Technique de nage horizontale en forme de U pour la préparation de spermatozoïdes de haute qualité avec un faible indice de fragmentation de l’ADN

[Narrateur] La recherche se concentre sur une méthode d’optimisation des spermatozoïdes, visant à déterminer si la technique UHS offre des avantages dans la préparation de spermatozoïdes de haute qualité avec un faible indice de fragmentation de l’ADN. La technologie microfluidique a été utilisée pour optimiser la sélection de spermatozoïdes de haute qualité avec un DFI plus faible. La principale limitation de la méthode UHS est sa forte dépendance à la capacité d’auto-nage de spermatozoïdes de haute qualité. La méthode UHS ne convient pas aux patients dont les spermatozoïdes sont complètement immobiles. La thigmotaxie joue un rôle crucial dans la séparation des spermatozoïdes. L’orbite en forme de U a une frontière plus longue, ce qui facilite la libre circulation des spermatozoïdes de haute qualité, permettant leur séparation complète des spermatozoïdes immobiles, des impuretés et d’autres composants. Par rapport à la technique DGC, la méthode UHS implique moins d’étapes d’opération manuelle pour le personnel de laboratoire, et les spermatozoïdes de haute qualité obtenus par la méthode UHS ne subissent pas de procédures de centrifugation répétées, ce qui entraîne une DFI plus faible. Pour commencer, ajoutez 20 microlitres de milieu de fertilisation dans la boîte de travail pour créer des pistes en forme de U. Aspirez 10 microlitres de milieu de fertilisation à l’aide d’une pipette pour créer une gouttelette circulaire au point de départ gauche de la piste en forme de U. À l’aide d’un milieu de fertilisation, créez deux gouttelettes tampons de 10 microlitres chacune à intervalles réguliers le long de la section centrale gauche de la piste en forme de U. Connectez toutes les gouttelettes avec le milieu de fertilisation pour former une piste continue. Utilisez 2,5 microlitres de polyvinylpyrrolidone, ou PVP, pour créer une longue bande de gouttelettes de liquide sur le côté droit de la piste en forme de U. Produisez six microgouttelettes à l’aide du milieu de traitement des ovocytes situé sur le côté droit de la bande PVP. Ajoutez sept millilitres d’huile de culture dans le plat, en vous assurant que l’huile recouvre complètement le point le plus élevé des gouttelettes. Placez le plat dans un incubateur à 37 degrés Celsius, 6 % de dioxyde de carbone pendant la nuit pour équilibrer. Après avoir recueilli le sperme, mesurez son volume à l’aide de la méthode de pesée, en assurant une précision de 0,01 millilitre. Placez l’échantillon de sperme dans un environnement à 37 degrés Celsius pendant 15 à 30 minutes et aspirez-le dans une pipette jetable en plastique de gros calibre. Si le sperme ne se liquéfie pas dans les 60 minutes, ajoutez une quantité égale de milieu de fertilisation. Inspirez et expirez à plusieurs reprises le mélange à l’aide d’une pipette de transfert en plastique jetable jusqu’à ce qu’il se liquéfie complètement. Mesurez la valeur du pH du sperme à l’aide d’un papier réactif de pH de précision avec une plage de six à 10. Prenez 10 microlitres de sperme entièrement liquéfié et versez-le dans une chambre de comptage maculaire. Évaluez la motilité des spermatozoïdes sous un champ de 200X à l’aide d’un microscope optique. Ajoutez cinq microlitres de sperme à la microgouttelette du milieu de fertilisation au point de départ gauche de la piste en forme de U dans la parabole de fonctionnement ICSI. Ajustez l’angle et la position de l’aiguille de retenue de l’ovocyte et de l’aiguille d’injection sous la lentille de l’objectif 4X. Après avoir vérifié la configuration, transférez l’ovocyte sélectionné dans le milieu de traitement des ovocytes en microgouttelettes dans la boîte de fonctionnement ICSI. Placez la boîte opératoire contenant les ovocytes sur la platine chaude de l’opérateur de microscope préparé. Après avoir réglé la mise au point, abaissez l’aiguille d’injection dans la bande PVP de la parabole de commande ICSI. Déplacez l’aiguille d’injection dans la longue bande sur le côté droit de la piste en forme de U et extrayez des spermatozoïdes de haute qualité. Transférez le sperme dans la bandelette PVP du côté droit et placez le sperme au fond de la boîte d’opération. Appuyez doucement sur l’aiguille d’injection dans la partie médiane ou inférieure de la queue du spermatozoïde. Tirez rapidement l’aiguille d’injection vers l’arrière et grattez le spermatozoïde pour l’immobiliser. Maintenant, inhalez le sperme de la queue à la tête dans l’aiguille d’injection. Injectez lentement les spermatozoïdes dans le cytoplasme de l’ovocyte et incubez l’ovocyte injecté. Ajouter 1,5 millilitre de solution de centrifugation à gradient de densité de 45 % dans un tube à essai stérile à fond conique de 15 millilitres. Et ajoutez lentement 1,5 millilitre de solution de centrifugation à gradient de densité de 90 % au fond de la solution de gradient de 45 %. Maintenant, ajoutez le sperme liquéfié dans la solution de centrifugation à gradient et faites tourner le tube à 300 G pendant 15 minutes à température ambiante. Après avoir retiré le surnageant, prélevez environ 0,5 millilitre de sédiment de spermatozoïde restant et mélangez-le avec trois millilitres de milieu de fécondation. Centrifugez le mélange à 200 G pendant cinq minutes à température ambiante. Pipetez soigneusement le surnageant, en laissant environ 0,2 millilitre de sédiment, puis secouez et mélangez pour remettre le sédiment en suspension. Enfin, comptez la concentration et la motilité des spermatozoïdes avant de stocker l’échantillon dans un incubateur à 37 degrés Celsius, à 6 % de dioxyde de carbone pour une utilisation ultérieure. Placez un tube contenant 25 microlitres de solution d’agarose à bas point de fusion dans un bain-marie à 90 à 100 degrés Celsius pendant une à deux minutes. Transférez ensuite le tube dans un bain-marie à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes jusqu’à ce que la température se stabilise. Ajoutez trois à 10 microlitres de sperme dans des tubes d’agarose à bas point de fusion et mélangez soigneusement. Déposez 30 microlitres du mélange sur une lame de verre prétraitée en position horizontale. Après avoir couvert, placez la lame de verre prétraitée dans un réfrigérateur à une température de deux à huit degrés Celsius pendant quatre minutes, en veillant à ce qu’elle reste en position horizontale. Retirez la diapositive du réfrigérateur et faites-la glisser doucement pour retirer la vitre de protection. Immergez rapidement la lame de verre prétraitée dans une solution dénaturante pendant sept minutes. Retirez la glissière et mettez-la debout à la verticale. Utilisez ensuite du papier filtre pour absorber l’excès de gouttelettes d’eau sans toucher la zone de l’échantillon. Lavez la lame dans de l’eau distillée pendant cinq secondes. Immergez la diapositive en verre en série dans les solutions appropriées pour la période spécifique. Ensuite, en maintenant la lame de verre prétraitée horizontale, ajoutez environ un millilitre de solution de colorant mixte sur la lame. Après avoir taché pendant cinq minutes, rincez doucement la lame de vitrail avec de l’eau distillée 10 à 15 fois. Des spermatozoïdes de haute qualité avec une bonne motilité progressive ont nagé en douceur le long du bord de la piste en forme de U, ce qui a permis à l’aiguille d’injection intracytoplasmique de spermatozoïdes de les saisir plus facilement individuellement. Bien que de bons spermatozoïdes aient été obtenus à l’aide des deux méthodes, l’indice de fragmentation de l’ADN des spermatozoïdes de haute qualité séparés à l’aide de la méthode de centrifugation par gradient de densité était significativement plus élevé que celui de la méthode de nage horizontale en forme de U.