Name: Visualisation in vivo des transitoires calciques pendant la fécondation et le développement précoce chez C. elegans (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-07-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 11 s
Description: Découvrez la visualisation des transitoires calciques lors de la fécondation et du développement précoce chez C. elegans avec le rapporteur CaFE. Cette méthode révèle des ondes calciques retardées et facilite l'étude de la signalisation cellulaire embryonnaire.

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<meta charset="utf8"></head><body>Suivi du calcium dans les premières phases de développement de C. elegans

<ol><li>Stein, P., Savy, V., Williams, A. M., Williams, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulators+of+calcium+signalling+at+fertilization%5BTitle%5D)+AND+%22Open+Biol%22%5BJournal%5D)">Modulators of calcium signalling at fertilization.</a> Open Biol. 10 (7), 200118(2020).</li>
<li>McAvey, B. A., Wortzman, G. B., Williams, C. J., Evans, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+calcium+signaling+and+the+actin+cytoskeleton+in+the+membrane+block+to+polyspermy+in+mouse+eggs%5BTitle%5D)+AND+%22Biolo+Reprod%22%5BJournal%5D)">Involvement of calcium signaling and the actin cytoskeleton in the membrane block to polyspermy in mouse eggs.</a> Biolo Reprod. 67 (4), 1342-1352 (2002).</li>
<li>Takayama, J., Onami, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+sperm+TRP-3+channel+mediates+the+onset+of+a+Ca+2%2B+wave+in+the+fertilized+C.+elegans+oocyte%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">The sperm TRP-3 channel mediates the onset of a Ca 2+ wave in the fertilized C. elegans oocyte.</a> Cell Rep. 15 (3), 625-637 (2016).</li>
<li>Yamamoto, I., Kosinski, M. E., Greenstein, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Start+me+up%3A+Cell+signaling+and+the+journey+from+oocyte+to+embryo+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Start me up: Cell signaling and the journey from oocyte to embryo in C. elegans.</a> Dev Dyn. 235 (3), 571-585 (2006).</li>
<li>Hubbard, E. J. A., Greenstein, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Caenorhabditis+elegans+gonad%3A+A+test+tube+for+cell+and+developmental+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">The Caenorhabditis elegans gonad: A test tube for cell and developmental biology.</a> Dev Dyn. 218 (1), 2-22 (2000).</li>
<li>Korta, D. Z., Hubbard, E. J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soma-germline+interactions+that+influence+germline+proliferation+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Soma-germline interactions that influence germline proliferation in Caenorhabditis elegans.</a> Dev Dyn. 239 (5), 1449-1459 (2010).</li>
<li>Toperzer, K. M., Brennan, S. J., Carroll, D. J., Guisbert, E. A., Kim Guisbert,, S, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+the+biphasic+calcium+wave+during+fertilization+in+Caenorhabditis+elegans+using+a+genetically+encoded+calcium+indicator%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Open%22%5BJournal%5D)">Visualization of the biphasic calcium wave during fertilization in Caenorhabditis elegans using a genetically encoded calcium indicator.</a> Biol Open. 12 (9), 059832(2023).</li>
<li>Samuel, A. D., Murthy, V. N., Hengartner, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+dynamics+during+fertilization+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Calcium dynamics during fertilization in C. elegans.</a> BMC Dev Biol. 1 (1), 8(2001).</li>
<li>Dana, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-performance+calcium+sensors+for+imaging+activity+in+neuronal+populations+and+microcompartments%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">High-performance calcium sensors for imaging activity in neuronal populations and microcompartments.</a> Nat Methods. 16 (7), 649-657 (2019).</li>
<li>Golden, N. L., Plagens, R. N., Kim Guisbert, K. S., Guisbert, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardized+methods+for+measuring+induction+of+the+heat+shock+response+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Standardized methods for measuring induction of the heat shock response in Caenorhabditis elegans.</a> J Vis Exp. (161), e61030(2020).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Kamath, R., Ahringer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+RNAi+screening+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Genome-wide RNAi screening in Caenorhabditis elegans.</a> Methods. 30 (4), 313-321 (2003).</li>
<li>Kachur, T. M., Audhya, A., Pilgrim, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UNC-45+is+required+for+NMY-2+contractile+function+in+early+embryonic+polarity+establishment+and+germline+cellularization+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">UNC-45 is required for NMY-2 contractile function in early embryonic polarity establishment and germline cellularization in C. elegans.</a> Dev Biol. 314 (2), 287-299 (2008).</li>
<li>Takayama, J., Fujita, M., Onami, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+live+imaging+of+calcium+waves+and+other+cellular+processes+during+fertilization+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Bio+Protoc%22%5BJournal%5D)">In vivo live imaging of calcium waves and other cellular processes during fertilization in Caenorhabditis elegans.</a> Bio Protoc. 7 (7), e2205(2017).</li>
<li>Fire, A., Xu, S., Montgomery, M. K., Kostas, S. A., Driver, S. E., Mello, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potent+and+specific+genetic+interference+by+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).</li>
<li>Conte, D., MacNeil, L. T., Walhout, A. J. M., Mello, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+Interference+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">RNA Interference in Caenorhabditis elegans.</a> Curr Protoc Mol Biol. 109, 1-30 (2015).</li>
<li>Kamath, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+functional+analysis+of+the+Caenorhabditis+elegans+genome+using+RNAi%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi.</a> Nature. 421 (6920), 231-237 (2003).</li>
<li>Reboul, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((elegans+ORFeome+version+1.1%3A+experimental+verification+of+the+genome+annotation+and+resource+for+proteome-scale+protein+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">elegans ORFeome version 1.1: experimental verification of the genome annotation and resource for proteome-scale protein expression.</a> Nat Genet. 34 (1), 35-41 (2003).</li>
<li>Bui, Y. K., Sternberg, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+inositol+5-phosphatase+homolog+negatively+regulates+inositol+1%2C4%2C5-triphosphate+signaling+in+ovulation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans inositol 5-phosphatase homolog negatively regulates inositol 1,4,5-triphosphate signaling in ovulation.</a> Mol Biol Cell. 13 (5), 1641-1651 (2002).</li>
<li>Muto, A., Kume, S., Inoue, T., Okano, H., Mikoshiba, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+waves+along+the+cleavage+furrows+in+cleavage-stage+Xenopus+embryos+and+its+inhibition+by+heparin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Calcium waves along the cleavage furrows in cleavage-stage Xenopus embryos and its inhibition by heparin.</a> J Cell Biol. 135 (1), 181-190 (1996).</li>
<li>Paudel, S., Sindelar, R., Saha, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+signaling+in+vertebrate+development+and+its+role+in+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Calcium signaling in vertebrate development and its role in disease.</a> Int J Mol Sci. 19 (11), 3390(2018).</li>
<li>Paudel, S., Yue, M., Nalamalapu, R., Saha, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deciphering+the+calcium+code%3A+A+review+of+calcium+activity+analysis+methods+employed+to+identify+meaningful+activity+in+early+neural+development%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecules%22%5BJournal%5D)">Deciphering the calcium code: A review of calcium activity analysis methods employed to identify meaningful activity in early neural development.</a> Biomolecules. 14 (1), 138(2024).</li>
<li>Goldstein, B., Hird, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specification+of+the+anteroposterior+axis+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Specification of the anteroposterior axis in Caenorhabditis elegans.</a> Development. 122 (5), 1467-1474 (1996).</li>
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<li>Stevenson, Z. C., Moerdyk-Schauwecker, M. J., Jamison, B., Phillips, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+self-selecting+and+clone-free+integration+of+transgenes+into+engineered+CRISPR+safe+harbor+locations+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22G3%22%5BJournal%5D)">Rapid self-selecting and clone-free integration of transgenes into engineered CRISPR safe harbor locations in Caenorhabditis elegans.</a> G3. 10 (10), Bethesda. 3775-3782 (2020).</li>
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<li>Webb, S. E., Miller, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+signalling+during+zebrafish+embryonic+development%5BTitle%5D)+AND+%22BioEssays%22%5BJournal%5D)">Calcium signalling during zebrafish embryonic development.</a> BioEssays. 22 (2), 113-123 (2000).</li>
<li>Wiseman, E., Carroll, D. J., Fowler, S. R., Guisbert, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iteration+in+an+inquiry-based+undergraduate+laboratory+strengthens+student+engagement+and+incorporation+of+scientific+skills%5BTitle%5D)+AND+%22J+Scholarsh+Teach+Learn%22%5BJournal%5D)">Iteration in an inquiry-based undergraduate laboratory strengthens student engagement and incorporation of scientific skills.</a> J Scholarsh Teach Learn. 20 (2), 99-112 (2020).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Agar</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0140-07-4</td><td>2 kg ; La poudre se dissout plus facilement que les flocons</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>MidSci</td><td>BE-A125</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Lampe à alcool</td><td>Fisher Scientific</td><td>S13475</td><td>Utilisation avec 95 % d’éthanol</td></tr><tr><td>Chlorure d’ammonium (NH4Cl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>AAA1500030</td><td>250 g</td></tr><tr><td>Ampicilline</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1760-5</td><td>5 g</td></tr><tr><td>AMSCO 400 Series Petit stérilisateur à vapeur</td><td>Steris Soins de santé</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Bacto-peptone</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1420-500</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Bacto-tryptone</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0123-17-3</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Chlorure de calcium (CaCl2)</td><td>Fisher Scientific</td><td>C69-500</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Cholestérol</td><td>Thermo Scientific</td><td>A11470.18</td><td>50 g</td></tr><tr><td>Dragonfly 200 disque rotatif confocal</td><td>Oxford Instruments Andor</td><td>N/A</td><td>Utilisé avec le microscope Leica</td></tr><tr><td>Lames de microscope Fisherbrand Superfrost Cytogenics Fisher</td><td>Scientific</td><td>22-035-900</td><td>144 lames par paquet</td></tr><tr><td>Pince à bec plat, mâchoire lisse</td><td>Home Depot</td><td>305530604</td><td>Assurez-vous que les pinces sont à mâchoire lisse</td></tr><tr><td>Isopropyle &beta ;- d-1-thiogalactopyranoside&nbsp ;( IPTG)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1755-10</td><td>10 g ; sans dioxane</td></tr><tr><td>Ruban de laboratoire</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-901-10R</td><td>Le ruban de 0,5 pouce est utilisé pour coller les lames de microscope</td></tr><tr><td>Lévamisole</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC187870100</td><td>10 g</td></tr><tr><td>Sulfate de magnésium (MgSO4)</td><td>Fisher Scientific</td><td>M63-500</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Verre de protection de microscope</td><td>Fisher Scientific</td><td>12541016</td><td>paquet de 1 oz</td></tr><tr><td>Nikon ECLIPSE Ti2 balayage laser confocal</td><td>Nikon</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Nikon NIS Elements logiciel</td><td>Nikon</td><td>N/A</td><td>Confocal</td></tr><tr><td>OP50 Escherichia coli</td><td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td><td>OP50</td><td></td></tr><tr><td>Platinum Wire</td><td>TriTech</td><td>PT-9010</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate de potassium dibasique (K2HPO4)</td><td>Fisher Scientific</td><td>P288-500</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Phosphate de potassium monobasique (KH2PO4)</td><td>Fisher Scientific</td><td>AA1159436</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Chlorure de sodium (NaCl)</td><td>Fisher</td><td>Scientific S271-500 500</td><td>g</td></tr><tr><td>Phosphate de sodium dibasique heptahydraté (Na2HPO4)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S471-3</td><td>3 kg</td></tr><tr><td>Stéréomicroscope</td><td>Leica</td><td>KL300 LED</td><td></td></tr><tr><td>Pétri stérile parabole (35 mm x 10 mm)</td><td>CellTreat</td><td>229638</td><td>960 boîtes de Pétri par caisse</td></tr><tr><td>Boîte de Pétri stérile (60 mm x 15 mm)</td><td>CellTreat</td><td>229665</td><td>500 boîtes de Pétri par caisse</td></tr><tr><td>Souche EAG16 spn-4p ::jGCaMP7s ::p ie-1u</td><td>Centre de génétique Caenorhabditis (CGC)</td><td>EAG16</td><td>Créé par Kim Guisbert</td></tr><tr><td>Lab Souche EAG25 spn-4p ::jGCaMP7s :: tarte-1u ; ujIs113 II.Centre</td> de <td>Génétique de Caenorhabditis (CGC)</td><td>EAG25</td><td>Créé par Kim Guisbert Souche de laboratoire</td></tr><tr><td>EAG28 spn-4p ::jGCaMP7s ::p ie-1u ; unc-119(ed3) III ; ltIs44 V.</td><td>Centre de Génétique de Caenorhabditis (CGC)</td><td>EAG28</td><td>Créé par Kim Guisbert Souche</td></tr><tr><td>de laboratoire JIM113 ujIs113 II [pie-1p ::mCherry ::H2B ::p ie-1 3'UTR + nhr-2p :: his-24 ::mCherry ::let-858 3'UTR + unc-119(+)]</td><td>Centre de Génétique de Caenorhabditis (CGC)</td><td>JIM113</td><td>Créé par E. Preston - Murray Lab</td></tr><tr><td>Souche OD70 unc-119(ed3) III ; ltIs44 V [pie-1p ::mCherry ::P H(PLC1delta1) + unc-119(+)]</td><td>Centre de Génétique de Caenorhabditis (CGC)</td><td>OD70</td><td>Créé par Audhya/Oegema - Greenstein Lab</td></tr><tr><td>Tritech Poignée de Pic</td><td>TriTech</td><td>TWPH1</td><td></td></tr><tr><td>Extrait de levure</td><td>IBI Scientific</td><td>IB49160</td><td>500 g</td></tr></tbody></table>

visualisation in vivo des transitoires calciques pendant la fécondation et le développement précoce chez c. elegans

In Vivo Visualization of Calcium Transients during Fertilization and Early Development in C. elegans

En utilisant les protocoles décrits dans ce manuscrit, les modèles dynamiques de signalisation calcique dans la fécondation et l’embryogenèse ont été observés chez C. elegans.
La figure 2 montre une séquence de fécondation typique chez les vers contenant le rapporteur CaFE. Pour faciliter l’analyse, la souche EAG28 a été utilisée, qui combine le rapporteur CaFE avec un transgène13 du domaine d’homologie de la pleckstrine (PH-mCherry). Le marqueur PH-mCherry se localise dans la membrane plasmique et permet de visualiser plus facilement les limites cellulaires, en particulier dans le bras gonadique. La souche EAG28 a été créée en croisant la souche EAG16 contenant le rapporteur CaFE avec la souchedéclarante OD70 PH-mCherry 13. Chez C. elegans, l’ovulation et la fécondation se produisent simultanément. Le temps 0 de la fécondation est considéré comme la première image où un signal de fluorescence est détecté dans l’ovocyte en ovulation (Figure 2). Une brillante poussée de fluorescence se produit sur le site de fusion des spermatozoïdes dès que le bord d’attaque de l’ovocyte pénètre dans la spermathèque, l’organe de stockage des spermatozoïdes7. Le signal apparaît avant la fin de l’ovulation. L’onde calcique est biphasique, avec une poussée initiale rapide suivie d’une onde de fluorescence du point d’entrée vers le pôle opposé. L’ovocyte entier devient fluorescent en &lt;30 s.
Notez que le rapporteur CaFE est en une seule copie, et que, par conséquent, le signal n’est pas aussi brillant que celui des autres transgènes. Le time-lapse Z-stack n’est pas recommandé pendant l’ovulation à moins qu’un disque confocal rotatif ne soit disponible et optimisé. Des images de la pile Z peuvent être obtenues avant ou après un film pour capturer les changements 3D de la morphologie des gonades. Bien que les images ici aient été prises avec un microscope confocal, les transitoires ont également été observés à l’aide de la microscopie à fluorescence à grand champ, qui est plus courante et abordable que la microscopie confocale. En utilisant un confocal à balayage laser, la fréquence d’images est d’environ 1 ips. À l’aide d’un disque confocal rotatif, la fréquence d’images est de 10 ips ou plus. Le signal de fond du rapporteur CaFE est suffisant pour éclairer les ovocytes en maturation dans le bras gonadique. Lors de la fécondation, une augmentation de 1,5 à 2 fois de l’intensité du signal GFP est généralement observée.
Plusieurs méthodes alternatives de quantification existent. Par exemple, le logiciel d’analyse d’images Imaris, créé par Oxford Instruments (la même société mère que le microscope confocal à disque rotatif Andor Dragonfly), a la capacité de quantifier le signal dans chaque image à partir de l’ovocyte en transit uniquement au lieu d’un retour sur investissement plus important. Cependant, le logiciel Imaris n’est pas gratuit. De plus, une stratégie d’analyse d’images détaillée pour mesurer les ondes calciques dans l’ovocyte a été décrite en détail par Takayama, Fujita et Onami et utilise ImageJ, qui est disponible gratuitement14. Alternativement, les kymographes pour illustrer l’onde du signal fluorescent à travers un seul ovocyte nécessitent une manipulation d’image plus étendue que celle décrite ici, mais sont décrites dans Takayama et Onami3.
Un avantage distinct de C. elegans est sa capacité à inhiber l’expression de presque tous les gènes en nourrissant les bactéries du ver exprimant l’ARNdb pour déclencher l’ARNi endogène15,16. Pour une expression optimale de l’ARNdb, les plaques d’ARNi et la culture d’ARNi saturée contiennent de l’IPTG. L’ARNdb est produit en exprimant le gène d’intérêt avec des promoteurs flanquants. Ici, nous avons utilisé la bibliothèque Ahringer qui cible la majeure partie du génome du ver grâce à l’utilisation de 16 256 souches bactériennes17. Alternativement, un ORFeome de ~11 000 clones d’ARNi a été créé par le laboratoire Vidal à l’aide du système Gateway et est disponible à l’achat via Horizon Discovery18.
Pour démontrer l’utilité du rapporteur CaFE en combinaison avec l’ARNi, nous avons examiné l’ovulation prématurée. Une délétion partielle dans ipp-5 induit un double événement d’ovulation où l’ovocyte -1 et l’ovocyte -2 pénètrent dans la spermathèque au cours de la même ovulation19. L’IPP-5 est une phosphatase qui agit sur IP3 et diminue efficacement les niveaux du deuxième messager IP3. Nous avons constaté que l’inactivation de l’ARNi d’ipp-5 provoque un phénotype de double ovulation similaire à celui du mutant.
L’analyse du rapporteur CaFE pendant la double ovulation induite par l’inactivation de l’ARNi ipp-5 a révélé de nouveaux aspects de l’OET. Tout d’abord, un signal calcique a été observé immédiatement lors de l’entrée dans la spermathèque dans l’ovocyte de tête -1 mais pas dans l’ovocyte de queue -2 (Figure 3). Bien que 2 ovocytes soient ovulés, l’ovocyte -1 reste le seul ovocyte qui montre des signes de bonne maturation, en particulier la rupture de l’enveloppe nucléaire (NEBD). Ces données suggèrent que même si l’ovocyte -2 est en présence de spermatozoïdes, il n’est pas apte à être fécondé car il n’a pas encore atteint sa bonne maturité. Deuxièmement, l’ovocyte -2 présente une onde calcique retardée, généralement lorsque l’ovocyte sort de la spermathèque pour l’utérus. Bien que la maturation de l’ovocyte soit normalement une condition préalable à l’ovulation, ces données suggèrent que la maturation de l’ovocyte et la compétence pour la fécondation peuvent encore se produire après l’ovulation. La visualisation de l’onde calcique retardée lors de l’inactivation d’ipp-5 met en évidence les avantages du rapporteur CaFE pour interroger la compétence et le moment de la fécondation.
De plus, nous avons découvert que le rapporteur CaFE est détectable dans les œufs pondus et révèle des transitoires calciques unicellulaires au cours de l’embryogenèse précoce chez C. elegans. Embryons d’EAG28 adultes synchronisés du jour 1 (CaFE ; PH-mCherry) ont été imagés à l’aide des protocoles des sections 1 à 5 avec le disque rotatif Andor Dragonfly confocal à l’aide de la caméra Zyla (Figure 4). Les transitoires calciques sont confinés dans des cellules uniques et prennent moins de temps que l’onde calcique de fécondation (~9 s, n = 11). Cependant, l’onde calcique au cours de l’embryogenèse ne semble pas être biphasique. Les transitoires calciques n’ont pas été observés avant le stade 8 cellules. Notamment, le calcium ne se localise pas dans le sillon de clivage chez C. elegans, comme on le voit dans de nombreux autres organismes, y compris les humains et le xénope 20,21,22. Des transitoires calciques unicellulaires ont été observés bien après la gastrulation (~200 min après la fécondation) et dans les œufs pondus. Un seul embryon présente plusieurs transitoires calciques au fil du temps, mais dans différentes cellules et généralement une cellule à la fois. Notez qu’une exposition continue à la stimulation laser endommagera les embryons. Une puissance LED/laser plus faible ou une exposition discontinue est recommandée. Cependant, comme les ondes calciques sont relativement courtes à ~9 s, nous ne recommandons pas une stimulation plus lente de 2 s entre les événements de stimulation LED/laser.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67141/67141fig01.jpg"> 
Figure 1 : Bras de la gonade de C. elegans. Image d’un bras gonadique de la souche de ver EAG25, montrant le rapporteur CaFE GFP (vert) et le marqueur d’histone 2B-mCherry (rouge), qui met en évidence les noyaux dans la lignée germinale. L’ovocyte proximal est désigné par le -1 directement avant les spermathèques, où les spermatozoïdes sont stockés (flèche). L’embryon situé le plus près de la spermathèque mais à l’intérieur de l’utérus est l’embryon le plus récent. L’image a été prise à l’aide du confocal à balayage laser Nikon ECLIPSE Ti2. Barre d’échelle = 20 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67141/67141fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67141/67141fig02.jpg"> 
Figure 2 : Visualisation de l’onde calcique pendant la fécondation. Images chronologiques de la fluorescence reflétant le calcium intracellulaire pendant la fécondation dans la souche de ver EAG28. La souche EAG28 contient à la fois le rapporteur CaFE (vert) et une fusion mCherry (jaune) dans le domaine d’homologie de la pleckstrine, qui met en évidence les membranes plasmiques. Le temps 0 indique la première image représentant une nette augmentation du signal fluorescent dans l’ovocyte. Le temps 24,4 s reflète la première image montrant la fluorescence de l’ovocyte entier. Des images de séries temporelles ont été prises à l’aide du disque rotatif Andor Dragonfly confocal avec une caméra Zyla. Barre d’échelle = 20 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67141/67141fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67141/67141fig03.jpg"> 
Figure 3 : Ondes calciques lors d’une double ovulation induite par l’ARNi ipp-5. Images en accéléré d’ondes calciques séquentielles de l’ovocyte -1 et de l’ovocyte -2 dans une souche EAG16 (CaFE en vert GFP) exposée à l’ARNi ipp-5. Le cadre -40,0 s comprend des étiquettes pour l’ovocyte -1 (-1), l’ovocyte -2 (-2), la spermathèque (*) et l’embryon +1 (+1). Le temps 0 s montre l’augmentation initiale de la fluorescence de l’onde calcique de l’ovocyte -1. Le temps 4,5 s montre que l’onde calcique se propage vers le pôle opposé dans l’ovocyte -1. Le temps de 70,5 s affiche la fluorescence de la cellule entière dans l’ovocyte -1 accompagné de l’ovocyte -2 au signal GFP de base ; Les deux ovocytes se trouvent dans la spermathèque. L’ovocyte fécondé -1 et l’ovocyte -2 non fécondé pénètrent dans l’utérus à l’heure 158,3 s. À 219,3 s, l’ovocyte -2 présente une onde calcique fluorescente tardive. Les images ont été prises à l’aide du disque rotatif Andor Dragonfly confocal avec une caméra Zyla. Barre d’échelle = 30 μM <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67141/67141fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67141/67141fig04.jpg"> 
Figure 4 : Transitoires calciques unicellulaires au début de l’embryogenèse. (A) Les embryons in utero et (B) ex utero (œuf pondu) ont présenté un signal fluorescent dans une seule cellule pendant l’embryogenèse. Les images ont été prises à l’aide du disque rotatif Andor Dragonfly confocal avec une caméra Zyla. Barre d’échelle = 20 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67141/67141fig04large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>

Visualisation in vivo des transitoires calciques pendant la fécondation et le développement précoce chez C. elegans

Calcium is an important signaling molecule during the oocyte-to-embryo transition (OET) and early embryogenesis. The hermaphroditic nematode ...

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