Name: Injection intrathécale lombaire de vecteurs de thérapie génique pour le ciblage du système nerveux central chez la souris et le rat (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-05-16T12:10:00.000+00:00
Duration: 5 min 9 s
Description: Découvrez la technique d'injection intrathécale lombaire pour administrer des vecteurs de thérapie génique chez la souris et le rat. Cette méthode permet une distribution efficace dans le système nerveux central pour les études précliniques.

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<ol><li>Deverman, B. E., Ravina, B. M., Bankiewicz, K. S., Paul, S. M., Sah, D. W. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+therapy+for+neurological+disorders%3A+Progress+and+prospects%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Gene therapy for neurological disorders: Progress and prospects.</a> Nat Rev Drug Discov. 17 (9), 641-659 (2018).</li>
<li>Pupo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AAV+vectors%3A+The+Rubik%27s+cube+of+human+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">AAV vectors: The Rubik's cube of human gene therapy.</a> Mol Ther. 30 (12), 3515-3541 (2022).</li>
<li>Ling, Q., Herstine, J. A., Bradbury, A., Gray, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AAV-based+in+vivo+gene+therapy+for+neurological+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">AAV-based in vivo gene therapy for neurological disorders.</a> Nat Rev Drug Discov. 22 (10), 789-806 (2023).</li>
<li>Lykken, E. A., Shyng, C., Edwards, R. J., Rozenberg, A., Gray, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+progress+and+considerations+for+AAV+gene+therapies+targeting+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurodev+Disord%22%5BJournal%5D)">Recent progress and considerations for AAV gene therapies targeting the central nervous system.</a> J Neurodev Disord. 10 (1), 16(2018).</li>
<li>Hocquemiller, M., Giersch, L., Audrain, M., Parker, S., Cartier, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-associated+virus-based+gene+therapy+for+CNS+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Adeno-associated virus-based gene therapy for CNS diseases.</a> Hum Gene Ther. 27 (7), 478-496 (2016).</li>
<li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biodistribution+of+adeno-associated+virus+gene+therapy+following+cerebrospinal+fluid-directed+administration%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Biodistribution of adeno-associated virus gene therapy following cerebrospinal fluid-directed administration.</a> Hum Gene Ther. 34 (3-4), 94-111 (2023).</li>
<li>Corning, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spinal+anesthesia+and+local+medication+of+the+cord%5BTitle%5D)+AND+%22NY+Med.+J%22%5BJournal%5D)">Spinal anesthesia and local medication of the cord.</a> NY Med. J. , 483-485 (1885).</li>
<li>Hylden, J. L., Wilcox, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrathecal+morphine+in+mice%3A+A+new+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Intrathecal morphine in mice: A new technique.</a> Eur J Pharmacol. 67 (2-3), 313-316 (1980).</li>
<li>Fairbanks, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spinal+delivery+of+analgesics+in+experimental+models+of+pain+and+analgesia%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Drug+Deliv+Rev%22%5BJournal%5D)">Spinal delivery of analgesics in experimental models of pain and analgesia.</a> Adv Drug Deliv Rev. 55 (8), 1007-1041 (2003).</li>
<li>Choi, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-frequency+ultrasound-guided+intrathecal+injections+in+a+young+mouse+model%3A+Targeting+the+central+nervous+system+in+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">High-frequency ultrasound-guided intrathecal injections in a young mouse model: Targeting the central nervous system in drug delivery.</a> J Neurosci Methods. 386, 109778(2023).</li>
<li>Li, D., Li, Y., Tian, Y., Xu, Z., Guo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+intrathecal+injection+of+recombinant+adeno-associated+viruses+in+adult+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Direct intrathecal injection of recombinant adeno-associated viruses in adult mice.</a> J Vis Exp. 144, e58565(2019).</li>
<li>Njoo, C., Heinl, C., Kuner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+SiRNA+transfection+and+gene+knockdown+in+spinal+cord+via+rapid+noninvasive+lumbar+intrathecal+injections+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">In vivo SiRNA transfection and gene knockdown in spinal cord via rapid noninvasive lumbar intrathecal injections in mice.</a> J Vis Exp. 85, e51229(2014).</li>
<li>Vulchanova, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+adeno-associated+virus-mediated+gene+transfer+to+sensory+neurons+following+intrathecal+delivery+by+direct+lumbar+puncture%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Pain%22%5BJournal%5D)">Differential adeno-associated virus-mediated gene transfer to sensory neurons following intrathecal delivery by direct lumbar puncture.</a> Mol Pain. 6, 31(2010).</li>
<li>Yaksh, T. L., Rudy, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+catheterization+of+the+spinal+subarachnoid+space%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Behav%22%5BJournal%5D)">Chronic catheterization of the spinal subarachnoid space.</a> Physiol Behav. 17 (6), 1031-1036 (1976).</li>
<li>Mestre, C., Pelissier, T., Fialip, J., Wilcox, G., Eschalier, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+to+perform+direct+transcutaneous+intrathecal+injection+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharmacol+Toxicol+Methods%22%5BJournal%5D)">A method to perform direct transcutaneous intrathecal injection in rats.</a> J Pharmacol Toxicol Methods. 32 (4), 197-200 (1994).</li>
<li>Donsante, A., Rasmussen, S. A., Fridovich-Keil, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrathecal+vector+delivery+in+juvenile+rats+via+lumbar+cistern+injection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Intrathecal vector delivery in juvenile rats via lumbar cistern injection.</a> J Vis Exp. 205, e66463(2024).</li>
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<li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrathecal+AAV9%2FAP4M1+gene+therapy+for+hereditary+spastic+paraplegia+50+shows+safety+and+efficacy+in+preclinical+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Intrathecal AAV9/AP4M1 gene therapy for hereditary spastic paraplegia 50 shows safety and efficacy in preclinical studies.</a> J Clin Invest. 133 (10), JCI164575(2023).</li>
<li>Deschenes, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+correction+of+GM2+ganglioside+accumulation+in+AB-variant+GM2+gangliosidosis%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Biochemical correction of GM2 ganglioside accumulation in AB-variant GM2 gangliosidosis.</a> Int J Mol Sci. 24 (11), ijms24119217(2023).</li>
<li>Hwang, S. M., Rahman, M. M., Go, E. J., Kim, Y. H., Park, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+transcription+factors+Ascl1+and+Lhx6+attenuate+diabetic+neuropathic+pain+by+modulating+spinal+neuroinflammation+and+microglial+activation+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Pharmacother%22%5BJournal%5D)">Specific transcription factors Ascl1 and Lhx6 attenuate diabetic neuropathic pain by modulating spinal neuroinflammation and microglial activation in mice.</a> Biomed Pharmacother. 173, 116392(2024).</li>
<li>Kagiava, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+replacement+therapy+in+two+Golgi-retained+CMT1X+mutants+before+and+after+the+onset+of+demyelinating+neuropathy%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther+Methods+Clin+Dev%22%5BJournal%5D)">Gene replacement therapy in two Golgi-retained CMT1X mutants before and after the onset of demyelinating neuropathy.</a> Mol Ther Methods Clin Dev. 30, 377-393 (2023).</li>
<li>Wong, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CNS-dominant+human+FMRP+isoform+rescues+seizures%2C+fear%2C+and+sleep+abnormalities+in+Fmr1-KO+mice%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">CNS-dominant human FMRP isoform rescues seizures, fear, and sleep abnormalities in Fmr1-KO mice.</a> JCI Insight. 8 (11), 169650(2023).</li>
<li>Laoharawee, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevention+of+neurocognitive+deficiency+in+mucopolysaccharidosis+type+ii+mice+by+central+nervous+system-directed%2C+AAV9-mediated+iduronate+sulfatase+gene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Prevention of neurocognitive deficiency in mucopolysaccharidosis type ii mice by central nervous system-directed, AAV9-mediated iduronate sulfatase gene transfer.</a> Hum Gene Ther. 28 (8), 626-638 (2017).</li>
<li>Aanonsen, L. M., Wilcox, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phencyclidine+selectively+blocks+a+spinal+action+of+N-methyl-D-aspartate+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Lett%22%5BJournal%5D)">Phencyclidine selectively blocks a spinal action of N-methyl-D-aspartate in mice.</a> Neurosci Lett. 67 (2), 191-197 (1986).</li>
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<li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AAV9%2FMFSD8+gene+therapy+is+effective+in+preclinical+models+of+neuronal+ceroid+lipofuscinosis+type+7+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">AAV9/MFSD8 gene therapy is effective in preclinical models of neuronal ceroid lipofuscinosis type 7 disease.</a> J Clin Invest. 132 (5), JCI146286(2022).</li>
<li>Karumuthil-Melethil, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrathecal+administration+of+AAV%2FGALC+vectors+in+10-11-day-old+twitcher+mice+improves+survival+and+is+enhanced+by+bone+marrow+transplant%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Intrathecal administration of AAV/GALC vectors in 10-11-day-old twitcher mice improves survival and is enhanced by bone marrow transplant.</a> J Neurosci Res. 94 (11), 1138-1151 (2016).</li>
<li>Ling, Q., Rioux, M., Hu, Y., Lee, M., Gray, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-associated+viral+vector+serotype+9-based+gene+replacement+therapy+for+SURF1-related+Leigh+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther+Methods+Clin+Dev%22%5BJournal%5D)">Adeno-associated viral vector serotype 9-based gene replacement therapy for SURF1-related Leigh syndrome.</a> Mol Ther Methods Clin Dev. 23, 158-168 (2021).</li>
<li>Sinnett, S. E., Boyle, E., Lyons, C., Gray, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+microRNA-based+regulatory+element+permits+safe+high-dose+miniMECP2+gene+therapy+in+Rett+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Engineered microRNA-based regulatory element permits safe high-dose miniMECP2 gene therapy in Rett mice.</a> Brain. 144 (10), 3005-3019 (2021).</li>
<li>Rahman, M. M., Lee, J. Y., Kim, Y. H., Park, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidural+and+Intrathecal+Drug+Delivery+in+Rats+and+Mice+for+Experimental+Research%3A+Fundamental+Concepts%2C+Techniques%2C+Precaution%2C+and+Application%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedicines%22%5BJournal%5D)">Epidural and Intrathecal Drug Delivery in Rats and Mice for Experimental Research: Fundamental Concepts, Techniques, Precaution, and Application.</a> Biomedicines. 11 (5), 11051413(2023).</li>
<li>Allen, C. H., Ward, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+evidence-based+approach+to+management+of+increased+intracranial+pressure%5BTitle%5D)+AND+%22Crit+Care+Clin%22%5BJournal%5D)">An evidence-based approach to management of increased intracranial pressure.</a> Crit Care Clin. 14 (3), 485-495 (1998).</li>
<li>Belov, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-volume+intrathecal+administrations%3A+Impact+on+CSF+pressure+and+safety+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Large-volume intrathecal administrations: Impact on CSF pressure and safety implications.</a> Front Neurosci. 15, 604197(2021).</li>
<li>Moazen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracranial+pressure+changes+during+mouse+development%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomech%22%5BJournal%5D)">Intracranial pressure changes during mouse development.</a> J Biomech. 49 (1), 123-126 (2016).</li>
<li>Rieselbach, R. E., Di Chiro, G., Freireich, E. J., Rall, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subarachnoid+distribution+of+drugs+after+lumbar+injection%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Subarachnoid distribution of drugs after lumbar injection.</a> N Engl J Med. 267, 1273-1278 (1962).</li>
<li>Pardridge, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CSF%2C+blood-brain+barrier%2C+and+brain+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin+Drug+Deliv%22%5BJournal%5D)">CSF, blood-brain barrier, and brain drug delivery.</a> Expert Opin Drug Deliv. 13 (7), 963-975 (2016).</li>
<li>Ghersi-Egea, J. F., Babikian, A., Blondel, S., Strazielle, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+the+cerebrospinal+fluid+circulatory+system+of+the+developing+rat%3A+quantitative+volumetric+analysis+and+effect+on+blood-CSF+permeability+interpretation%5BTitle%5D)+AND+%22Fluids+Barriers+CNS%22%5BJournal%5D)">Changes in the cerebrospinal fluid circulatory system of the developing rat: quantitative volumetric analysis and effect on blood-CSF permeability interpretation.</a> Fluids Barriers CNS. 12, 8(2015).</li>
</ol>

L’injection lombaire IT est une procédure rapide et peu invasive qui délivre de manière fiable un vecteur de thérapie génique dans le LCR pour le traitement des maladies du SNC 5,6. La procédure est pertinente sur le plan translationnel, et le protocole décrit ici détaille comment effectuer cette voie d’administration chez les souris et les rats de tous âges, des nouveau-nés aux adultes. Il est important de définir ce protocole pour les souris et les rats de tous âges, ainsi que de fournir des vidéos de soutien, afin d’aider les chercheurs dans l’adoption de cette méthode pour l’administration de la thérapie génique. L’expérience de notre laboratoire est que ce protocole peut être mis en œuvre de manière cohérente par plusieurs utilisateurs et études au fil du temps 18,25,26,27,28,29,30.
Il existe des différences importantes lors de l’injection lombaire chez les souris/rats plus jeunes par rapport aux souris/rats plus âgés, notamment l’angle auquel l’aiguille est insérée dans la colonne vertébrale et le volume recommandé qui est injecté. Les volumes d’injection lombaire d’IT rapportés varient considérablement d’une étude à l’autre et d’une espèce à l’autre31. Il est important de tenir compte du volume d’injection pour éviter des élévations durables de la pression intracrânienne (PIC), qui peuvent compromettre le flux de LCR et de sang cérébral, causer de l’inconfort et entraîner des complications neurologiques chroniques, notamment l’hydrocéphalie, l’ischémie, les lésions cellulaires et la mort32,33. L’ICP est déterminée par le volume du LCR, du sang cérébral et du tissu du SNC, qui ne peuvent pas être directement corrélés au poids corporel. Lors d’un fonctionnement normal, l’ICP est autorégulée par de nombreux facteurs, notamment le volume du LCR, le volume sanguin cérébral, la respiration, la position du corps, le taux de production du LCR et le taux de drainage du LCR dans le sang33,34. Les volumes d’injection d’IT doivent donc être déterminés sur la base des propriétés du LCR (tableau 1) au lieu du poids corporel 25,27,28,30. Les volumes recommandés à injecter à chaque âge chez chaque espèce sont indiqués en gras.
<table border="1" fo:font-size="8px" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="5">Volume d’injection informatique</td>
			<td colspan="4">Valeurs du LCR chez l’adulte</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>P0-1 (μL)</td>
			<td>P5-7 (μL)</td>
			<td>P10 (μL)</td>
			<td>&gt;P21 (μL)</td>
			<td>Volume total (μL)</td>
			<td>Taux de production (μL/min)</td>
			<td>Chiffre d’affaires (h)</td>
			<td>Pression intracrânienne (mm Hg)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Souris</td>
			<td>3</td>
			<td>5</td>
			<td>5 à 10</td>
			<td>5 à 20</td>
			<td>30-4025,30</td>
			<td>0,32 à 0,3525,30</td>
			<td>1,7-225,30</td>
			<td>5,0 +/- 0,528</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rats</td>
			<td>5</td>
			<td>5-10</td>
			<td>10-30</td>
			<td>10 à 200 (20 à 75)</td>
			<td>15025</td>
			<td>1,7 à 2,825</td>
			<td>2-2,6625</td>
			<td>8,6 +/- 1,7,27</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tableau 1 : Résumé des volumes d’injection lombaire de TI chez les souris et les rats à différents âges. Les valeurs audacieuses sont recommandées et ont été livrées en toute sécurité. Les volumes maximaux possibles n’ont pas été formellement évalués. Des informations supplémentaires sur les paramètres connus du LCR - volume total, taux de production, renouvellement et pression intracrânienne - chez les souris et les rats sont incluses à titre de référence.
Il y a un manque de connaissances dans le domaine concernant le seuil supérieur pour les volumes d’injection unique de bolus informatique. Chez les humains adultes, les rats et les souris où le volume du LCR est connu, une augmentation de 30 % du volume total du LCR ne semble pas causer de lésions ou de maladies chroniques 31,33,35,36. L’absence de volumes connus de LCR chez les souris juvéniles ou néonatales rend impossible une extrapolation similaire. Certains groupes commencent à s’intéresser au volume et à la production de LCR chez les jeunes animaux37. Jusqu’à ce que d’autres investigations dans ces domaines soient corroborées, le volume d’injection continuera d’être assujetti aux valeurs déclarées par les chercheurs.
Les souris et les rats, en particulier lorsqu’ils sont traités à un plus jeune âge ou avec des volumes d’injection élevés, peuvent provoquer une flexion des muscles, une extension des membres, une respiration rapide ou une paralysie temporaire des membres postérieurs qui devrait se résoudre d’elle-même en quelques minutes. Dans les cas extrêmes, les élévations aiguës de la PIC peuvent provoquer des anomalies cardiovasculaires et respiratoires, qui peuvent être mortelles32,33. Si des anomalies post-opératoires persistent après 24 heures, les souris et les rats doivent être retirés de l’étude et euthanasiés sans cruauté. Une paralysie persistante des membres postérieurs peut survenir si l’aiguille est insérée trop loin, ce qui a un impact sur la moelle épinière. Cela peut être dû à une erreur courante lors de l’injection lombaire IT : le mouvement de la seringue après le coup de queue tout en appuyant sur le piston. Le mouvement de la seringue et de l’aiguille doit être évité. Si la position correcte ne peut pas être obtenue avec la crevaison initiale, une deuxième tentative au même endroit peut être effectuée. Si la deuxième tentative échoue également, essayez de modifier la position de l’aiguille pour cibler l’espace intervertébral suivant. Notez que plusieurs piqûres d’aiguille peuvent entraîner une fuite d’une injection réussie par la suite.
Devenir compétent lors de l’injection lombaire peut prendre du temps. Pour pratiquer les injections en tant que procédure terminale, suivez le protocole ci-dessus en utilisant une solution de colorant approuvée, telle que le bleu Evans ou le colorant vert McCormick filtré à 0,2 micron (figure 3) ou avec les agents pharmacologiques abordés dans la section Résultats représentatifs. L’utilisation d’un colorant est recommandée pour dépanner et maîtriser l’injection, car il est facile de dire si une injection a été un succès ou un échec en 1 minute. La pratique avec le colorant ne concerne que les procédures de non-survie, car les animaux peuvent développer une réaction au colorant lorsqu’ils sont directement administrés au SNC. Cette réaction peut se produire dans la minute qui suit une injection réussie et se caractérise par des démangeaisons rapides et des mouvements de tortille. Les animaux doivent être euthanasiés immédiatement une fois que cette réaction est observée afin de minimiser l’inconfort. Après une injection réussie de colorant, le colorant restera localisé dans la colonne vertébrale (pas de colorant dans les tissus périphériques voisins) et remontera la colonne vertébrale jusqu’au cervelet, au cerveau et aux bulbes olfactifs. En P1, la peau est suffisamment transparente pour que l’on puisse voir le colorant descendre dans la colonne vertébrale de la queue. Si le colorant n’atteint pas le cerveau en quelques minutes, l’injection échoue.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67138/67138fig03.jpg"> 
Figure 3 : Colorant vert McCormick dans le cerveau après des injections lombaires réussies. Tous les cerveaux proviennent de souris P21 auxquelles on a injecté un colorant de 5 μL et sont représentés en vue ventrale. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67138/67138fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
Pour plus d’informations sur les paramètres associés pertinents pour la conception d’essais précliniques, tels que le titre viral et les doses, voir les revues précédemment publiées 3,6,31.

<table><tbody><tr><td>Filtre 0,2 micron</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td>67005</td><td>Utilisé pour filtrer la solution de colorant</td></tr><tr><td>0,5 à 10 & micro ; L Pipette</td><td>Eppendorf</td><td>TI13690026</td><td>Utilisée pour mesurer la solution d’injection</td></tr><tr><td>1,5 mL Microtube</td><td>Eppendorf</td><td>22364111</td><td>Utilisée pour stocker les solutions d’injection</td></tr><tr><td>10 & micro ; L Seringue</td><td>Hamilton</td><td>7635-01</td><td>Le volume d’injection ne doit pas être inférieur à 10 % de la capacité de la seringue</td></tr><tr><td>10 à 100 & micro ; L Pipette</td><td>Eppendorf</td><td>TI13690029</td><td>Utilisée pour mesurer la solution d’injection</td></tr><tr><td>10&micro ; l Pointes de pipette</td><td>USA Scientific Inc</td><td>11203810</td><td>Utilisé pour mesurer la solution d’injection</td></tr><tr><td>100 & micro ; L Seringue</td><td>Hamilton</td><td>7638-01</td><td>Pour rat >21 uniquement. Le volume d’injection ne doit pas être inférieur à 10 % de la capacité de la seringue</td></tr><tr><td>100 & micro ; L Pointes de pipette</td><td>USA Scientific Inc</td><td>11231840</td><td>Utilisé pour mesurer la solution d’injection</td></tr><tr><td>25 & micro ; L Seringue</td><td>Hamilton</td><td>7636-01</td><td>Idéal pour 5-10 & micro ; Injections en L. Le volume d’injection ne doit pas être inférieur à 10 % de la capacité de la seringue</td></tr><tr><td>Aiguille(s) de calibre 27Hamilton</td><td></td> <td>7803-01</td><td>Pour le rat >21 seulement. Calibre 27, Aiguille RN à petit moyeu, 1 po, style de pointe 4 à 12 °,</td></tr><tr><td>Aiguille(s) de calibre 6/PK 30Hamilton</td><td></td> <td>7803-17</td><td>Calibre 30, Aiguille RN à petit moyeu, 0,5 po, style de pointe 4 à 12 °, 6/PK</td></tr><tr><td>50 et micro ; L Seringue</td><td>Hamilton</td><td>7637-01</td><td>Pour rat >21 uniquement. Le volume d’injection ne doit pas être inférieur à 10 % de la capacité de la seringue</td></tr><tr><td>70 % Éthanol</td><td>Pharmco</td><td>111000140</td><td>Utilisé pour désinfecter l’espace de travail et l’équipement</td></tr><tr><td>Tampons de préparation à l’alcool isopropylique à 70 %</td><td>PDI</td><td>B60307</td><td>Utilisé pour préparer le site d’injection</td></tr><tr><td>Analgésique</td><td></td><td></td><td>Pour le rat >21 seulement.</td></tr><tr><td>Anesthésique (Isoflurane)</td><td>Piramal Soins intensifs</td><td>66794001725</td><td>Pour le rat >21 seulement.</td></tr><tr><td>Produits Betadine</td><td>Purdue</td><td>6906606</td><td>Pour rat >21 uniquement. Utilisé pour la préparation de la peau</td></tr><tr><td>Solution</td><td></td><td></td> de contrôle <td>Solution d’injection</td></tr><tr><td>Solution de colorant (vert)</td><td>McCormick</td><td></td><td>Pour la pratique, non-survie uniquement</td></tr><tr><td>Gants</td><td>Kimberly-Clark</td><td>19-149-863B</td><td>EPI</td></tr><tr><td>Seau à glace avec glace</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-395-150</td><td>Maintenir la solution de vecteur viral sur la glace&nbsp ;</td></tr><tr><td>Pince à moustiques (courbée ou droite)</td><td>Fine Science Tools</td><td>13009-12</td><td>Pour rat >21 uniquement. Utilisé pour palper l’espace intervertébral.</td></tr><tr><td>Porte-aiguilles</td><td>Fine Science Tools</td><td>12002-12</td><td>Pour rat >21 uniquement. Utilisé pour la fermeture de la peau avec suture</td></tr><tr><td>Essuie-tout</td><td>Berkshire</td><td>18-998-123</td><td>Utilisé pour retenir les souris adultes pendant l’injection</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>StatLab</td><td>PM996</td><td>Utilisé pour aspirer la solution dans la seringue</td></tr><tr><td>Écarteurs</td><td>Stoelting</td><td>52124P</td><td>Pour le rat >21 uniquement. Utilisé pour maintenir l’incision cutanée ouverte</td></tr><tr><td>Lame de scalpel</td><td>Outils de sciences fines</td><td>10015-00</td><td>Pour le rat >21 uniquement. Utilisé pour l’incision</td></tr><tr><td>Scalpel Lame Poignée</td><td>Outils scientifiques fins</td><td>10003-12</td><td>Pour rat >21 uniquement. Utilisé pour</td></tr><tr><td>l’incision Seringue stérile</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-955-459</td><td>Utilisé pour filtrer la solution de colorant</td></tr><tr><td>Gommage chirurgical (préparation de la peau)</td><td>Medline Industries Inc.</td><td>MDS098720</td><td>Pour rat >21 uniquement. Utilisé pour la préparation de la peau</td></tr><tr><td>Suture ou Clips de plaie</td><td>Stoelting</td><td>50483</td><td>Pour le rat >21 uniquement. Utilisé pour la fermeture de la peau.</td></tr><tr><td>Solution de nettoyage de seringue / aiguille</td><td>Hamilton</td><td>18311</td><td>Peut utiliser une solution de nettoyage alternative</td></tr><tr><td>Pince à pouce</td><td>Outils de science fine</td><td>11019-12</td><td>Pour rat >21 uniquement. Utilisé tout au long de l’approche chirurgicale et de la fermeture</td></tr><tr><td>Solution vectorielle</td><td></td><td></td><td>Solution d’injection</td></tr></tbody></table>

injection intrathécale lombaire de vecteurs de thérapie génique pour le ciblage du système nerveux central chez la souris et le rat

Lumbar Intrathecal Injection of Gene Therapy Vectors for Central Nervous System Targeting in Mice and Rats

Bien que de nombreux facteurs puissent influencer la transduction des vecteurs de thérapie génique, la coloration histologique des tissus reste la méthode la plus précise pour déterminer le succès des injections intrathécales lombaires (IT). Une distribution large et uniforme du vecteur de thérapie génique dans le système nerveux central (SNC) après l’injection est indicative de la réussite de la procédure. La figure 2C représente une injection réussie d’une thérapie génique auto-complémentaire médiée par AAV9 entraînant une faible expression transgénique ubiquitaire sous le promoteur JeT à une dose de 1,3 × 1011 vg/souris chez des souris néonatales (P1), 4 mois après l’injection. L’analyse par ARNASCOPE, à l’aide d’une sonde ciblant le transgène délivré par la thérapie génique, révèle une large distribution dans la moelle épinière lombaire, la moelle épinière cervicale et le cerveau. Une section du foie et du cœur est incluse pour souligner que, même avec une injection directe de liquide céphalo-rachidien (LCR), le vecteur de thérapie génique peut toujours être distribué aux tissus périphériques.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67138/67138fig02.jpg"> 
Figure 2 : Coupes de tissu coloré de 5 microns du SNC et du tissu périphérique de souris 4 mois après l’injection à P1. La coloration rouge indique l’expression du transgène via l’ARNASCOPE, et la contre-coloration bleue des noyaux se fait par l’hématoxyline. (A) Injection avec un tampon de formulation témoin. (B) Injection intraparenchymateuse infructueuse avec un vecteur AAV9 (scAAV9_JeT-hDDX3Xopt-SpA). (C) Injection lombaire réussie avec un vecteur AAV9 (scAAV9_JeT-hDDX3Xopt-SpA). Le vecteur de thérapie génique utilisé dans (B) et (C) a été administré à une dose pertinente sur le plan translationnel de 1,3E11 vg/souris. Barre d’échelle : panneau supérieur (5 mm) ; panneau inférieur (1 mm). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67138/67138fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
Une expression concentrée dans la moelle épinière lombaire associée à un manque d’expression dans le cerveau, comme le montre la figure 2B, peut indiquer une injection intraparenchymateuse de la moelle épinière et doit être considérée comme un échec de l’injection. Cela se produit lorsque l’aiguille est insérée trop loin dans la colonne vertébrale, au-delà de l’espace intrathécal et dans la moelle épinière. De plus, une expression très faible ou nulle dans la moelle épinière et le cerveau (non illustrée) doit également être considérée comme un échec de l’injection hors cible, en supposant qu’un vecteur et une dose sont utilisés là où une large distribution du SNC est attendue. Cela peut être dû au fait que l’aiguille n’est pas insérée assez loin ou qu’elle est latérale à la ligne médiane.
Les profils d’expression observés lors d’injections réussies peuvent différer en raison des huit facteurs suivants à titre d’exemple : (1) l’âge à l’injection, (2) l’immunité préexistante, (3) le débit de perfusion, (4) le vecteur de thérapie génique, (5) la dose de thérapie génique, (6) les protéines de surface cellulaire, (7) le tropisme et (8) le cas échéant, un choix de promoteur approprié pour stimuler l’expression du transgène6. Bien que les profils d’expression puissent différer, la distribution large, uniforme et généralisée sera universelle tant que la dose est suffisamment élevée avec un vecteur efficace, tel que l’AAV9.
Les principales limites de l’utilisation de l’analyse histologique pour confirmer le succès de l’injection lombaire sont les longs délais d’attente - attendre jusqu’à la fin d’une étude, après que les nécropsies ont été effectuées et que les tissus ont été prélevés - et les ressources importantes nécessaires pour traiter les tissus de toutes les souris dans une grande étude de thérapie génique. Malheureusement, notre expérience a montré que les indicateurs immédiats et directs d’une injection positive ou négative peuvent ne pas être fiables ; Cependant, le réflexe de battement de la queue lorsque l’aiguille pénètre dans l’espace intrathécal est un bon indicateur d’un positionnement réussi en temps réel et indique probablement une injection réussie. Ne confondez pas une contraction lorsque l’aiguille perce la peau d’une souris ou d’un rat non anesthésié avec une réponse de la queue à l’entrée de l’aiguille dans l’espace intrathécal. L’utilisation d’agents pharmacologiques tels que le NMDA, la substance P et la lidocaïne, soit en formation, soit mélangée à la solution d’injection expérimentale, a été signalée comme fournissant une indication plus immédiate du succès de l’injection 9,11,24. Si l’on considère ces agents, il est important d’évaluer leur compatibilité avec le vecteur de thérapie génique.

Injection intrathécale lombaire de vecteurs de thérapie génique pour le ciblage du système nerveux central chez la souris et le rat

One method to target the central nervous system for treating neurological diseases involves utilizing the lumbar intrathecal route of administration. This ...

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JoVE Journal

Neuroscience

Neurosciences

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Administration intrathécale d’un composé d’essai dans le système nerveux central du rat

Source : Li, D., et al. Injection intrathécale directe de virus adéno-associés recombinants chez des souris adultes. J. Vis. Exp. (2019)Cette vidéo montre la procédure d’injection intrathécale de virus adéno-associés (AAV) dans le liquide céphalo-rachidien (LCR) d’une souris éveillée, couvrant la préparation de la seringue, l’alignement de la colonne vertébrale et l’insertion précise de l’aiguille. Cette méthode valide l’administration ciblée de gènes, soutenant ainsi son potentiel pour les...

Administration intrathécale de virus dans un modèle murin pour le traitement de maladies du système nerveux central

Les vecteurs viraux permettent une manipulation du gène ciblé. Nous démontrons une méthode pour l'expression génique conditionnelle ou l'ablation de la moelle épinière de souris, par injection stéréotaxique d'un vecteur viral dans la corne dorsale, un important site de contact synaptique entre les afférences somesthésiques primaires et les neurones du système nerveux central.

Injection stéréotaxique d&#39;un vecteur viral pour la manipulation génétique conditionnelle dans la moelle épinière de souris

Ce rapport décrit une technique simple et rapide de intrathécale ponction à l'aiguille pour une transfection de siRNA localisée dans la moelle épinière lombaire chez la souris sous anesthésie de courte durée de lumière durable.

In Vivo transfection de siRNA et Gene Knockdown dans la moelle épinière via rapide non invasive lombaire intrathécale injections chez des souris

Nous présentons une technique d’injection intrathécale directe à l’aide de chlorhydrate de lidocaïne 1 % dans une solution virale pour assurer une prestation efficace virus adeno-associé à de petits animaux et de mettre en place un système de notation pour prédire l’efficacité de la transduction du central système nerveux selon le degré de faiblesse transitoire induit par la lidocaïne.

Direct Injection intrathécale de Recombinant Adeno-associated virus chez la souris adulte

Ce protocole montre l’injection d’un vecteur viral marqués transportable dans les tissus de la moelle épinière de rat. Le vecteur est absorbé au niveau de la synapse et transporté vers le corps cellulaire des neurones de la cible. Ce modèle convient pour un traçage rétrograde des voies importantes de la colonne vertébrale ou ciblage des cellules pour des applications de la thérapie génique.

Injection directe d’un vecteur Lentiviral met en évidence plusieurs voies motrices de la moelle épinière de Rat

Ici, nous décrivons une méthode pour livrer des drogues au système nerveux central de rat en implantant un cathéter dans l'espace intrathécal lombaire de la colonne vertébrale. Nous nous concentrons sur la livraison des oligonucléotides d'antisens, bien que cette méthode soit appropriée pour la livraison d'autres modalités thérapeutiques aussi bien.

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Une intervention chirurgicale est décrite pour effectuer des injections dans la citerne lombaire du rat juvénile. Cette approche a été utilisée pour l’administration intrathécale de vecteurs de thérapie génique, mais on s’attend à ce qu’elle puisse être utilisée pour une variété de traitements, y compris les cellules et les médicaments.

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Cet article détaille les méthodes d’administration intrathécalienne pour les traitements ciblant le SNC chez les souris adultes, en mettant l’accent sur la précision des protocoles et la possibilité d’injections répétées. Il inclut les résultats d’une étude de validation où les oligonucléotides antisens ont réduit l’expression mutante de SOD1 chez des souris modèles SOD1-SLA, soutenant l’utilité de cette approche dans la recherche préclinique sur les maladies neurodégénératives.

Injection intrathécalale lombaire de SOD1-ASO pour un ciblage précis du SNC et une efficacité prédictive chez les souris ALS humaines SOD1-G93A

Cet article décrit une séquence d'événements optimisé pour l'imagerie multimodale de greffons cellulaires dans le cerveau des rongeurs en utilisant: (i) de la bioluminescence in vivo et l'imagerie par résonance magnétique, et (ii) post mortem analyse histologique. La combinaison de ces modalités d'imagerie sur un seul animal permet cellulaire d'évaluation du greffon avec une résolution, la sensibilité et une spécificité élevées.

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Découvrez la technique d'injection intrathécale lombaire pour administrer des vecteurs de thérapie génique chez la souris et le rat. Cette méthode permet une distribution efficace dans le système nerveux central pour les études précliniques.

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Injection intrathécale lombaire de vecteurs de thérapie génique pour le ciblage du système nerveux central chez la souris et le rat

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