Name: Développement et application de tyrosine phosphatases régulées par la rapamycine (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-06T14:10:00.000+00:00
Duration: 6 min 56 s
Description: Découvrez le développement d'un système régulé par la rapamycine pour contrôler l'activité des tyrosine phosphatases dans les cellules HEK-293T. Cette méthode permet d'étudier les mécanismes de signalisation cellulaire avec une régulation temporelle précise.

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<meta charset="utf8"></head><body>Régulation temporelle de l’activité de la phosphatase avec le système régulé par la rapamycine

<ol><li>Amin, A. R. M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SHP-2+tyrosine+phosphatase+inhibits+p73-dependent+apoptosis+and+expression+of+a+subset+of+p53+target+genes+induced+by+EGCG%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">SHP-2 tyrosine phosphatase inhibits p73-dependent apoptosis and expression of a subset of p53 target genes induced by EGCG.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (13), 5419-5424 (2007).</li>
<li>Niogret, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shp-2+is+critical+for+ERK+and+metabolic+engagement+downstream+of+IL-15+receptor+in+NK+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Shp-2 is critical for ERK and metabolic engagement downstream of IL-15 receptor in NK cells.</a> Nat Commun. 10, 1-14 (2019).</li>
<li>Wang, Y. -C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Helicobacter+pylori+infection+activates+Src+homology-2+domain-containing+phosphatase+2+to+suppress+IFN-%CE%B3+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Helicobacter pylori infection activates Src homology-2 domain-containing phosphatase 2 to suppress IFN-γ signaling.</a> J Immunol. 193 (8), 4149-4158 (2014).</li>
<li>Yu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tyrosine+phosphatase+SHP2+promotes+proliferation+and+oxaliplatin+resistance+of+colon+cancer+cells+through+AKT+and+ERK%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">The tyrosine phosphatase SHP2 promotes proliferation and oxaliplatin resistance of colon cancer cells through AKT and ERK.</a> Biochem Biophys Res Commun. 563, 1-7 (2021).</li>
<li>Lauriol, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+SHP2+dysfunction+underlies+cardiac+hypertrophy+in+Noonan+syndrome+with+multiple+lentigines%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Developmental SHP2 dysfunction underlies cardiac hypertrophy in Noonan syndrome with multiple lentigines.</a> J Clin Invest. 126 (8), 2989-3005 (2016).</li>
<li>Tartaglia, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+PTPN11%2C+encoding+the+protein+tyrosine+phosphatase+SHP-2%2C+cause+Noonan+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Mutations in PTPN11, encoding the protein tyrosine phosphatase SHP-2, cause Noonan syndrome.</a> Nat Genet. 29, 465-468 (2001).</li>
<li>Xu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+Shp2+tyrosine+phosphatase+is+implicated+in+leukemogenesis+in+adult+human+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Overexpression of Shp2 tyrosine phosphatase is implicated in leukemogenesis in adult human leukemia.</a> Blood. 106 (9), 3142-3149 (2005).</li>
<li>Mustelin, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+tyrosine+phosphatases%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Biosci%22%5BJournal%5D)">Protein tyrosine phosphatases.</a> Front Biosci. 7 (4), d85-d142 (2002).</li>
<li>Stanford, S. M., Bottini, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+tyrosine+phosphatases%3A+time+to+end+the+stigma%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Pharmacol+Sci%22%5BJournal%5D)">Targeting tyrosine phosphatases: time to end the stigma.</a> Trends Pharmacol Sci. 38 (6), 524-540 (2017).</li>
<li>Guo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+phosphatases%3A+From+molecule+design+to+clinical+trials%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Targeting phosphatases: From molecule design to clinical trials.</a> Eur J Med Chem. 264, 116031(2024).</li>
<li>Weiser, D. C., Shenolikar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+protein+phosphatase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Use of protein phosphatase inhibitors.</a> Curr Protoc Mol Biol. 62, 1-18 (2003).</li>
<li>Fauser, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+protein+tyrosine+phosphatase+signaling+by+engineered+chemogenetic+control+of+its+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Dissecting protein tyrosine phosphatase signaling by engineered chemogenetic control of its activity.</a> J Cell Biol. 221 (8), e202111066(2022).</li>
<li>Karginov, A. V., Hahn, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allosteric+activation+of+kinases%3A+design+and+application+of+RapR+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Allosteric activation of kinases: design and application of RapR kinases.</a> Curr Protoc Cell Biol. , Chapter 14, Unit 14.13 (2011).</li>
<li>Karginov, A. V., Ding, F., Kota, P., Dokholyan, N. V., Hahn, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+allosteric+activation+of+kinases+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Engineered allosteric activation of kinases in living cells.</a> Nat Biotechnol. 28, 743-747 (2010).</li>
<li>Dagliyan, O., Dokholyan, N. V., Hahn, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+proteins+for+allosteric+control+by+light+or+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Engineering proteins for allosteric control by light or ligands.</a> Nat Protoc. 14, 1863-1883 (2019).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+the+SHP2+phosphatase+promotes+vascular+damage+and+inhibition+of+tumor+growth%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Targeting the SHP2 phosphatase promotes vascular damage and inhibition of tumor growth.</a> EMBO Mol Med. 13, e14089(2021).</li>
<li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SHP2+regulates+the+development+of+intestinal+epithelium+by+modifying+OSTERIX%2B+crypt+stem+cell+self-renewal+and+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">SHP2 regulates the development of intestinal epithelium by modifying OSTERIX+ crypt stem cell self-renewal and proliferation.</a> FASEB J. 35, e21106(2021).</li>
<li>Zhang, E. E., Chapeau, E., Hagihara, K., Feng, G. -S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+Shp2+tyrosine+phosphatase+controls+energy+balance+and+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Neuronal Shp2 tyrosine phosphatase controls energy balance and metabolism.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (45), 16064-16069 (2004).</li>
<li>Song, Y., Zhao, M., Zhang, H., Yu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double-edged+roles+of+protein+tyrosine+phosphatase+SHP2+in+cancer+and+its+inhibitors+in+clinical+trials%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Ther%22%5BJournal%5D)">Double-edged roles of protein tyrosine phosphatase SHP2 in cancer and its inhibitors in clinical trials.</a> Pharmacol Ther. 230, 107966(2022).</li>
<li>Hartman, Z. R., Schaller, M. D., Agazie, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tyrosine+phosphatase+SHP2+regulates+focal+adhesion+kinase+to+promote+EGF-induced+lamellipodia+persistence+and+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">The tyrosine phosphatase SHP2 regulates focal adhesion kinase to promote EGF-induced lamellipodia persistence and cell migration.</a> Mol Cancer Res. 11 (6), 651-664 (2013).</li>
<li>Yu, D. H., Qu, C. K., Henegariu, O., Lu, X., Feng, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-tyrosine+phosphatase+Shp-2+regulates+cell+spreading%2C+migration%2C+and+focal+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Protein-tyrosine phosphatase Shp-2 regulates cell spreading, migration, and focal adhesion.</a> J Biol Chem. 273 (33), 21125-21131 (1998).</li>
<li>Kramer, M. F., Coen, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+amplification+of+DNA+by+PCR%3A+standard+procedures+and+optimization%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Enzymatic amplification of DNA by PCR: standard procedures and optimization.</a> Curr Protoc Cell Biol. 10, 1-14 (2001).</li>
<li>Sandhu, G. S., Precup, J. W., Kline, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+one-step+characterization+of+recombinant+vectors+by+direct+analysis+of+transformed+Escherichia+coli+colonies%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Rapid one-step characterization of recombinant vectors by direct analysis of transformed Escherichia coli colonies.</a> Biotechniques. 7, 689-690 (1989).</li>
<li>Tsygankov, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CellGeo%3A+A+computational+platform+for+the+analysis+of+shape+changes+in+cells+with+complex+geometries%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">CellGeo: A computational platform for the analysis of shape changes in cells with complex geometries.</a> J Cell Biol. 204 (3), 443-460 (2014).</li>
<li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+Image+to+ImageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat Methods. 9, 671-675 (2012).</li>
<li>Ray, A. -M., Klomp, J. E., Collins, K. B., Karginov, A. V. Dissecting kinase effector signaling using the RapRTAP methodology. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRay%2C+A-M+%22Kinase+Signaling+Networks%22">Kinase Signaling Networks</a>. Tan, A. -C., Huang, P. H. , Springer. New York, NY. 21-33 (2017).</li>
<li>Mercan, F., Bennett, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+protein+tyrosine+phosphatases+and+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of protein tyrosine phosphatases and substrates.</a> Curr Protoc Mol Biol. 18, Unit 18.16 (2010).</li>
<li>Karginov, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+regulation+of+protein+dimerization+and+kinase+activity+in+living+cells+using+photocaged+rapamycin+and+engineered+FKBP%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Light regulation of protein dimerization and kinase activity in living cells using photocaged rapamycin and engineered FKBP.</a> J Am Chem Soc. 133 (3), 420-423 (2011).</li>
<li>Karginov, A. V., Hahn, K. M., Deiters, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optochemical+activation+of+kinase+function+in+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Optochemical activation of kinase function in live cells.</a> Methods Mol Biol. 1148, 31-43 (2014).</li>
</ol>

Les protéines tyrosine phosphatases sont une famille critique de protéines impliquées dans une pléthore d’événements de signalisation cellulaire. Il a été démontré qu’ils jouent un rôle clé dans la régulation de la prolifération, de la migration et de l’apoptosecellulaires 1,2,3. Par conséquent, la dérégulation des protéines tyrosine phosphatases conduit à une variété de maladies et de troubles débilitants 4,5,6,7. L’étude de la fonction physiologique des tyrosine phosphatases et de leur rôle dans le développement de ces pathologies a toujours été entravée par un manque d’outils nécessaires pour sonder les subtilités de la signalisation de la phosphatase8.
Traditionnellement, les phosphatases sont étudiées à l’aide de méthodes qui n’ont pas la spécificité souhaitée et/ou qui n’assurent pas de contrôle temporel de leur activité. Ces limites critiques des outils disponibles rendent difficile la dissection des rôles spécifiques des phosphatases dans les voies de signalisation. La surexpression de mutants négatifs constitutivement actifs et dominants ou la régulation négative de l’expression de la phosphatase fournissent une spécificité mais manquent de contrôle temporel et peuvent souvent déclencher des mécanismes compensatoires qui masqueront la véritable fonction de l’enzyme.
Les inhibiteurs pharmacologiques permettent la régulation temporelle des phosphatases. Cependant, de nombreux inhibiteurs de la phosphatase sont notoirement non spécifiques en raison de la composition bien conservée du site actif dans les tyrosine phosphatases9. De plus, en raison de contraintes de conception, les inhibiteurs ciblant le site catalytique présentent une faible perméabilité de la membrane cellulaire10. Une autre limitation des inhibiteurs est qu’ils ne permettent d’examiner que les effets de l’inactivation de la phosphatase11. Il est donc nécessaire de disposer d’outils permettant une activation spécifique et régulable dans le temps des phosphatases. Ces outils permettront aux chercheurs d’identifier les effets directs de l’activation de la phosphatase, en les séparant de multiples cascades de signalisation parallèles souvent activées par des stimuli biologiques. Il est important de noter qu’un contrôle temporel étroit de l’activité permet d’identifier les événements transitoires induits par une phosphatase et de séparer les effets de l’activité aiguë et prolongée de la phosphatase. La combinaison de la régulation temporelle et de l’analyse mutationnelle permettra une dissection détaillée des rôles spécifiques des domaines individuels de la phosphatase et l’interrogation de sa signalisation en aval12.
Pour remédier au manque de capacités souhaitées dans les outils existants, le groupe Karginov a développé le système Rapamycin Regulated (RapR) 13,14,15. Le système RapR utilise un domaine de commutation modifié, iFKBP, qui permet la régulation allostérique de la protéine d’intérêt (POI). L’insertion du domaine iFKBP à une position allostériquement couplée au site catalytique du POI le rend sensible à la régulation par la rapamycine. En l’absence de rapamycine, l’iFKBP perturbe le site catalytique en raison de la dynamique structurelle intrinsèquement élevée de l’iFKBP et inactive ainsi le POI. L’ajout de rapamycine induit l’interaction de l’iFKBP avec la protéine co-exprimée FRB (Figure 1). Cela provoque une stabilisation du domaine de commutation, ce qui restaure par conséquent la structure et la fonction du domaine catalytique du POI. En tant que tel, l’outil permet une activation spécifique et régulable dans le temps du POI.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67142/67142fig01.jpg"> Figure 1 : Schéma du système régulé par la rapamycine RapR-Shp2. RapR permet l’activation allostérique de la protéine d’intérêt avec l’ajout de rapamycine. Cette figure a été modifiée à partir de Fauser et al.12. Abréviations : iFKBP = FKBP12 insérable ; FRB = domaine de liaison FKBP-rapamycine ; R = rapamycine ; Shp2 = protéine tyrosine phosphatase contenant le domaine Src homology-2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67142/67142fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
L’outil RapR peut être appliqué à différentes familles de protéines. Il peut être utilisé pour réguler les protéines kinases ainsi que les phosphatases12,14. Ce protocole se concentrera sur l’application de l’outil RapR pour contrôler la phosphatase Shp2. Shp2 est une protéine tyrosine phosphatase exprimée de manière ubiquitaire qui est impliquée dans des processus de signalisation tels que la prolifération, la migration, l’immunomodulation et la différenciation 1,16,17,18. La dérégulation de Shp2 a été associée à un certain nombre de cancers solides, à la leucémie myéloïde et à des troubles du développement 5,7. Cependant, Shp2 a été victime des mêmes défauts d’outils que ceux décrits ci-dessus. Pour lutter contre ces limitations, RapR-Shp2, une construction Shp2 spécifiquement et temporellement régulable, a été développée et caractérisée12.
Avant le développement de RapR-Shp2, on savait que Shp2 était impliqué dans la migration cellulaire 19,20,21. Cependant, son rôle spécifique dans la signalisation impliquée dans ce processus était inconnu. On ne savait pas non plus à quelle échelle de temps Shp2 régule la migration des cellules et quels changements morphodynamiques spécifiques elle induit à différents moments de son activation. De plus, il n’était pas clair si l’activation aiguë et prolongée de Shp2 provoquerait des effets différents. En utilisant RapR-Shp2, il a été constaté que l’activation aiguë de Shp2 induit une propagation cellulaire transitoire, une augmentation des protubérances, une polarisation cellulaire et une migration. Des voies spécifiques en aval de Shp2 qui régulent des changements morphodynamiques distincts ont également été identifiées12. Ce protocole fournit des détails pour la conception et la caractérisation de RapR-Shp2, qui peuvent être utilisés pour guider le développement et l’application d’autres phosphatases RapR.

<table><tbody><tr><td>#1.5 Lamelles en verre 25 mm Round</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0715</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL Tubes</td><td>USA Scientific</td><td>cc7682-3394</td><td></td></tr><tr><td>2x Laemmli Buffer</td><td></td><td></td><td>Pour 500 mL : 5.18 g Tris-HCL, 131.5 mL glycerol, 52.5 mL 20 % SDS, 0.5 g de bleu de bromophénol, pH final 6.8</td></tr><tr><td>4-20 % Mini-PROTEAN TGX Precast Gel</td><td>Biorad</td><td>4561096</td><td></td></tr><tr><td>5x Phusion Plus Buffer</td><td>Thermo Scientific</td><td>F538L</td><td></td></tr><tr><td>A431 Cellules</td><td>ATCC</td><td>CRL-1555</td><td></td></tr><tr><td>Agarsose</td><td>GoldBiotech</td><td>A-201</td><td></td></tr><tr><td>Chambre cellulaire Attofluor</td><td>invitrogen</td><td>A7816</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal de référence (FBS)</td><td>Gemini Bio-products</td><td>100-106</td><td>Triple inactivé par la chaleur 0.1 &micro ; m stérile</td></tr><tr><td>Brig 35,30 w/v %</td><td>Acros</td><td>329581000</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>GoldBiotech</td><td>A-420</td><td></td></tr><tr><td>CellGeo</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Publié dans 10.1083/jcb.201306067</td></tr><tr><td>CellMask Deep Red plasma membrane dye</td><td>invitrogen</td><td>c10046</td><td></td></tr><tr><td>Colony Screen MasterMix</td><td>Genesee</td><td>42-138</td><td></td></tr><tr><td>DH5a competent cellules</td><td>NEB</td><td>C2987H</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Corning</td><td>15-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Thermo Scientific</td><td>F-515</td><td></td></tr><tr><td>Échelle d’ADN</td><td>GoldBio</td><td>D010-500</td><td></td></tr><tr><td>dNTPs</td><td>NEB</td><td>N04475</td><td></td></tr><tr><td>DpnI Enzyme</td><td>NEB</td><td>R01765</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>GoldBio</td><td>DTT10</td><td>DL-Dithiothreitol, Réactifs Cleland’s</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Acros</td><td>409910250</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectine à partir de plasma bovin</td><td>Sigma</td><td>F1141</td><td></td></tr><tr><td>FuGENE(R) 6 Réactif de transfection</td><td>Promega</td><td>E2692</td><td>Réactif de transfection</td></tr><tr><td>Kit d’extraction de gel</td><td>Thermo Scientific</td><td>K0692</td><td>GeneJET Kit d’extraction de gel</td></tr><tr><td>Gel vert Teinture d’acide nucléique</td><td>GoldBio</td><td>G-740-500</td><td></td></tr><tr><td>Gel Colorant de chargement Violet 6x</td><td>NEB</td><td>B7024A</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td>GlutaMAX-l (100x) 100 mL</td></tr><tr><td>HEK 293T Cellules</td><td>ATCC</td><td>CRL-11268</td><td></td></tr><tr><td>HeLa Cellules</td><td>ATCC</td><td>CRM-CCL-2</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fischer</td><td>BP310-500</td><td></td></tr><tr><td>Logiciel de traitement</td><td>ImageJ N/A</td> N<td>/A</td><td></td></tr><tr><td>Igepal CA-630 (NP40)</td><td>Sigma</td><td>I3021</td><td></td></tr><tr><td>Tampon imidazole</td><td>25 mM Imidazole pH 7,2, 2,5 mM EDTA, 50 mM NaCl, 5 mM DTT</td>KCl Sigma P-4504 L-15 1x Corning 10-045-CV LB Agar Fisher BP1425-2 Tampon de lyse <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>20 mM Hepes-KOH, pH 7,8, 50 mM KCl, 1 mM EGTA, 1 % NP40</td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks</td><td>N/A</td><td>R 2022b la mise à jour a été utilisée pour exécuter les fonctions CellGeo</td></tr><tr><td>Logiciel d’automatisation et d’analyse d’images de microscopie métamorphe N</td><td></td><td>/A N/A</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Fisher Chemical</td><td>M33-500</td><td></td></tr><tr><td>Huile minérale</td><td>Sigma</td><td>M5310</td><td></td></tr><tr><td>MiniPrep Kit</td><td>Gene Choice</td><td>96-308</td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN TGX Gels préfabriqués 12 puits</td><td>Bio-Rad</td><td>4561085</td><td></td></tr><tr><td>Biologie moléculaire Eau</td><td>Corning</td><td>46-000-CV</td><td></td></tr><tr><td>Multibande Polychroïque Miroir</td><td>Chroma Technology</td><td>89903BS</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Chemical</td><td>S271-3</td><td></td></tr><tr><td>Olympus UPlanSAPO Objectif 40x</td><td>Olympus</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>PBS sans Ca et Mg</td><td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>Tubes</td><td>PCR labForce</td><td>1149Z65</td><td>0,2 mL Tubes et capuchons à 8 bandelettes, Bande rigide Capuchons de dôme attachés individuellement</td></tr><tr><td>Phusion Plus ADN polymérase</td><td>Thermo Scientific</td><td>F630S</td><td></td></tr><tr><td>Amorces</td><td>IDT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Protein-G Sepharose</td><td>Millipore</td><td>16-266</td><td></td></tr><tr><td>Membranes PVDF</td><td>BioRad</td><td>1620219</td><td>Immun-Blot PVDF/Papier filtre</td></tr><tr><td>Sandwichs Rapamycine</td><td>Fisher</td><td>AAJ62473MF</td><td></td></tr><tr><td>0,25 % Trypsine, 2,21 mM EDTA, 1x [-] sodium</td><td>Corning</td><td>25-053-CI</td><td></td></tr><tr><td>Tris-Acétate-EDTA (TAE) 50x</td><td>Fischer</td><td>BP1332-1</td><td>pour électrophorèse</td></tr><tr><td>Tampon</td><td></td><td></td> de lavage <td>20 mM Hepes-KOH, pH 7,8, 50 mM KCl, 100 mM NaCl, 1 mM EGTA, 1 % NP40</td></tr><tr><td>&beta ;-Mercaptoéthanol</td><td>Fisher Chemical</td><td>O3446I-100</td><td></td></tr><tr><td>Antibodies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Signalisation cellulaire</td> <td>des anticorps anti-EGFR</td><td>2232</td><td></td></tr><tr><td>Signalisation cellulaire anti-Erk 1/2</td><td></td><td>9102</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps anti-drapeau</td><td>Millipore-Sigma</td><td>F3165</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps anti-GAPDH</td><td>invitrogen</td><td>AM4300</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps anti-GFP</td><td>Clontech</td><td>632380</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps anti-mCherry</td><td>invitrogen</td><td>M11217</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps anti-paxilline</td><td>Thermo Fischer</td><td>BDB612405</td><td></td></tr><tr><td>Anti-phospho-EGFR Y992</td><td>Signalisation cellulaire d’anticorps</td><td>2235</td><td></td></tr><tr><td>Anti-phospho-Erk 1/2 T202/Y204 Signalisation</td><td>cellulaire des anticorps</td><td>9101</td><td></td></tr><tr><td>Anti-phospho-paxilline Y31 Anticorps</td><td>Millipore-Sigma</td><td>05-1143</td><td></td></tr><tr><td>Anti-phospho-PLC&gamma ; Y783</td><td>Signalisation cellulaire d’anticorps</td><td>14008</td><td></td></tr><tr><td>Anti-PLC&gamma ; </td><td>Signalisation cellulaire des</td> anticorps <td>5690</td><td></td></tr></tbody></table>

développement et application de tyrosine phosphatases régulées par la rapamycine

Development and Application of Rapamycin-regulated Tyrosine Phosphatases

La figure 4 montre les résultats que l’on peut attendre du test d’activité de la phosphatase à base de paxilline. Dans cette expérience, l’activité négative de la phosphatase Shp2, constitutivement active et dominante, a été comparée à celle de la RapR-Shp2 active et inactive en utilisant la phospho-paxilline comme lecture. Les constructions de Shp2 ont été immunoprécipitées et soumises au test d’activité décrit dans le protocole. Les lectures de phospho-paxilline pour Shp2 constitutivement actif et RapR-Shp2 actif étaient similaires, indiquant que le RapR-Shp2 actif n’avait pas été affecté négativement par l’introduction du domaine RapR et qu’il conservait sa pleine activité une fois activé. Les Shp2 négatifs dominants et les RapR-Shp2 inactifs étaient également similaires, ce qui indique que la construction RapR-Shp2 n’a pas d’activité lorsqu’elle est inactive. Cela indique la conception réussie d’une RapR-phosphatase. Le substrat phospho utilisé pour ce test peut différer en fonction de la phosphatase d’intérêt.
La figure 5, semblable à la figure 4, compare les RapR-Shp2 constitutivement actifs, dominants négatifs et actifs et inactifs. Cette expérience a été menée sans immunoprécipitation des constructions. Au lieu de cela, il a été conçu pour caractériser les effets de signalisation en aval de la construction RapR-Shp2 dans les cellules. Ici, les constructions Shp2 ont été exprimées dans HEK293T cellules. Il a été démontré que l’effecteur en aval ERK1/2 augmente dans la phosphorylation en réponse à l’activation de RapR-Shp2, tout comme dans l’échantillon constitutivement actif. L’inactif RapR-Shp2 n’a pas induit ce changement. Cela indique que la signalisation en aval de Shp2 est préservée avec l’incorporation du domaine RapR. De même, les phospho-substrats connus EGFR et PLCγ ont été déphosphorylés en réponse à l’activation de RapR-Shp2 dans les cellules A431.
Enfin, la figure 6 présente les résultats de l’activation de RapR-Shp2 sur la morphodynamique des cellules HeLa. Une fois que RapR-Shp2 a été activé, les cellules ont montré une augmentation de l’activité protrusive ainsi que de la surface cellulaire. Cela indique que l’activation de RapR-Shp2 est suffisante pour induire des changements morphodynamiques dans les cellules HeLa et peut permettre aux chercheurs de sonder des voies de signalisation spécifiques en aval responsables de cet effet.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67142/67142fig04.jpg"> Figure 4 : Résultats de l’essai d’activité à base de paxilline : Les lignées constitutivement actives, dominantes négatives et RapR-Shp2 ont été immunoprécipitées et soumises à l’analyse d’activité selon le protocole décrit. Les niveaux de pY31 paxillin dans CA et RapR-Shp2 étaient similaires, ce qui indique que la construction RapR-Shp2 avait une activité similaire à celle de CA Shp2 une fois activée. L’échantillon non activé de RapR-Shp2 n’avait aucune activité, comme l’échantillon de DN, ce qui indique qu’il n’y avait pas de « fuite ». Cette figure a été modifiée à partir de Fauser et al.12. Abréviations : RapR = Rapamycin-regulated ; Shp2 = protéine tyrosine phosphatase contenant le domaine Src homology-2 ; DN = dominante négative ; CA = constitutivement actif ; FRB = domaine de liaison FKBP-rapamycine. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67142/67142fig04large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67142/67142fig05.jpg"> Figure 5 : Résultats du test de lysat à cellules entières : les lysats constitutivement actifs, dominants négatifs et RapR-Shp2 ont été exprimés dans HEK293T cellules et le protocole de lysat à cellules entières a été mis au point. Lorsqu’il était inactif, RapR-Shp2 n’a pas activé ERK1/2 par phosphorylation, comme dans l’échantillon de DN Shp2. Cela indique que RapR-Shp2 n’a pas d’activité lorsqu’il est inactif. Une fois activé, le niveau de phosphorylation d’ERK1/2 était similaire à celui de l’échantillon de Shp2 de CA, indiquant une activation réussie et une signalisation en aval de Shp2. De même, les cellules A431 exprimant RapR-Shp2 ont montré une diminution de la phosphorylation de l’EGFR et du PLCγ, deux substrats connus de Shp2. Cette figure a été modifiée à partir de Fauser et al.12. Abréviations : RapR = Rapamycin-regulated ; Shp2 = protéine tyrosine phosphatase contenant le domaine Src homology-2 ; DN = dominante négative ; CA = constitutivement actif ; ERK = kinase régulée par le signal extracellulaire ; GAPDH = glycéraldéhyde 3-phosphate déshydrogénase ; EGFR = récepteur du facteur de croissance épidermique ; PLCγ = phospholipase C gamma ; FRB = domaine de liaison FKBP-rapamycine. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67142/67142fig05large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67142/67142fig06.jpg"> Figure 6 : Analyse des données de surface cellulaire et d’activité protrusive basée sur l’imagerie en direct : Les cellules HeLa ont été transfectées avec RapR-Shp2 et soumises au protocole d’imagerie en direct décrit. Les données ont été analysées conformément au protocole d’analyse des données. Une fois activées (indiquées par la ligne grise verticale), les cellules HeLa ont montré une augmentation de l’activité protrusive cellulaire ainsi que de la surface cellulaire. Dans les échantillons négatifs qui n’exprimaient que des SRR, cette activité n’était pas présente. Cela indique que l’activation de RapR-Shp2 induit des changements morphodynamiques rapides au sein des cellules HeLa et encourage l’étalement et la protrusion cellulaires. Cette figure a été modifiée à partir de Fauser et al.12. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67142/67142fig06large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>

Développement et application de tyrosine phosphatases régulées par la rapamycine

Tyrosine phosphatases are an important family of enzymes that regulate critical physiological functions. They are often dysregulated in human diseases, ...

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