Visualisation in vivo des transitoires calciques pendant la fécondation et le développement précoce chez C. elegans

La production d’embryons viables est un processus complexe. Notre objectif global est de définir les signaux cellulaires qui coordonnent le passage d’un ovocyte à un embryon. Le rapporteur CaFE est un nouvel outil développé pour visualiser les signaux calciques qui se produisent lors de la fécondation et au cours de l’embryogenèse précoce.

En utilisant le rapporteur CaFE, nous avons découvert une onde calcique retardée dans les ovocytes qui sont ovulés prématurément. Nous avons également découvert la présence de transitoires calciques unicellulaires au cours de l’embryogenèse précoce. Les deux résultats illustrent l’utilité d’un indicateur de calcium génétiquement codé au cours du développement précoce.

Les techniques précédentes pour visualiser les ovocytes de calcium reposaient sur l’injection de colorant dans la gonade. Cette technique demande beaucoup de main-d’œuvre et nécessite un équipement de micro-injection spécialisé. Le rapporteur CaFE permet de visualiser facilement l’onde calcique dans les ovocytes et les embryons avec un équipement largement disponible.

Le CaFE Reporter facilite l’étude du moment et de la régulation de la signalisation calcique dans les ovocytes et les embryons. Ce rapporteur peut être facilement combiné avec des mutants, des marqueurs et des inactivations d’ARNi existants pour découvrir le comportement du calcium par rapport à d’autres événements marquants au cours de l’embryogenèse précoce, tels que la maturation myotique. Pour commencer, tenez la poignée du pic à vis sans fin et desserrez le collier argenté vers sa tête afin que les quatre sections se séparent.

Placez un fil de platine de 1,5 pouce au milieu des quatre sections. Tenez le fil au centre tout en serrant le collier pour rapprocher les quatre sections. À l’aide d’une paire de pinces à bec plat, façonnez soigneusement le fil et fixez à plusieurs reprises l’extrémité du fil pour créer un pied d’environ deux à trois millimètres.

Utilisez ce pied pour ramasser les vers. Préparez une solution d’agarose à 3 % dans l’eau et chauffez-la au micro-ondes jusqu’à ce que l’agarose se dissolve complètement. Placez une lame de microscope vierge entre deux autres lames de microscope dotées d’une seule couche de ruban adhésif de laboratoire sur l’axe long.

À l’aide d’une pipette d’un millilitre, déposer la solution d’agarose chauffée à 3 % au centre de la lame blanche. Placez rapidement une nouvelle lame de microscope sur la gouttelette d’agarose, perpendiculairement à la lame vierge, avec la gouttelette reposant sur les lames collées adjacentes, puis séparez doucement les lames, en gardant le tampon intact. À l’aide d’une pipette de 20 microlitres, ajoutez une petite goutte de lévamisole d’un millimolaire dans un tampon M9 au centre du tampon d’agarose pour paralyser les vers.

Choisissez au moins cinq vers synchronisés et touchez doucement le pied de la poignée du pic à vis vers la gouttelette de lévamisole pour transférer les vers. Couvrez soigneusement le tampon d’agarose avec une lamelle. Vérifiez l’emplacement des vers, car la lamelle peut provoquer la dispersion des vers.

Étiquetez la lame de microscope avec les détails appropriés, tels que le nom de la souche de ver. Localisez les vers à l’aide d’un objectif de faible puissance sur le microscope à l’aide d’un éclairage en fond clair. Utilisez un objectif d’air d’au moins 20x ou un objectif d’immersion de 40x pour visualiser clairement l’onde calcique dans les ovocytes.

Pour une visualisation optimale des rapporteurs fluorescents, ajustez le gain ou le temps d’exposition pour les canaux GFP et RFP. Examinez chaque ovocyte moins un dans les bras gonades du ver pour déterminer si un événement de fécondation est imminent. Après la rupture de l’enveloppe nucléaire, le cytosquelette de l’ovocyte moins un le plus proximal se réorganise, prend un aspect arrondi et se sépare de l’ovocyte moins deux.

Lorsque l’ovulation est imminente, commencez immédiatement à enregistrer la vidéo dans un champ large. L’ovocyte proximal est désigné par le moins un directement avant la spermathèque, où les spermatozoïdes sont stockés. L’embryon le plus récent est situé le plus près de la spermathèque, mais à l’intérieur de l’utérus.

L’onde calcique présentait un motif biphasique, commençant par une rafale rapide suivie d’une onde de fluorescence se déplaçant du point d’entrée vers le pôle opposé. Un signal calcique a été observé immédiatement lors de l’entrée dans la spermathèque dans l’ovocyte principal moins un, mais pas dans l’ovocyte arrière moins deux. Les embryons in utero et ex-utero ont montré un signal de fluorescence dans une seule cellule pendant l’embryogenèse.