Un pipeline complet pour évaluer l’efficacité de l’érythropoïèse humaine in vitro et ex vivo
10 janvier 2025
La modélisation de l’érythropoïèse offre une occasion précieuse de comprendre l’importance biologique des acteurs de ce processus et d’évaluer de nouvelles approches thérapeutiques susceptibles d’atténuer les défauts de différenciation. Nous décrivons ici une méthode simple et fiable pour différencier efficacement les cellules souches hématopoïétiques et progénitrices CD34+ ex vivo.
Nos recherches portent sur la leucémie, plus précisément sur les syndromes myélodysplasiques ou la néoplasie myélodysplasique. Il s’agit d’une maladie des cellules souches provenant des cellules souches hématopoïétiques. Il affecte diverses lignées de cellules sanguines, en particulier la lignée érythroïde, qui est responsable de la production de cellules sanguines cardiaques.
La perturbation de cette lignée peut entraîner l’anémie, qui est fréquemment observée chez les patients atteints de SMD. Le pipeline que nous présentons dans cet article permet une méthode robuste et simplifiée pour évaluer l’efficacité de l’érythroblaste humain in vitro lors d’une modification génétique ou d’un traitement médicamenteux. Les cellules souches hématopoïétiques sont présentes de la naissance jusqu’au dernier moment de notre vie.
Il n’y a plus de tissu prolifératif dans notre organisme avec des milliards de cellules produites chaque jour. Il y a encore tellement de choses à comprendre, alors nous continuerons à étudier ces cellules étonnantes dans les tissus aminés sains, en mettant l’accent sur la protéostasie et la biologie de l’ARN. Pour commencer, décongelez 100 000 cellules CD34+UCB en plongeant le flacon pendant 30 secondes dans un bain-marie réglé à 37 degrés Celsius.
Ajoutez un millilitre de milieu de décongélation goutte à goutte dans le flacon, puis remettez doucement les cellules en suspension en pipetant de haut en bas. Transférez la suspension de cellule en suspension goutte à goutte dans cinq millilitres de produit de décongélation. Ensuite, centrifugez la suspension cellulaire pendant huit minutes à 320 G à température ambiante.
Lavez les cellules dans 10 millilitres de tri cellulaire activé par fluorescence ou de tampon FACS avec DNAse. Après avoir centrifuger à nouveau les cellules, remettre la pastille en suspension dans deux millilitres de milieu de stimulation. Transférez deux millilitres de suspension cellulaire dans une plaque de 24 puits et incubez la plaque pendant quatre à six heures à 37 degrés Celsius.
Ensuite, collectez les cellules dans des tubes de tri cellulaire activés par fluorescence et remplissez-les d’un millilitre de milieu de cellules souches. Après la décongélation du virus, ajoutez le volume requis aux milieux de stimulation pour obtenir une multiplicité d’infection de 30. Remettez en suspension les cellules granulées dans un milieu contenant le virus à une densité de 100 000 cellules pour 100 microlitres de virus et transférez-les dans un puits d’une plaque de 96 puits.
Ajoutez du PBS dans les puits vides et incubez toute la nuit à 37 degrés Celsius. Transférez ensuite le volume complet de suspension cellulaire du puits de la plaque à 96 puits dans des tubes FACS avec un millilitre de milieu de cellules souches. Lavez le puits et l’embout de la pipette avec un milieu de cellules souches pour ajouter deux millilitres de milieu de cellules souches dans le tube FACS.
Après avoir centrifugé le tube FACS, jetez le surnageant et remettez en suspension la pastille cellulaire dans deux millilitres de milieu d’expansion. Transférez la suspension dans un puits d’une plaque de 24 puits et incubez les cellules. Pour commencer, transférez le volume complet des cellules CD34+ transduites avec le rapporteur EGFP dans un tube FACS séparé.
Centrifuger à 320 G pendant huit minutes à température ambiante. Remettre en suspension les cellules granulées dans 100 microlitres de tampon FACS. Ajoutez cinq microlitres d’anticorps CD34 par tube et incubez les tubes dans l’obscurité à quatre degrés Celsius pendant 20 minutes.
Ensuite, mettez les cellules en suspension dans un millilitre de tampon FACS contenant du DAPI et centrifugez pendant huit minutes à 320 G à température ambiante. Après avoir remis les cellules en suspension dans 200 microlitres de tampon FACS contenant du DAPI, filtrez la suspension cellulaire à travers une crépine de 40 micromètres avant le tri. Ensuite, ajoutez 0,5 microlitre d’anticorps CD34 à une goutte de billes dans 100 microlitres de PBS.
Incuber le mélange dans l’obscurité à quatre degrés Celsius pendant 20 minutes. Ajoutez ensuite un millilitre de PBS au mélange. Centrifuger pendant huit minutes à 320 G à température ambiante.
Jetez le surnageant et remettez en suspension la pastille dans 500 microlitres de PBS. Ensuite, ajoutez des cellules leucémiques GFP négatives et GFP positives dans un tube FACS. Lavez les cellules dans un millilitre de tampon FACS.
Après avoir centrifugé les cellules, remettez en suspension 100 000 cellules GFP négatives et 100 000 cellules GFP positives, chacune dans 500 microlitres de tampon FACS. Filtrez la suspension cellulaire à travers une crépine de 40 micromètres avant le tri. Ensuite, collectez les cellules triées dans un milieu de cellules souches.
Centrifugez les cellules pendant huit minutes à 320 G à température ambiante. Ensuite, mettez les cellules en suspension dans trois millilitres de milieu de différenciation érythroïde. Maintenant, distribuez un millilitre des cellules remises en suspension dans trois puits d’une plaque de 24 puits.
Remplissez tous les puits extérieurs avec du PBS. Pour rafraîchir le support, assurez-vous que les cellules se sont déposées au bas de la plaque. Inclinez doucement la plaque et retirez 500 microlitres de support.
Ajoutez ensuite 500 microlitres de milieux de différenciation des cytokines érythroïdes 2X pour rafraîchir la plaque. Le sixième jour, transférez les cellules dans une plaque à 12 puits et ajoutez un millilitre de média dans chaque puits pour atteindre un volume final de deux millilitres. Prélevez 200 microlitres de cellules dans chaque puits de la plaque à 12 puits.
Remplacer le volume retiré par 250 microlitres de milieu de différenciation érythroïde 2X. Ajoutez un millilitre de tampon FACS dans chaque tube de prélèvement. Après avoir centrifugé les tubes, remettre en suspension les cellules granulées dans 100 microlitres de tampon FACS.
Ajoutez un microlitre chacun d’anticorps CD71, CD34 et CD235a dans les tubes. Ensuite, mettez les cellules en suspension dans un millilitre de tampon FACS contenant du DAPI. Centrifugez les tubes pendant huit minutes à 320 G à température ambiante.
Remettre les cellules en suspension dans 200 microlitres de tampon FACS avec DAPI. Réglez DAPI par rapport à la diffusion latérale ou SSC pour exclure les cellules mortes. Définissez la hauteur SSC en fonction de la surface SSC pour exclure les agrégats et sélectionner des cellules uniques.
Définissez la zone de diffusion vers l’avant par rapport à SSCA pour éliminer les débris en fonction de la taille. Réglez CD235a par rapport à CD71. Réglez CD34 par rapport à SSCA.
Exécutez des billes de cellules positives à la GFP et des cellules colorées au DAPI. Compensez les lectures et appliquez la compensation aux paramètres du cytomètre. Les cellules CD34 positives du sang de cordon ombilical ont montré une augmentation des cellules apoptotiques positives à l’annexine V, passant de 14,4 % le quatrième jour à 34,2 % le 17e jour.
Le graphique à barres montre une augmentation significative du pourcentage de cellules positives à l’annexine V au 17e jour, atteignant environ 40 %
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Aperçu
Cette étude examine la différenciation ex vivo des cellules souches et progénitrices hématopoïétiques CD34+, en abordant les processus critiques impliqués dans l'érythropoïèse et leurs implications pour le traitement de troubles associés tels que les syndromes myélodysplasiques. En proposant une méthode simplifiée pour évaluer l'efficacité des érythroblastes, la recherche vise à améliorer la compréhension des perturbations menant à l'anémie chez ces patients.
Composantes clés de l'étude
Domaine de recherche
- Érythropoïèse
- Syndromes myélodysplasiques
- Biologie des cellules souches hématopoïétiques
Contexte
- Les syndromes myélodysplasiques sont des maladies des cellules souches affectant les lignées cellulaires sanguines.
- La perturbation de la lignée érythroïde peut entraîner une anémie.
- La compréhension des cellules souches hématopoïétiques est essentielle, car elles persistent tout au long de la vie humaine.
Méthodes utilisées
- Décongélation et reprise en suspension des cellules de CBU CD34+
- Transduction des cellules avec des modifications géniques
- Tri cellulaire activé par fluorescence (FACS)
Résultats principaux
- Les cellules CD34+ ont montré une augmentation des taux d'apoptose au fil du temps.
- Une différenciation efficace en érythroblastes a été démontrée.
- Les méthodes spécifiques développées permettent une évaluation après modification génique ou traitement médicamenteux.
Conclusions
- L'étude démontre une méthode robuste permettant de différencier les cellules hématopoïétiques, ce qui pourrait conduire à des traitements plus efficaces contre l'anémie provoquée par les syndromes myélodysplasiques.
- Ce travail souligne l'importance de la compréhension de la différenciation cellulaire en biologie des cellules souches.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
L'évaluation efficace de l'érythropoïèse humaine est essentielle pour réduire les risques dans la découverte précoce de médicaments en hématologie et pour comprendre les mécanismes sous-jacents aux anémies et aux syndromes myélodysplasiques. Ce protocole permet une évaluation robuste et quantitative de la différenciation érythroïde et de la fonction des gènes dans des systèmes humains sains comme dans ceux associés à des pathologies. L'approche renforce la confiance prédictive dans la validation des cibles et oriente les décisions stratégiques concernant les thérapies modulant l'érythropoïèse.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Permet d'étudier la fonction des gènes et l'impact des voies de signalisation sur l'engagement dans la lignée érythroïde.
- Contribue à l'évaluation du risque biologique en quantifiant les effets de perturbations génétiques ou chimiques sur l'érythropoïèse.
- Facilite la validation fonctionnelle des cibles dans les cellules souches et progénitrices hématopoïétiques humaines primaires.
- Apporte des éclairages mécanistiques sur les perturbations pathologiques, telles que celles observées dans les syndromes myélodysplasiques.
Développement de criblages et de tests
- Établit des systèmes validés in vitro et ex vivo pour le criblage de composés influençant la différenciation érythroïde.
- Permet des lectures reproductibles et quantitatives à l’aide de la cytométrie en flux et de l’identification cellulaire basée sur des marqueurs.
- Facilite la standardisation des tests afin d’assurer la comparabilité entre études et entre équipes.
- Prépare des plateformes évolutives pour évaluer les stratégies de modulation génique et de récupération médicamenteuse.
Recherche translationnelle et préclinique
- Assure la continuité translationnelle en alignant les résultats in vitro sur des modèles dérivés de patients ex vivo.
- Permet une progression ajustée au risque des candidats présentant des effets démontrés sur l'érythropoïèse.
- Favorise le développement de biomarqueurs en suivant les marqueurs de différenciation et d'apoptose au fil du temps.
- Offre une détection mécanistique des risques pour la sélection préclinique de candidats dans les portefeuilles d'hématologie.
Intégration du pipeline et du flux de travail
Cette méthode intègre l'ensemble du processus, depuis la découverte précoce jusqu'à l'identification du composé actif et la validation préclinique, dans des pipelines axés sur l'hématologie.
- Biologie de la découverte : Quantifie les effets des gènes et des composés sur la spécification et la maturation de la lignée érythroïde.
- Écrantage : Propose des tests normalisés et reproductibles par cytométrie en flux pour l'écrantage de composés et de gènes.
- Analytique : Fournit des données quantitatives telles que les taux d'apoptose et l'expression des marqueurs pour des analyses comparatives.
- Recherche translationnelle : Établit un lien entre les résultats obtenus in vitro et ex vivo et les modèles de maladies pertinents pour les patients.
- Réutilisation en entreprise : Offre un flux de travail modulaire et réutilisable, adaptable à diverses cibles génétiques et bibliothèques de composés.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive dans la validation des cibles et la compréhension mécanistique de l'érythropoïèse.
- Valeur opérationnelle : Standardise les flux de travail pour assurer la reproductibilité et l'évolutivité entre les équipes de recherche et développement.
- Valeur stratégique : Permet de prendre des décisions éclairées d'aller ou de ne pas aller plus loin et réduit les risques biologiques tardifs dans les programmes d'hématologie.
- Impact sur le portefeuille : Soutient la priorisation ajustée au risque des cibles et des composés présentant des effets érythroïdes validés.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en culture de cellules souches hématopoïétiques et en analyse par cytométrie en flux.
- Requiert un accès à un équipement de tri cellulaire (FACS) et à des panels d'anticorps validés pour les marqueurs érythroïdes.
- Exige une standardisation inter-équipes des stratégies de géométrage et de l'interprétation des données.
- Adaptable à des échantillons provenant de donneurs sains ou de patients, offrant une applicabilité plus large.
- Dépend d'une source cellulaire fiable et d'un contrôle qualité rigoureux pour des résultats reproductibles.
