Name: Un pipeline complet pour évaluer l’efficacité de l’érythropoïèse humaine in vitro et ex vivo (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-01-10T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: Découvrez une méthode complète pour évaluer l'efficacité de l'érythropoïèse humaine in vitro et ex vivo à partir de cellules CD34+. Cette approche permet d'étudier la différenciation érythroblastique et ses applications thérapeutiques.

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<meta charset="utf8"></head><body>Modélisation de l’érythropoïèse à l’aide de HSPC à partir de sang de cordon et de moelle osseuse

<ol><li>Sender, R., Milo, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+distribution+of+cellular+turnover+in+the+human+body%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">The distribution of cellular turnover in the human body.</a> Nat Med. 27 (1), 45-48 (2021).</li>
<li>Cazzola, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ineffective+erythropoiesis+and+its+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Ineffective erythropoiesis and its treatment.</a> Blood. 139 (16), 2460-2470 (2022).</li>
<li>Silverberg, D. S., Iaina, A., Wexler, D., Blum, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pathological+consequences+of+anaemia%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Lab+Haematol%22%5BJournal%5D)">The pathological consequences of anaemia.</a> Clin Lab Haematol. 23 (1), 1-6 (2001).</li>
<li>Safiri, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Burden+of+anemia+and+its+underlying+causes+in+204+countries+and+territories%2C+1990-2019%3A+results+from+the+Global+Burden+of+Disease+Study+2019%5BTitle%5D)+AND+%22J+Hematol+Oncol%22%5BJournal%5D)">Burden of anemia and its underlying causes in 204 countries and territories, 1990-2019: results from the Global Burden of Disease Study 2019.</a> J Hematol Oncol. 14 (1), 185(2021).</li>
<li>Bondu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+variant+erythroferrone+disrupts+iron+homeostasis+in+SF3B1-mutated+myelodysplastic+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">A variant erythroferrone disrupts iron homeostasis in SF3B1-mutated myelodysplastic syndrome.</a> Sci Transl Med. 11 (500), eaav5467(2019).</li>
<li>Elvarsdottir, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+three-dimensional+in+vitro+model+of+erythropoiesis+recapitulates+erythroid+failure+in+myelodysplastic+syndromes%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">A three-dimensional in vitro model of erythropoiesis recapitulates erythroid failure in myelodysplastic syndromes.</a> Leukemia. 34 (1), 271-282 (2020).</li>
<li>Yip, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+L-leucine+in+5q-+syndrome+and+other+RPS14-deficient+erythroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Effects of L-leucine in 5q- syndrome and other RPS14-deficient erythroblasts.</a> Leukemia. 26 (9), 2154-2158 (2012).</li>
<li>Clough, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinated+missplicing+of+TMEM14C+and+ABCB7+causes+ring+sideroblast+formation+in+SF3B1-mutant+myelodysplastic+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Coordinated missplicing of TMEM14C and ABCB7 causes ring sideroblast formation in SF3B1-mutant myelodysplastic syndrome.</a> Blood. 139 (13), 2038-2049 (2022).</li>
<li>Chao, R., Gong, X., Wang, L., Wang, P., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD71%28high%29+population+represents+primitive+erythroblasts+derived+from+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">CD71(high) population represents primitive erythroblasts derived from mouse embryonic stem cells.</a> Stem Cell Res. 14 (1), 30-38 (2015).</li>
<li>Loken, M. R., Shah, V. O., Dattilio, K. L., Civin, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+analysis+of+human+bone+marrow%3A+I.+Normal+erythroid+development%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric analysis of human bone marrow: I. Normal erythroid development.</a> Blood. 69 (1), 255-263 (1987).</li>
<li>Marsee, D. K., Pinkus, G. S., Yu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD71+%28transferrin+receptor%29%3A+an+effective+marker+for+erythroid+precursors+in+bone+marrow+biopsy+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Clin+Pathol%22%5BJournal%5D)">CD71 (transferrin receptor): an effective marker for erythroid precursors in bone marrow biopsy specimens.</a> Am J Clin Pathol. 134 (3), 429-435 (2010).</li>
<li>Berastegui, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcription+factor+DDIT3+is+a+potential+driver+of+dyserythropoiesis+in+myelodysplastic+syndromes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">The transcription factor DDIT3 is a potential driver of dyserythropoiesis in myelodysplastic syndromes.</a> Nat Commun. 13 (1), 7619(2022).</li>
<li>Mian, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitamin+B5+and+succinyl-CoA+improve+ineffective+erythropoiesis+in+SF3B1-mutated+myelodysplasia%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Vitamin B5 and succinyl-CoA improve ineffective erythropoiesis in SF3B1-mutated myelodysplasia.</a> Sci Transl Med. 15 (685), eabn5135(2023).</li>
<li>Armes, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germline+ERCC+excision+repair+6+like+2+%28ERCC6L2%29+mutations+lead+to+impaired+erythropoiesis+and+reshaping+of+the+bone+marrow+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Haematol%22%5BJournal%5D)">Germline ERCC excision repair 6 like 2 (ERCC6L2) mutations lead to impaired erythropoiesis and reshaping of the bone marrow microenvironment.</a> Br J Haematol. 199 (5), 754-764 (2022).</li>
<li>Hug, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dual+role+for+the+RNA+helicase+DHX34+in+NMD+and+pre-mRNA+splicing+and+its+function+in+hematopoietic+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">A dual role for the RNA helicase DHX34 in NMD and pre-mRNA splicing and its function in hematopoietic differentiation.</a> RNA. 28 (9), 1224-1238 (2022).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>2x HEPES</td><td>Merck</td><td>51558</td><td></td></tr><tr><td>Perles</td><td>Thermo Scientific</td><td>01-2222-42</td><td></td></tr><tr><td>CD235a APC Cy7</td><td>Biolegend</td><td>349115</td><td></td></tr><tr><td>CD34 PerCP Cy5.5 anticorps</td><td>BD Biosciences</td><td>347222</td><td></td></tr><tr><td>CD71 PE</td><td>Anticorps Biolegend</td><td>334106</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Merck</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Thermo Scientific</td><td>41966-029</td><td></td></tr><tr><td>DNAse</td><td>Merck</td><td>D4527-200KU</td><td></td></tr><tr><td>Support de montage DPX&nbsp ;</td><td>VWR</td><td>1.00579.0500</td><td></td></tr><tr><td>FACSAria Fusion&nbsp ;</td><td>BD Biosciences</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Merck</td><td>F9665</td><td></td></tr><tr><td>Gélatine</td><td>Merck</td><td>G1393</td><td></td></tr><tr><td>Giemsa solution</td><td>Abcam</td><td>ab150670</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td></td><td>Merck H0887-100mL</td><td></td></tr><tr><td>EPO humain</td><td>PeproTech</td><td>100-64</td><td></td></tr><tr><td>Humain Flt-3 ligand</td><td>PeproTech</td><td>300-19</td><td></td></tr><tr><td>G-CSF humain</td><td>PeproTech</td><td>300-23</td><td></td></tr><tr><td>IGF1 humain</td><td>PeproTech</td><td>100-11</td><td></td></tr><tr><td>IL-6</td><td>humain PeproTech</td><td>200-06</td><td></td></tr><tr><td>SCF</td><td>humain PeproTech</td><td>300-07</td><td></td></tr><tr><td>TPO humain</td><td>PeproTech</td><td>AF-300-18</td><td></td></tr><tr><td>LSRFortessa Cell Analyzer</td><td>BD Biosciences</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>May-Grunwald solution&nbsp ;</td><td>Generon</td><td>26250-01</td><td></td></tr><tr><td>Pannoramic 250 Scanner à haut débit&nbsp ;</td><td>3DHISTECH</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline/Streptomycine</td><td>Thermo Scientific</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Shandon Cytospin 3&nbsp ;</td><td>Thermo Scientific</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Cellules souches Milieu moyen</td><td>Technologies des cellules souches</td><td>9655</td><td></td></tr></tbody></table>

un pipeline complet pour évaluer l’efficacité de l’érythropoïèse humaine in vitro et ex vivo

A Comprehensive Pipeline to Assess the Efficiency of Human Erythropoiesis In Vitro and Ex Vivo

Les cellules CD34+ du sang de cordon ombilical ou de la moelle osseuse sont d’abord décongelées, stimulées et transduites avec un shRNA exprimant la GFP (Figure 1A). Les cellules CD34+GFP+ sont triées 4 jours après la transduction, selon la stratégie de déclenchement illustrée à la figure 1B. Des résultats représentatifs ont montré la maturation des cellules CD34+ après transduction et tri FACS. Les cellules sont analy...

Un pipeline complet pour évaluer l’efficacité de l’érythropoïèse humaine in vitro et ex vivo

Erythropoiesis, a remarkably dynamic and efficient process responsible for generating the daily quota of red blood cells (approximately 280 &plusmn; 20 ...

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Research

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JoVE Journal

Biology

Biologie

Une méthode cytométrie en flux pour l'identification et l'analyse moléculaire de la différenciation-spécifiques au stade progéniteurs érythroïdes murines et précurseurs, directement dans la moelle osseuse de souris fraîchement récoltés, de la rate ou du foie fœtal. Le test repose sur la surface des cellules CD71 marqueurs, Ter119, et la taille des cellules.

Identification et analyse des progéniteurs érythroïdes de la souris en utilisant les CD71/TER119 cytométrie en flux Assay

Lentiviraux médiée Knockdown cours Ex Vivo</emÉrythropoïèse> des cellules souches hématopoïétiques humaines

Un système de culture en 3D pour l'hématopoïèse est décrit en utilisant du sang de cordon humain et les cellules leucémiques de moelle osseuse. Le procédé est basé sur l'utilisation d'un polyuréthane poreux synthétique revêtue d'échafaudage protéines de matrice extracellulaire. Cet échafaudage est adaptable pour accueillir une large gamme de cellules.

Ex vivo Mimétisme de l&#39;hématopoïèse humaine normale et pathologique

Le présent protocole décrit un nouveau procédé d'identification d'une population d'énucléation d'érythroblastes orthochromatiques par écoulement d'imagerie multi-spectrale cytométrie, fournissant une visualisation du processus d'énucléation des érythroblastes.

Identification d&#39;une sous-population murine érythroblastes enrichi en énucléation événements par imagerie multispectrale cytométrie en flux

Nous présentons un système in vitro de culture de fœtus de souris des érythroblastes de foie qui dissèque les stades précoces et tardifs de l'érythropoïèse terminale. Ce système facilite l'analyse fonctionnelle des gènes spécifiques à différents stades de développement.

Souris foie fœtal Système de culture à disséquer les fonctions du gène cible dans les stades précoces et tardifs de l&#39;aérogare de l&#39;érythropoïèse

Quantification des cellules dérivées de donateurs est nécessaire pour contrôler la prise de greffe après greffe de cellules souches chez les patients atteints d’hémoglobinopathies. Une combinaison de tri de cellule axée sur la cytométrie en flux, analyse de la formation de colonie et analyse subséquente du tandem courte répétitions peuvent être employées pour évaluer la prolifération et la différenciation des cellules souches dans le compartiment érythroïde.

Détection de cellules progénitrices de donateurs résiduelle érythroïdes après Transplantation de cellules souches hématopoïétiques pour les Patients ayant des hémoglobinopathies

Nous présentons ici les techniques pour mesurer la déformabilité des globules rouges et l’hétérogénéité cellulaire par ektacytomètre. Ces techniques sont applicables pour des enquêtes générales de la déformabilité des globules rouges et des enquêtes spécifiques sur les maladies du sang caractérisées par la présence d’hématies rigides et déformables en circulation, telles que l’anémie falciforme.

Mesure de la déformabilité et hétérogénéité des globules rouges dans le sang par ektacytomètre

Ici, nous présentons un protocole pour former précisément l'endothélium hémogène à partir de cellules souches pluripotentes humaines dans une condition sans mangeoire et sans xéno. Cette méthode aura de larges applications dans la modélisation des maladies et le dépistage des composés thérapeutiques.

Différenciation hémogénique de l'endothélium par des cellules souches pluripotentes humaines dans une condition définie sans mangeoire et sans xéno

La méthode présentée ici résume les protocoles optimisés pour évaluer la bioénergétique cellulaire dans les cellules souches hématopoïétiques et progénitrices primitives (HSPC) non adhérentes de souris à l’aide de l’analyseur de flux extracellulaire pour mesurer le taux d’acidification extracellulaire (ECAR) et le taux de consommation d’oxygène (OCR) des HSPC en temps réel.

Évaluation de la bioénergétique cellulaire dans les cellules souches hématopoïétiques et progénitrices primitives de souris à l’aide de l’analyseur de flux extracellulaire

Ici, nous décrivons une nouvelle méthode de cytométrie en flux pour l’isolement prospectif des progéniteurs érythroïdes unitaires formant des éclatements précoces (BFU-e) et érythroïdes formant colonie (CFU-e) directement à partir de moelle osseuse et de rate fraîches de souris. Ce protocole, développé sur la base de données transcriptomiques unicellulaires, est le premier à isoler tous les progéniteurs érythroïdes du tissu avec une grande pureté.

Identification et isolement de progéniteurs érythroïdes unitaires formant des éclatements et unités formant colonies à partir de tissus murins par cytométrie en flux

Découvrez une méthode complète pour évaluer l'efficacité de l'érythropoïèse humaine in vitro et ex vivo à partir de cellules CD34+. Cette approche permet d'étudier la différenciation érythroblastique et ses applications thérapeutiques.

Un pipeline complet pour évaluer l’efficacité de l’érythropoïèse humaine in vitro et ex vivo

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