Isolement de chondrocytes et de chondroprogéniteurs à l’aide de l’adhésion de la fibronectine et du dosage migratoire

Dans le domaine de l’ingénierie tissulaire cartilagineuse et de la médecine régénérative, il est encore nécessaire d’améliorer les résultats biologiques et fonctionnels en termes d’amélioration du traitement en cours et de développement de nouvelles stratégies thérapeutiques. Les recherches précliniques actuelles indiquent l’utilisation potentielle de chondroprogéniteurs dérivés du cartilage comme une option viable pour la cicatrisation du cartilage. Les recherches actuelles comprennent des stratégies visant à améliorer davantage le potentiel chondrogénique tout en maintenant une puissance hypertrophique plus faible grâce à l’utilisation de facteurs de croissance supplémentaires et de techniques de recombinaison génique.

Les chondroprogéniteurs sont confrontés à des défis expérimentaux, notamment l’absence de consensus sur la nomenclature, diverses techniques d’isolement, des difficultés de caractérisation, la variabilité des conditions de culture et une compréhension limitée des mécanismes sous-jacents. Démontrer cliniquement que les chondroprogéniteurs produisent des résultats positifs par rapport aux cellules couramment utilisées pourrait réduire considérablement la charge globale associée aux pathologies liées au cartilage. Évolution de thérapies améliorées à l’aide d’alternatives acellulaires, telles que les vésicules extracellulaires dérivées de progéniteurs, et à l’aide de stratégies recombinantes pour la régénération d’un véritable cartilage hyalin.

Pour commencer, obtenez des articulations tibio-fémorales ou du genou de donneurs humains dans 1X PBS dans des conditions stériles, puis transférez les articulations récoltées sur le sous-coussin stérile du capuchon. Pour stabiliser les articulations, tenez l’os sous-chondral avec le cartilage vers le haut. À l’aide d’une lame de scalpel numéro 22, prélevez des copeaux de cartilage de forme rectangulaire dans les zones non portantes.

Coupez le cartilage en sections mesurant huit millimètres sur 10 millimètres de la couche superficielle à la couche plus profonde. Après avoir lavé les tranches avec du PBS, placez-les dans une boîte de Pétri contenant un à deux millilitres de milieu d’aigle modifié Dulbecco, ou DMEM. Ensuite, à l’aide d’une lame de scalpel numéro 22, émincez les tranches de cartilage à une taille inférieure à un millimètre cube.

Pour commencer, obtenez du cartilage haché à partir d’articulations du genou humain extraites. Placez le cartilage haché dans une fiole verticale T25 contenant 10 millilitres de DMEM/F-12 sans sérum avec 0,15 % de collagénase de type II pour la digestion enzymatique. Laissez le flacon sans être dérangé dans un incubateur à dioxyde de carbone pendant 12 à 14 heures.

Après la digestion pendant la nuit, transférez le milieu contenant les chondrocytes libérés dans un tube à centrifuger stérile frais. Utilisez une crépine pour séparer les cellules des débris. Ajoutez un volume égal de DMEM/F-12 avec 10 % de sérum de veau fœtal, ou FBS.

Centrifuger les cellules filtrées à 1 200 G pendant cinq minutes à 37 degrés Celsius. Après avoir jeté le surnageant, reconstituez la pastille dans un millilitre de milieu. Comptez les cellules viables à l’aide d’un test d’exclusion au bleu trypan.

Ensuite, chargez les chondrocytes dans un ballon T25 à une concentration de 10 000 cellules par centimètre carré. Développez les cellules jusqu’au nombre de passage requis à l’aide de DMEM/F-12 contenant 10 % de FBS. Rafraîchissez le milieu tous les trois jours avant de récolter les cellules à la sous-confluence en utilisant 0,125 % de trypsine contenant de l’EDTA.

Les chondrocytes ont adhéré rapidement après la charge et sont passés d’une forme de pavé arrondi à un aspect fibroblastique à mesure qu’ils se dilatent. Pour commencer, obtenez des copeaux de cartilage à partir d’articulations tibio-fémorales ou du genou humaines extraites. Soumettez les copeaux de cartilage à une digestion enzymatique séquentielle pendant la nuit, en utilisant d’abord 0,2 % de pronase pendant trois heures, puis 0,04 % de collagénase de type II pendant 12 heures dans un bain d’eau agité maintenu à 37 degrés Celsius.

Ensuite, enduisez le nombre requis de puits d’une plaque à six puits avec 1,5 millilitre de la solution de fibronectine PBS. Fermez hermétiquement l’assiette et réfrigérez toute la nuit à quatre degrés Celsius. Le lendemain, sortez du réfrigérateur la plaque à six puits recouverte de fibronectine.

Après avoir éliminé l’excès de fibronectine, ajoutez deux à trois millilitres de DMEM / F-12 ordinaire dans les puits enrobés. Ensemencez les chondrocytes libérés dans les puits enrobés à une densité de 4 000 cellules par puits et laissez la plaque intacte pendant 20 minutes. Après l’incubation, aspirez les milieux en excès et les cellules non adhérentes.

Ajoutez deux à trois millilitres de DMEM/F-12 avec 10 % de sérum de bovin fœtal dans les puits. Maintenez les cellules adhérentes dans des conditions de culture standard pendant 10 à 12 jours pour obtenir des clones de cellules progénitrices chondrogènes, ou CPC, puis isolez les clones CPC à l’aide de 0,125 % de trypsine EDTA pendant 180 secondes, puis rejouez à un ratio d’un clone par cinq centimètres carrés. Étendez les CPC polyclonaux enrichis à la confluence requise.

Les chondrocytes soumis à un test d’adhésion à la fibronectine présentent une croissance clonale, atteignant une population doublant de cinq au 10e jour. Pour commencer, obtenez les explants de cartilage rasé de l’articulation articulaire récoltée dans un milieu supplémenté en DMEM/F-12. Placez l’assiette avec les explants à l’intérieur d’un incubateur de dioxyde de carbone réglé à 37 degrés Celsius pendant 48 heures.

Après deux jours, transférez les explants dans un tube à centrifuger contenant 10 millilitres de solution de collagénase à 0,1 % pour la digestion enzymatique. Incuber le tube à 37 degrés Celsius pendant deux heures. Après la digestion, rincez les explants avec du 1X PBS et remettez-les dans les mêmes puits dans la plaque contenant du milieu DMEM/F-12 fraîchement supplémenté.

Maintenir la plaque dans l’incubateur dans des conditions de culture standard et surveiller la migration des chondroprogéniteurs au cours des jours suivants. Une fois que les explants atteignent la sous-confluence, récoltez les cellules chondroprogénitors mésenchymateuses, ou MCP, en utilisant une solution d’EDTA à 0,125 % de trypsine. Développez les MCP à l’aide du média DMEM/F-12 supplémenté.

Les chondroprogéniteurs commencent à migrer à partir du bord de l’explant au 10e jour de la culture, présentant un schéma de croissance en forme de fuseau avec une expansion supplémentaire.