td><td>New England Biolabs</td><td>M0541</td><td></td></tr><tr><td>NP-40 Igepal CA-630</td><td>Thermo Scientific</td><td>J61055. AP</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldhyde</td><td>sigma</td><td>158127</td><td>Manipulez le paraformol avec précaution, il est inflammable, solide et dangereux.</td></tr><tr><td>enzyme pA-Tn5 &nbsp ;</td><td>Addgene</td><td>121137</td><td></td></tr><tr><td>Pefabloc</td><td>Sigma</td><td>11429868001</td><td></td></tr><tr><td>Phénol-chloroforme-isoamyle alcool & nbsp ;</td><td>Invitrogen</td><td>15593049</td><td></td></tr><tr><td>Pipette P1000, P200, P20 et P2</td><td>Eppendorf</td><td>2231300004</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Sigma</td><td>10837091001</td><td></td></tr><tr><td>Comprimé cocktail inhibiteur de protéase</td><td>Sigma</td><td>S8830</td><td></td></tr><tr><td>Comprimé cocktail inhibiteur de protéase &nbsp ;</td><td>Sigma</td><td>S8830</td><td></td></tr><tr><td>Protéines G-perles de sépharose &nbsp ;</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0618-02</td><td></td></tr><tr><td>Solution de précipitation des protéines</td><td>Qiagen</td><td>848023</td><td></td></tr><tr><td>Solution de précipitation des protéines</td><td>Qiagen</td><td>848023</td><td>Manipulez le KOH avec précaution, c’est corrosif</td></tr><tr><td>Solution de précipitation des protéines &nbsp ;</td><td>Qiagen</td><td>848023</td><td></td></tr><tr><td>Protéinase K&nbsp ;</td><td>Sigma</td><td>311584401</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick kit de purification PCR &nbsp ;</td><td>Qiagen</td><td>28106</td><td></td></tr><tr><td>RNase A</td><td>Sigma</td><td>10109169001</td><td></td></tr><tr><td>SDS&nbsp ;</td><td>Sigma</td><td>L3771</td><td></td></tr><tr><td>Spectrophotomètre & nbsp ;</td><td>Thermo Scientific.</td><td>2000/2000c</td><td></td></tr><tr><td>Spermidine&nbsp ;</td><td>Sigma</td><td>S2626</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Pol</td><td>New England Biolabs, &nbsp ;</td><td>M0203</td><td></td></tr><tr><td>centrifugeuse de table &nbsp ;</td><td>Beckman Coulter</td><td>Allegra X-5</td><td></td></tr><tr><td>Tris&nbsp ;</td><td>Sigma</td><td>11814273001</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100 & nbsp ;</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>extrait de levure & nbsp ;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>212730</td><td></td></tr></tbody></table>

analyse spécifique des brins des protéines lors de brins d’adn réplicatifs par enrichissement et séquençage de la méthode de l’adn naissant associé aux protéines

Strand-Specific Analysis of Proteins at Replicating DNA Strands by Enrichment and Sequencing of Protein-Associated Nascent DNA Method

La duplication du génome est orchestrée par des protéines réplicantes, y compris les hélicases, qui déroulent l’ADN double brin en brins simples antiparallèles individuels, chacun nécessitant des modes de réplication distincts : continu (avant) et discontinu (retard). Comprendre les interactions des protéines associées à la chromatine avec les brins d’ADN réplicatifs in vivo est crucial pour élucider les mécanismes d’assemblage de la chromatine et de réparation de l’ADN couplés à la réplication de l’ADN. Ce protocole présente la méthode d’enrichissement et de séquençage de l’ADN naissant associé aux protéines (eSPAN), conçue pour quantifier les niveaux relatifs de protéines sur les brins d’ADN naissants et en retard aux fourches de réplication. La procédure eSPAN commence par l’immunoprécipitation de la chromatine (ChIP, chez la levure) ou clivage sous cibles et la marquage (CUT&Tag ; dans les cellules de mammifères) d’une protéine d’intérêt, suivie d’un enrichissement de l’ADN naissant associé à une protéine par immunoprécipitation par bromodéeoxyuridine (BrdU). Un séquençage de nouvelle génération spécifique au brin est appliqué à l’ADN isolé du ssDNA. Cette technique peut être utilisée pour déterminer si une protéine est enrichie aux fourches de réplication avant ou en retard. L’eSPAN fournit la préférence de brin génomique pour les protéines associées à la chromatine, y compris les histones aux fourches de réplication.

eSPAN peut être utilisé pour acquérir des informations spécifiques au brin concernant une protéine cible, telle que les histones et les modifications des histones. Dans ce résultat représentatif, la collecte d’échantillons et les processus eSPAN ont été réalisés en suivant le schéma décrit à la Figure 2 en utilisant le système de levure bourgeonnante. Le traitement et la collecte de l’échantillon suivent la condition précoce de phase S traitée par hydroxyurée selon ce protocole. Deux souches...

L’enrichissement et le séquençage de l’ADN naissant associé aux protéines (eSPAN) ont été développés pour détecter l’abondance relative d’une protéine associée à la chromatine sur deux brins d’ADN réplicatifs, révélant ainsi une compréhension moléculaire de la réplication de la chromatine et de ses processus couplés. Ce protocole décrit les procédures eSPAN chez les cellules souches embryonnaires (ES) de levure et de souris.

Analyse spécifique des brins des protéines lors de brins d’ADN réplicatifs par enrichissement et séquençage de la méthode de l’ADN naissant associé aux protéines

Genome duplication is orchestrated by replisome proteins, including helicases, which unwind double-stranded DNA into individual antiparallel single ...

strand-specific-analysis-proteins-at-replicating-dna-strands

Research

Recherche

JoVE Journal

Biology

Biologie

Nous décrivons une méthode pour l'observation de la réplication en temps réel des molécules individuelles d'ADN médiée par les protéines du système de réplication des bactériophages.

Observation directe d&#39;ADN Enzymes réplication via un ADN simple molécule Stretching Assay

l’enrichissement de l’ADNg pour le séquençage NGS est un outil simple et puissant pour l’étude des mutations constitutionnelles. Dans cet article, nous présentons la procédure pour analyser simplement la séquence complète de 11 gènes impliqués dans la réparation des dommages à l’ADN.

ADNg enrichissement par une technologie basée Transposase-NGS Analyse de la séquence plénier de BRCA1, BRCA2, et 9 gènes impliqués dans la réparation des dommages de l'ADN

Dans ce protocole, nous décrivons une nouvelle technique BrdU-ChIP-Slot-Western pour examiner les protéines et les modifications d’histones associées à l’ADN nouvellement synthétisé ou naissant.

Examen des protéines liées à Nascent ADN dans les cellules de mammifères utilisant la technique BrdU-Chip-Slot-Ouest

Nous décrivons ici un système utilisant un bloc protéique in vivo réversible spécifique au site pour bloquer et effondrer les fourches de réplication chez Escherichia coli. L’établissement du bloc de réplication est évalué par microscopie à fluorescence et l’électrophorèse sur gel d’agarose neutre-neutre est utilisée pour visualiser les intermédiaires de réplication.

Induire un blocage du site de réplication spécifique dans<i&gt; E. coli</i&gt; Utilisation d&#39;un système fluorescent répresseur opérateur

Nous décrivons une technique permettant de combiner la cytométrie en flux et le séquençage à haut débit pour identifier des régions fin de réplication du génome.

G2-seq : Une haut débit basée sur le séquençage Technique d’identification tard reproduisant des régions du génome

Une méthode non marqué, non-radio-isotopiques pour la relecture de l’ADN polymérase et un test de réparation de l’ADN a été développée à l’aide de haute résolution spectrométrie de masse MALDI-TOF et une stratégie d’extension de nucléotide. Le test s’est avéré être très précis, simple, rapide et facile à réaliser pour la relecture et réparer les correctifs inférieure à 9-nucléotides.

Correction d’épreuves et de test de réparation d’ADN en utilisant l’analyse de spectrométrie de masse MALDI-TOF et de nucléotide simple Extension

Les expériences de microréseau de liaison protéique (PBM) combinées à des essais biochimiques relient les propriétés de liaison et catalytiques de la primase de l'ADN, une enzyme qui synthétise les amorces d'ARN sur l'ADN modèle. Cette méthode, désignée comme profilage primase à haut débit (HTPP), peut être utilisée pour révéler les modèles de liaison de l'ADN d'une variété d'enzymes.

Reconnaissance de séquence d'ADN par primase d'ADN utilisant le profilage primase à haut débit

L’interaction d’un remodeleur de chromatine dépendant de l’ATP avec un ligand d’ADN est décrite à l’aide de la spectroscopie CD. Les changements conformationnels induits sur un promoteur de gène analysés par les pics générés peuvent être utilisés pour comprendre le mécanisme de régulation transcriptionnelle.

Spectroscopie CD pour étudier les interactions ADN-protéine

Cet article fournit une procédure pour la purification d’affinité d’une protéine recombinante humaine, l’endonucléase de lambeau 1 (FEN1), qui a été marquée avec un marqueur 6X-histidine. Le protocole implique l’utilisation de deux colonnes d’ions métalliques immobilisées distinctes pour la purification de la protéine marquée.

Purification d’affinité d’une protéine marquée 6X-His à l’aide d’un système de chromatographie liquide à protéines rapides 

Ici, nous décrivons la procédure d’analyse de la progression de la réplication à travers des répétitions pathogènes et sujettes à la structure à l’aide de l’électrophorèse sur gel bidimensionnelle.

Analyse électrophorétique de la réplication à travers des répétitions d’ADN à structure variable dans l’épisome humain basé sur SV40

Découvrez la méthode eSPAN pour analyser le recyclage des histones parentales lors de la réplication de l'ADN chez la levure et les cellules souches embryonnaires de souris. Cette approche révèle les mécanismes de l'héritage épigénétique.

Analyse spécifique des brins des protéines lors de brins d’ADN réplicatifs par enrichissement et séquençage de la méthode de l’ADN naissant associé aux protéines (Vidéo) | JoVE Journal

Analyse spécifique des brins des protéines lors de brins d’ADN réplicatifs par enrichissement et séquençage de la méthode de l’ADN naissant associé aux protéines

Explorer plus de vidéos