Name: Production de collagène à motifs nanofibrillaires pour l’ingénierie tissulaire (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-20T13:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 34 s
Description: Découvrez une méthode d'extrusion par cisaillement pour fabriquer des hydrogels de collagène à motifs nanofibrillaires. Cette technique contrôle l'organisation des fibrilles pour guider les interactions cellulaires en ingénierie tissulaire.

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<meta charset="utf8"></head><body>Fabrication de collagène nanofibrillaire modifié avec structuration dirigée

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</ol>

<table><tbody><tr><td>Collagène I, haute concentration, queue de rat</td><td>Corning</td><td>CB354249</td><td></td></tr><tr><td>Eclipse TE-2000-U microscope</td><td>Nikon</td><td>TE-2000-U&nbsp ;</td><td>Microscope inversé</td></tr><tr><td>Lames de microscope extra épaisses</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-267-005</td><td>Fonctionne bien pour la surface d’extrusion de collagène</td></tr><tr><td>FEI Helios G3 NanoLab DualBeam</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>N/A</td><td>Microscope électronique à balayage</td></tr><tr><td>Ensemble d’outils de coupe de verre 2mm-20mm Style crayon Alimentation en huile Pointe en carbure Amazon</td><td>/MOARMOR</td><td>B07Y1D243H</td><td>Option pour un coupe-verre</td></tr><tr><td>Hamilton Kel-F Hub Aiguilles à pointe émoussée (Luer Lock, 22 G)</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-815-574</td><td>Aiguilles pour l’extrusion de collagène</td></tr><tr><td>Nexterion Slide H 3-D</td><td>Schott</td><td>NC0782819</td><td>Lames hydrophobes Comprimés</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>18912014</td><td></td></tr><tr><td>Polyéthylène glycol 8000</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP233-1</td><td></td></tr><tr><td>Tube de dialyse cellulosique sans soudure&nbsp ;</td><td>Fisher Scientific</td><td>S25645G</td><td></td></tr><tr><td>SnakeSkin Pinces de dialyse</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PI68011</td><td></td></tr><tr><td>Synthware Coupe-verre</td><td>Synthware</td><td>31-501-927</td><td>Option pour un coupe-verre</td></tr></tbody></table>

production de collagène à motifs nanofibrillaires pour l’ingénierie tissulaire

Production of Nanofibrillar Patterned Collagen for Tissue Engineering

Ce protocole décrit une technique d’extrusion simple basée sur le cisaillement pour la fabrication d’hydrogels de collagène composés de nanofibrilles alignées (Figure 2) ou orientées de manière aléatoire (Figure 3). La structuration des nanofibrilles repose sur le contrôle précis des forces de cisaillement, qui est obtenu grâce à la modulation combinée de la vitesse de la seringue et du taux d’extrusion du collagène. Les valeurs optimales pour induire l’alignement des fibrilles ont été précédemment déterminées à une vitesse de seringue de 340 mm/s et à un taux d’extrusion de collagène de 3,2 mL/min28,29. Cet équilibre est essentiel non seulement pour la formation de nanofibrilles alignées, mais aussi pour assurer la fonctionnalité des hydrogels à l’échelle macroscopique. Si ce rapport n’est pas aligné, il y a un risque de fabriquer des hydrogels qui ne sont pas structurés comme prévu, ainsi que des hydrogels contenant des bandes de collagène trop minces (&lt;0,5 mm de diamètre), épais (&gt;1,5 mm de diamètre) ou ondulés pour être utilisés. Par exemple, un mouvement trop rapide d’une seringue, associé à un taux d’extrusion trop lent, donne des bandes minces, tandis que le rapport opposé donne des bandes épaisses ou ondulées (figure 4A-D), selon le degré de déséquilibre du rapport. Ces différences de propriétés macroscopiques peuvent créer une variabilité suffisante d’une bande à l’autre pour influencer le dépôt cellulaire et l’adhésion locale.
Après l’extrusion et l’assemblage du collagène, la fabrication de l’hydrogel passe par une phase initiale de séchage, souvent de 1 à 3 h, avant de subir une étape de lavage dans 1x PBS (Figure 2 et Figure 3). L’obtention de résultats topographiques optimaux repose sur un équilibre délicat entre le moment et l’intensité de l’étape de lavage. Un lavage insuffisant ou retardé entraîne une perturbation de la topographie des fibres, indiquée par les empreintes de cristaux de sel PBS sur les fibrilles. En revanche, un lavage excessif ou prématuré du collagène après la fabrication entraîne une couche dissoute de collagène qui recouvre les caractéristiques topographiques (Figure 4E,F).
La microscopie électronique à balayage (MEB) confirme la présence d’une orientation nanofibrillaire alignée ou aléatoire dans les hydrogels de collagène. Dans les hydrogels alignés et aléatoires, les nanofibrilles présentent des diamètres de fibrilles compris entre 30 et 50 nm29. Qualitativement, il est évident que les hydrogels alignés contiennent des nanofibrilles alignées unilatéralement (Figure 5). Cet alignement a déjà été quantifié à l’aide de l’analyse par transformée de Fourier rapide 2D, dans laquelle le tracé d’alignement affiche deux pics distincts espacés de 180° pour les hydrogels alignés, contrastant avec les hydrogels orientés de manière aléatoire qui ne présentent que des pics de basse fréquence28.
Des images en fond clair de myoblastes primaires des muscles squelettiques de souris illustrent que le guidage nanotopographique anisotrope des fibrilles de collagène favorise l’alignement cellulaire (Figure 6). Il a été démontré que ces hydrogels de collagène nanostructurés induisent l’alignement cellulaire non seulement dans les myoblastes26, mais également dans d’autres types de cellules, telles que les cellules endothéliales 23,24.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67165/67165fig01.jpg"> 
Figure 1 : Illustration schématique de la préparation de lames de collagène ultra-haute densité et de verre taillé. (A-F) Procédé de dialyse au collagène : (A) préparation de la tubulure de dialyse en bandes de 3 pouces et fixation du premier clip, (B) chargement du collagène haute densité dans le tube et fixation du deuxième clip, (C) enrobage du tube de dialyse chargé avec des flocons de polyéthylène glycol (PEG), (D) l’élimination des flocons de PEG saturés, (E) le rinçage des flocons de PEG à l’eau et (F) le stockage du collagène à ultra-haute densité dans des tubes de microcentrifugation. (G-L) Processus de découpe des lames de verre : (G) acquisition de lames de verre pour l’étude, (H, I) marquage de la lame de verre avec un coupe-verre à pointe de diamant, (J) bris de la lame de verre du côté non enrayé, (K) rinçage du verre taillé à l’eau et (L) séchage de la lame de verre. Fabriqué à l’aide de BioRender. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67165/67165fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67165/67165fig02.jpg"> 
Figure 2 : Procédé de fabrication d’hydrogel de collagène aligné. Étape 1 : Extrusion de collagène sous cisaillement dans le tampon chauffé 10x PBS et induction de la fibrillogenèse ; Étape 2 : Montage du collagène extrudé sur des lames de verre taillé ; Étape 3 : Montage de collagène extrudé supplémentaire pour augmenter la taille de l’hydrogel ; et Étape 4 : Séchage des hydrogels de collagène. Fabriqué à l’aide de BioRender. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67165/67165fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67165/67165fig03.jpg"> 
Figure 3 : Procédé de fabrication aléatoire d’hydrogel de collagène. Étape 1 : Extrusion de collagène sur des lames de verre taillé (bande unique) ; Étape 2 : L’extrusion continue du collagène augmente la taille (plusieurs bandelettes) ; Étape 3 : Immersion du collagène extrudé dans un tampon PBS 10X pour initier la fibrillogenèse ; et Étape 4 : Séchage des hydrogels. Fabriqué à l’aide de BioRender. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67165/67165fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67165/67165fig04.jpg"> 
Figure 4 : Étapes d’erreur possibles dans le processus de fabrication de l’hydrogel de collagène. (A-F) Exemples de (A) bandes de collagène d’épaisseur optimale, (B) de bandes de collagène excessivement épaisses, (C) de bandes de collagène insuffisamment épaisses, (D) de bandes de collagène ondulées et (E,F) de surfaces de collagène trop lavées montrées à l’aide de la microscopie électronique à balayage. Barre d’échelle = 1 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67165/67165fig04large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67165/67165fig05.jpg"> 
Figure 5 : Images de microscopie électronique à balayage d’hydrogels de collagène alignés et aléatoires. Les images ont été prises à l’aide d’un microscope électronique. Les conditions du faisceau ont été réglées à 2 keV, avec une plage de courant de 25 à 100 pA et une distance de travail de 4 à 5 mm. Les images ont été enregistrées de manière cohérente à une résolution de 6144 x 4096 pixels avec un temps de séjour de 1 μs. Barre d’échelle = 1 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67165/67165fig05large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67165/67165fig06.jpg"> 
Figure 6 : Myoblastes primaires de souris cultivés sur des hydrogels de collagène alignés et aléatoires. Les myoblastes ont été cultivés sur les hydrogels pendant 3 jours avant l’imagerie. Des images en champ clair ont été prises à un grossissement de 10x à l’aide d’un microscope inversé. La flèche indique l’orientation alignée des nanofibrilles. Barre d’échelle = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67165/67165fig06large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>

Production de collagène à motifs nanofibrillaires pour l’ingénierie tissulaire

Regenerative biomaterials are designed to facilitate cell-material interactions to guide the repair of damaged tissues and organs. These materials are ...

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Dans ce travail, nous présentons une technique de fabrication rapide de tissus vasculaires vivants par culture directe de collagène, de cellules musculaires lisses et de cellules endothéliales. De plus, un nouveau protocole pour la caractérisation mécanique des tissus vasculaires modifiés est décrit.

Ingénierie 3D cellularisé collagène Gels pour la régénération tissulaire vasculaire

La création de microtissus fonctionnels dans les dispositifs microfluidiques nécessite la stabilisation des phénotypes cellulaires en adaptant les techniques traditionnelles de culture cellulaire aux dimensions spatiales limitées des microdispositifs. La modification du collagène permet le dépôt couche par couche d’assemblages de collagène ultraminces qui peuvent stabiliser les cellules primaires, telles que les hépatocytes, en tant que modèles de tissus microfluidiques.

Couche par couche dépôt de collagène dans les dispositifs microfluidiques pour Microbroyeur stabilisation

Une technique de biofabrication innovante a été développée pour concevoir des constructions tridimensionnelles qui ressemblent aux caractéristiques architecturales, aux composants et aux propriétés mécaniques des tissus in vivo. Cette technique fait appel à un matériau sacrificiel nouvellement développé, le caoutchouc BSA, qui transfère des caractéristiques spatiales détaillées, reproduisant les architectures in vivo d’une grande variété de tissus.

Trois dimensions technologie biomimétique: Roman Biorubber Crée Défini micro et macro-échelle Architectures en collagène hydrogels

Présenté ici est un protocole pour générer des tissus conjonctifs modifiés pour une culture parallèle de 48 tissus dans une plaque multi-puits avec des doubles pôles, adapté aux études mécanistes, à la modélisation des maladies et aux applications de dépistage. Le protocole est compatible avec les fibroblastes de différents organes et espèces et est illustré ici avec les fibroblastes cardiaques primaires humains.

Tissu conjonctif humain dérivé de fibroblastes pour les applications de dépistage

Ce protocole démontre l’utilisation d’un canal microfluidique avec une géométrie changeante le long de la direction d’écoulement du fluide pour générer une déformation d’extension (étirement) afin d’aligner les fibres dans un hydrogel de collagène 3D (&lt;250 μm d’épaisseur). L’alignement résultant s’étend sur plusieurs millimètres et est influencé par la vitesse de déformation extensionnelle.

Hydrogels de collagène 3D Microtechnique avec alignement de fibres à longue portée

Les inserts de culture tissulaire avec membranes en plastique sont la référence dans les laboratoires de culture cellulaire en tant que supports perméables pour établir des couches cellulaires et des modèles de tissus barrières. Ici, nous présentons une méthode simple pour remplacer la membrane plastique par une membrane plus pertinente sur le plan biologique, fabriquée à partir d’une protéine de soie d’araignée fonctionnalisée recombinante.

Membrane basale nanofibrillaire en soie d’araignée fonctionnalisée recombinante dans des inserts de culture tissulaire sur mesure

Découvrez une méthode d'extrusion par cisaillement pour fabriquer des hydrogels de collagène à motifs nanofibrillaires. Cette technique contrôle l'organisation des fibrilles pour guider les interactions cellulaires en ingénierie tissulaire.

Production de collagène à motifs nanofibrillaires pour l’ingénierie tissulaire

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