Quantification du glucose Bergmeyer pour les échantillons microbiologiques

La recherche évalue la concentration de glucose dans des échantillons microbiens à l’aide de techniques de quantification à partir de filtres bactériens et de levures. L’objectif est d’améliorer la précision du gramme de masse de glucose dans les études microbiologiques. Les défis comprennent la quantification précise de la faible concentration de glucose dans des échantillons microbiens complexes et la distinction entre les sources microbiennes et environnementales de glucose dans les cultures mixtes.

La recherche a montré une corrélation claire entre des souches microbiennes spécifiques et leurs taux de consommation de glucose, révélant comment les facteurs environnementaux influencent les voies métaboliques. Notre protocole améliore la détection du glucose en améliorant la spécificité et la sensibilité tout en réduisant le temps de traitement. L’utilisation contrôlée de l’acide sulfurique minimise les interférences.

Les recherches futures porteront sur l’optimisation des méthodes de détection du glucose pour les applications de microbiologie industrielle et sur l’étude du rôle d’un gène spécifique dans le métabolisme du glucose dans diverses conditions environnementales. Pour commencer, pesez 1,28 gramme de dihydrogénophosphate de potassium et 0,1304 gramme de phosphate dipotassique dans un bécher en verre. Ajoutez 70 millilitres d’eau déminéralisée et ajustez le pH à 5,5 en utilisant 1 molaire d’acide chlorhydrique ou d’hydroxyde de potassium.

Transférez ensuite la solution dans une fiole jaugée de 100 millilitres et ajustez le volume à 100 millilitres avec de l’eau déminéralisée. Conservez la solution préparée dans un récipient ambré à une température de 4 à 8 degrés Celsius pendant une période pouvant aller jusqu’à trois mois. Ensuite, pesez 0,01 gramme de chlorhydrate d’o-Dianisidine dans un tube à centrifuger de 2 millilitres.

À l’aide d’une pipette de 1 000 microlitres, ajoutez 1 millilitre d’eau déminéralisée pour dissoudre le composé et mélangez lentement la solution. Enveloppez le tube de centrifugation dans du papier d’aluminium pour le protéger de la lumière et conservez-le à 20 degrés Celsius. Ajoutez ensuite une solution de dichlorhydrate d’o-dianisidine à 10 millilitres de tampon phosphate pris dans une fiole jaugée de 100 millilitres et ajustez le volume final à 100 millilitres avec le tampon de phosphate.

Après avoir transféré la solution dans une fiole ambrée, conservez-la à une température de 4 à 8 degrés Celsius pendant 3 à 4 mois. Placez maintenant une fiole jaugée de 100 millilitres avec 30 millilitres d’eau déminéralisée dans un bain de glace. Après 10 minutes, versez lentement 51 millilitres d’acide sulfurique à 98 % sur les parois du ballon tout en le secouant doucement.

Plus tard, ajustez le volume final à 100 millilitres avec de l’eau déminéralisée et transférez la solution dans une fiole ambrée en verre pour le stockage. Pour la préparation enzymatique, pesez 0,01 gramme de glucose oxydase dans un microtube stérile de 2 millilitres. Ajoutez 1 millilitre de tampon d’acétate de sodium de 50 millimolaires à pH 5 dans le microtube et mélangez délicatement.

Ensuite, dans un nouveau microtube de 2 millilitres, pesez 0,0031 gramme d’enzyme peroxydase et dissolvez-le dans 1 millilitre de tampon phosphate réglé à pH 5,5. Couvrez les deux microtubes contenant des enzymes avec du papier d’aluminium et stockez-les à 20 degrés Celsius. Préparez ensuite une solution étalon de D-glucose de 1 gramme par litre en utilisant de l’eau déminéralisée.

Pour commencer, préparez l’étalon de glucose et toutes les autres solutions requises pour le dosage. Ajoutez le volume approprié de glucose dans des tubes frais de 2 millilitres. Réglez un bain thermique sec à 37 degrés Celsius et laissez-le se stabiliser.

Ajoutez les volumes appropriés de tampon dans chaque microtube, puis 3,3 microlitres de glucose oxydase et 1,2 microlitre de peroxydase. Incuber les tubes à 37 degrés Celsius et régler la minuterie sur 20 minutes. Immédiatement après l’incubation, ajoutez 750 microlitres d’acide sulfurique à 50 % dans chaque microtube et placez-les dans un bain de glace pendant 2 minutes pour qu’ils refroidissent.

Transférez le mélange refroidi de 1 500 microlitres dans une cuvette en plastique et mesurez l’absorbance à 529 nanomètres. Nettoyez ensuite la zone de travail avec une solution à 70 % d’alcool et allumez un brûleur pour assurer l’asepsie. Obtenez des bactéries ou des levures dans un milieu de culture liquide.

Transférez 100 microlitres de la culture dans des microtubes de 1,5 millilitre à l’aide d’embouts stériles. Centrifuger les échantillons à 7 500 G pendant 7 minutes à 4 degrés Celsius. Après la centrifugation, retirez soigneusement le surnageant, qui contient du glucose en solution.

Mélangez 0,5 microlitre de surnageant avec tous les composants requis pour préparer le mélange réactionnel. Incuber les microtubes pendant 20 minutes à 37 degrés Celsius et ajouter immédiatement 750 microlitres d’acide sulfurique à 50 %. Laissez refroidir le mélange dans un bain de glace pendant 2 minutes.

Enfin, mesurez l’absorbance à 529 nanomètres. L’analyse spectrophotométrique a indiqué un pic d’absorbance maximal à 529 nanomètres. L’analyse de la consommation de glucose par Debaryomyces hansenii a montré des résultats cohérents entre les méthodes de glucose oxydase et de DNS jusqu’à ce que des différences significatives apparaissent à 6, 8 et 12 heures.

L’application de la méthode de l’acide sulfurique glucose oxydase a facilité l’analyse de concentrations élevées de glucose jusqu’à 100 grammes par litre, avec des résultats fiables après dilution.