Analyse spécifique des brins des protéines lors de brins d’ADN réplicatifs par enrichissement et séquençage de la méthode de l’ADN naissant associé aux protéines

Nos recherches portent sur le mécanisme de l’hérédité épigénétique. Plus précisément, la réplication de l’ADN couplait le processus de recyclage des histones parentaux, qui représente la première étape d’émission de l’héritage épigénétique. Il a été identifié que le dépôt multiple d’histones parentaux, qui sont impliqués dans la réplication de l’ADN, joue un rôle important dans le recyclage des histones parentaux.

Il s’agit notamment du complexe hélicase D, de l’ADN polymérase et du complexe de réplication pour la protection. Les approches génétiques et biochimiques traditionnelles ont été des valeurs utilisées dans ce domaine de recherche. Traditionnellement, des méthodes de séquençage à haut débit sont utilisées pour comprendre le processus de transfert d’histones parentaux.

Avant que l’enrichissement et le séquençage de l’ADN associé aux protéines, ou la méthode expérimentale ne soient développés, il était difficile d’étudier le processus de transfert d’histones parentaux. La méthode expérimentale a fourni un outil puissant pour répondre à ces questions fondamentales. Pour commencer, limez les granulés de cellules de levure et remettez-les en suspension par un léger vortex.

Ensuite, lavez-le avec 0,4 millilitre de tampon de lyse CHIP contenant des inhibiteurs de protéase et un mélange d’antibiotiques pour éviter la contamination bactérienne. Centrifugez le mélange à 5 000 G pendant une minute. Ensuite, ajoutez 0,1 millilitre de tampon de lyse CHIP avec inhibiteurs de protéase et mélange d’antibiotiques à la pastille.

Suivi d’environ 100 microlitres de perles de verre de 0,5 millimètre. Lyser les cellules par bourrelet pendant trois cycles dans une chambre froide à quatre degrés Celsius. À l’aide d’une aiguille chaude de calibre 16, percez des trous dans le fond du tube.

Prélevez le lysat en emboîtant le tube perforé dans un tube d’ADN vide de 1,5 millilitre à faible liaison, puis centrifugez-le à 1 600 g pendant deux minutes à température ambiante. Aspirez soigneusement le surnageant sans déranger la pastille. La fraction de débris cellulaires contiendra la chromatine.

Remettez les granules cellulaires en suspension en pipetant 0,35 millilitre de nucléase Micrococcique supplémentée, ou tampon de digestion MNase. Ensuite, ajoutez 10 unités de MNase à la suspension. Mélangez doucement en inversant quatre à six fois et incubez dans un bain-marie à 37 degrés Celsius pendant 20 minutes.

Ralentissez la digestion de la MNase en ajoutant cinq microlitres d’EDTA de 0,5 molaire à une concentration finale de 10 millimolaires. Mélangez doucement par inversion et placez le tube sur de la glace pendant au moins 30 minutes. À l’aide de microtubes Bioruptor de 1,5 millilitre, sonicez le mélange réactionnel à haute puissance pendant trois minutes avec des cycles de marche de 30 secondes et de 30 secondes d’arrêt.

Ensuite, centrifuger à 10 000 G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Transférez le surnageant dans de nouveaux tubes et centrifugez-le à nouveau à 10 000 G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Ensuite, collectez environ 400 microlitres de surnageant.

Conservez 30 microlitres comme ADN d’entrée pour l’extraction de l’ADN et congelez-le à moins 20 degrés Celsius. Utilisez les 370 microlitres restants de lysat cellulaire pour l’immunoprécipitation de l’histone chromatine. Pour commencer, faites bouillir environ 150 microlitres des échantillons d’entrée et de H3K4me3 CHIP précédemment obtenus sur un bloc de chaleur à 100 degrés Celsius Pendant cinq minutes, refroidissez immédiatement l’échantillon sur de la glace pendant cinq minutes.

Ensuite, ajoutez la quantité requise des composants mentionnés à l’échantillon. Faites muter l’échantillon pendant deux heures sur un rotor à quatre degrés Celsius et 10 tr/min. Transférez le mélange dans un tube de 1,5 millilitre contenant 20 microlitres de billes de sépharose de protéine G lavées.

Faites muter le mélange pendant une heure à quatre degrés Celsius sur le rotor à 10 tr/min. Faites tourner les tubes à température ambiante à 800 G pendant une minute. Lavez les billes trois fois avec un millilitre de Bromo-désoxyuridine froide, ou tampon d’immunoprécipitation BrdU, en tournant pendant trois minutes pour chaque lavage.

Centrifugez à nouveau le tube et lavez-le avec un millilitre de tampon TE pendant trois minutes. Faites tourner à nouveau les tubes à 800 G pendant une minute à température ambiante et aspirez soigneusement le surnageant. Ajoutez 100 microlitres de tampon TE avec 1 % SDS aux billes.

Incuber le mélange à 65 degrés Celsius pendant cinq minutes, puis tourner à 800 G pendant une minute à température ambiante. Purifier le surnageant en 18 microlitres de tampon d’élution à l’aide de colonnes de purification d’ADN pour obtenir les échantillons d’immunoprécipitation BrdU et d’eSPAN H3K4me3. Préparez la banque d’ADN simple brin avec les échantillons mentionnés en suivant le manuel du kit de préparation de la banque d’ADN ssDNA et d’ADN à faible entrée.

Purifier le produit de ligature en 20 microlitres de tampon à faible teneur en EDTA. Amplifiez la banque d’ADN à l’aide de 50 microlitres de mélange réactionnel du kit de préparation de banque d’ADN simple brin. En suivant le cycle affiché, amplifiez le mélange PCR.

Purifiez les produits PCR en les mélangeant avec 60 microlitres de billes, préchauffées à 30 degrés Celsius. Mélangez soigneusement les produits PCR et les billes. Laissez reposer le mélange à température ambiante pendant cinq minutes.

Attachez les perles sur un support magnétique pendant trois minutes et lavez-les deux fois avec 200 microlitres d’éthanol à 80 % fraîchement préparé. Faites sécher les billes à l’air libre pendant deux minutes et diluez l’ADN dans 20 microlitres de tampon à faible teneur en EDTA fourni dans le kit de préparation de la banque d’ADN. Mesurez la concentration de la bibliothèque et la distribution de la taille des fragments à l’aide de systèmes d’électrophorèse à haute résolution.

Regroupez des quantités égales de banques individuelles, y compris les échantillons d’immunoprécipitation de la chromatine H3K4me3, d’immunoprécipitation BrdU, d’eSPAN pour effectuer un séquençage parallèle des extrémités appariées. Une analyse sur gel typique de la banque de séquençage de l’ADN de H3K4me3 eSPAN a révélé un motif en échelle de nucléosomes de la chromatine. La bande principale des mononucléosomes est apparue à 270 paires de bases où les adaptateurs ont été ajoutés au fragment d’ADN obtenu par digestion.

La cartographie des différents échantillons a révélé des pics au niveau des nucléosomes individuels entourant l’origine, répliquant de manière autonome la séquence 607 dans les cellules de type sauvage et les cellules mcm2-3A. Le biais moyen du brin a révélé que dans les cellules de levure de type sauvage, le dépôt d’histones parentaux présentait un léger biais en faveur du brin retardé. Cependant, chez l’histone parentale mutante, H3H4 a été transférée au brin principal.