Name: Mise en place d’un nouveau système de perfusion pulmonaire ex vivo pour les poumons de rat après mort circulatoire (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-18T14:10:00.000+00:00
Duration: 9 min 14 s
Description: Découvrez un modèle de perfusion pulmonaire ex vivo chez le rat maintenant la fonction pulmonaire pendant 4 heures. Cette méthode simple et reproductible permet d'étudier l'amélioration des poumons de donneurs marginaux.

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Ce travail a été soutenu par le National National High-Level Hospital Clinical Research Funding et le projet Elite Medical Professionals de l’Hôpital de l’amitié Chine-Japon (numéros de subvention[2022-NHLHCRF-LX-03-0303] et [ZRJY2021-GG07]).

Les animaux de laboratoire étaient des rats mâles SD pesant de 250 à 400 g. Les rats ont été logés dans des conditions expérimentales standard à 18-22 °C avec un cycle contrôlé lumière-obscurité de 12 h et avaient un accès libre à la nourriture et à l’eau. Le Comité de protection et d’utilisation des animaux de l’Institut de recherche clinique de l’Hôpital de l’amitié Chine-Japon a approuvé les expériences sur les animaux et les a menées conformément aux directives. Toutes les chirurgies ont été effectuées sous anesthésie générale. La figure 1 présente un schéma de principe et une image réelle du système EVLP à titre de référence. La marque et le modèle spécifiques de tous les instruments et équipements utilisés sont détaillés dans le tableau des matériaux
1. Construction de l’appareil
NOTE : Le plastique imprimé en 3D semble être un choix prometteur pour l’appareil. Cependant, sur la base de notre expérience limitée, il est difficile de réguler la force lors de la réalisation de nœuds avec des matières plastiques ; Trop peu de force peut faire glisser le tube, et trop de force peut bloquer le tube en plastique. Les tubes rigides en métal évitent ces problèmes et sont relativement durables, ils sont donc utilisés ici.
<ol>
	<li>Connectez le module au tuyau en plastique et utilisez un support de cadre en fer et une plate-forme élévatrice réglable pour positionner toutes les pièces à la hauteur appropriée. Ajoutez 150 ml de perfusion dans le réservoir de stockage de liquide, ouvrez la pompe péristaltique et réglez le débit à 20 ml/min pour que la perfusion remplisse le tube.</li>
	<li>1.2Meuler une rainure circulaire pour l’intubation endotrachéale. Préparez un mélange gazeux contenant 8 % d’O2, 6 % de CO2 et 86 % de N2 sous forme de gaz hypoxique. Passer le gaz hypoxique dans la perfusion à travers la membrane pulmonaire artificielle. Aérez avec de l’oxygène pur pendant 5 minutes avant la mesure des gaz du sang.</li>
	<li>Fabriquez l’artère pulmonaire et les canules auriculaires à partir de tubes creux en acier inoxydable 304 incurvés pour s’adapter à l’anatomie des rats (Figure 2A). Meuler une rainure circulaire pour l’intubation artérielle. Faites un trou à l’extrémité distale de la paroi de la canule auriculaire et polissez le sillon annulaire sur la paroi externe (Figure 2C). Placez un dispositif d’évacuation avant le tube dans le tube de perfusion de l’artère pulmonaire.</li>
	<li>Connectez une vanne à trois voies au système de circulation externe du bain-marie et régulez la température du réservoir, du compartiment de l’organe et du perfusat de l’artère pulmonaire. Minimisez la longueur du tuyau de raccordement sans bain-marie et contrôlez l’erreur de température en tous points de l’appareil dans la plage de ± 0,2 °C. La température souhaitée pour la conception de l’étude est de 37 °C.</li>
	<li>Remplissez la conduite de surveillance de la pression avec une solution saline et ajustez le dispositif de surveillance de la pression à la même hauteur que le poumon du donneur. Ouvrez la vanne pour connecter la ligne de surveillance de la pression à l’artère pulmonaire et à la ligne de perfusion veineuse, démarrez le collecteur de données et réglez zéro. Surveillez la pression de perfusion artérielle et la pression de retour veineux en temps réel.</li>
</ol>
2. Anesthésie chez le rat
<ol>
	<li>Portez de l’équipement de protection individuelle : masques chirurgicaux, gants et combinaisons jetables avant de manipuler des rats et des tissus pour rats.</li>
	<li>Pesez les rats et notez leur poids. Remplissez une seringue avec 1000 U/kg d’héparine et injectez-la dans la veine de la queue à l’aide d’une aiguille.</li>
	<li>Placez les rats dans une chambre d’induction fermée et anesthésiez-les avec du gaz isoflurane à 3 %. Clamp les orteils des rats ; S’il n’y a pas de réponse, cela indique que les rats ont atteint la profondeur d’anesthésie souhaitée. Sinon, continuez à augmenter le temps d’anesthésie. Appliquez une pommade ophtalmique stérile pour prévenir la sécheresse oculaire.</li>
	<li>Préparez plusieurs sutures (3-0 ou 4-0). Transférez les rats sur la table d’opération, placez-les en position couchée, fixez-les avec des sutures et désinfectez-les avec un spray alcoolisé.</li>
</ol>
3. Obtention de poumons de donneur
<ol>
	<li>Placez la tête du rat dans le masque d'anesthésie et maintenez l'anesthésie en délivrant de l'air contenant 1,5 % d'isoflurane. Clamp les orteils des rats ; S’il n’y a pas de réponse, cela indique que les rats ont atteint la profondeur d’anesthésie souhaitée.</li>
	<li>Faites une incision longitudinale de 2 à 3 cm avec des ciseaux chirurgicaux pour rongeurs le long de la ligne médiane du cou devant la trachée, coupez la peau, disséquez le tissu musculaire devant la trachée et exposez complètement la trachée.</li>
	<li>Libérez l’espace derrière la trachée, passez-y une suture 3-0 et faites un nœud lâche pour une utilisation ultérieure. Faites une incision en forme de V de 0,5 cm avec des ciseaux chirurgicaux pour rongeurs au-dessus du nœud de la trachée, insérez une sonde trachéale (14G) dans la trachée, serrez le nœud de suture et fixez la sonde trachéale (Figure 3A).</li>
	<li>Connectez le tube trachéal au ventilateur, allumez-le et commencez la ventilation des poumons.</li>
	<li>Surveillez et enregistrez fréquemment les signes vitaux pour assurer l’anesthésie et les changements dans les signes vitaux jusqu’à ce que le décès soit confirmé.</li>
	<li>Lancez les manœuvres de recrutement pulmonaire, redémarrez la ventilation mécanique en mode contrôlé par pression et ventilez pendant 5 min. Utilisez les paramètres suivants : PEP 3 cmH2O, rapport inspiratoire : expiratoire (I :E) 1:2, fréquence respiratoire 40 respirations/min et FiO2 0,5.</li>
	<li>Clampez la trachée et laissez les poumons subir 1 h de temps ischémique chaud (WIT). Après la période WIT, extrayez les poumons comme décrit ci-dessous et divisez-les au hasard en trois groupes : (1) prélèvement direct des poumons, (2) conservation statique à froid (CS) de 4 h et (3) évaluation EVLP de 4 h.</li>
	<li>Pour le prélèvement direct des poumons, prélever des échantillons des poumons du donneur obtenus sans aucun traitement pour divers tests. Pour une conservation statique à froid (CS) de 4 h, conservez les poumons du donneur en conservation statique à froid au réfrigérateur à 4 °C pendant 4 h, puis prélevez un échantillon pour détection. 4 h d’évaluation EVLP. Pour une évaluation EVLP de 4 h, suivez l’étape 5.</li>
	<li>Réglez la table d’opération sur une position inclinée de 45° vers la tête et les pieds bas.</li>
	<li>Retirez les poils avec un rasoir à cheveux au milieu de la poitrine et de l'abdomen du rat, désinfectez-les avec de l'iode 3x et drapez-les avec une serviette chirurgicale.</li>
	<li>Faites une incision longitudinale de 6 à 7 cm le long de la ligne médiane de l'abdomen avec des ciseaux chirurgicaux pour rongeurs, coupez la peau, ouvrez la paroi abdominale jusqu'à la cavité abdominale et exposez les organes abdominaux. Utilisez un coton-tige pour pousser doucement les intestins vers le côté droit de la cavité abdominale afin d’exposer la veine cave inférieure derrière eux.</li>
	<li>À l’aide d’une seringue, injectez une solution de 1000 U/kg d’héparine dans la veine cave inférieure. Attendre 5 min pour assurer une héparinisation adéquate du sang. L’héparine empêche la formation de microthrombi dans l’artère pulmonaire.</li>
	<li>Coupez la veine cave inférieure du rat avec des ciseaux, en l'exsangue. Démarrer la ventilation mécanique des poumons avec les réglages initiaux du ventilateur à un volume courant de 3 mL/kg, une pression positive en fin d’expiration (PEP) de 2 cmH2O, une fréquence respiratoire de 60 respirations/min et un rapport I :E de 1:2.</li>
	<li>Utilisez des pinces pour soulever le processus xiphoïde ; faites une incision longitudinale le long du sternum de bas en haut. Utilisez un écarteur de côtes pour exposer la cavité thoracique. Retirez le tissu du thymus pour exposer le cœur et les principaux vaisseaux sanguins en dessous. 
	REMARQUE : Les poumons du rat sont fragiles ; Évitez de les toucher ou de toucher les organes abdominaux avec des instruments métalliques. Pour une meilleure visibilité, écartez doucement les poumons à l’aide d’un coton-tige.</li>
	<li>Libérez l'aorte du rat et l'espace derrière l'artère pulmonaire, faites-y passer une suture 3-0 et faites un nœud lâche pour une utilisation ultérieure.</li>
	<li>Faites une incision en forme de V de 2 à 3 mm sur la surface antérieure de la voie d’éjection du ventricule droit, insérez une canule de l’artère pulmonaire dans l’artère pulmonaire à travers l’incision et serrez la suture pré-nouée pour fixer la canule (Figure 3B).</li>
	<li>Coupez l’extrémité du cœur de rat, insérez une pince hémostatique dans le ventricule gauche, perturbez les valves entre le ventricule gauche et l’oreillette gauche et assurez-vous que la voie d’évacuation auriculaire gauche est dégagée.</li>
	<li>Connectez la canule de l’artère pulmonaire au circuit de perfusion et rincez le sang résiduel à un taux de 0,6 à 1 mL/min en utilisant 15 mL de solution à faible teneur en potassium. Rincer jusqu’à ce que les poumons deviennent blancs ou jusqu’à ce que le liquide de perfusion sortant du ventricule gauche devienne blanc.</li>
	<li>Placez une suture derrière le cœur et encerclez le ventricule, insérez la canule du ventricule gauche dans l’incision pratiquée dans le ventricule gauche et serrez la suture pré-nouée pour fixer la canule (Figure 3C).</li>
	<li>Coupez la trachée au-dessus du tube trachéal, soulevez la trachée et utilisez des ciseaux pour séparer le tissu conjonctif derrière la trachée vers le bas jusqu’au niveau du diaphragme.</li>
	<li>Sectionner la veine cave inférieure et l’artère pulmonaire principale au-dessus du diaphragme, enlever le cœur et les poumons (<classe forte="xfig">Figure 3D).</li>
	<li>Pour garder les poumons gonflés, clampez immédiatement le tiers inférieur de la trachée à la fin de l’inspiration, recueillez le cœur et les poumons et placez-les dans une solution à faible teneur en potassium pour la conservation.</li>
	<li>Placez le cœur et les poumons dans la position désignée du circuit EVLP et connectez la canule du ventricule gauche au circuit de perfusion (Figure 4A).</li>
</ol>
4. Initialisation du système de perfusion pulmonaire ex vivo
<ol>
	<li>Assemblez le circuit EVLP : connectez le tube, l’oxygénateur, le réservoir, la pompe péristaltique et la chambre de l’organe.</li>
	<li>Remplissez le circuit EVLP avec 120 ml de solution réparatrice de perfusion pulmonaire contenant 1000 unités d’héparine sodique, 50 mg de céfopérazone et 50 mg de méthylprednisolone avant la perfusion. Débarrassez-vous de toutes les bulles d’air dans le tube afin d’utiliser le dispositif d’évacuation à la fin de la perfusion de l’artère pulmonaire.</li>
	<li>Réglez le bain-marie à température ambiante et commencez à faire circuler de l’eau tiède pour chauffer l’ensemble du circuit EVLP.</li>
	<li>Ouvrez le programme d'acquisition de données de l'ordinateur et connectez le capteur de pression artérielle pulmonaire, le capteur de poids pulmonaire, le capteur de vitesse de la pompe et le capteur de température au circuit EVLP et à l'enregistreur.</li>
	<li>Remplissez la tubulure de surveillance de la pression artérielle avec une solution saline normale, ajustez la hauteur de la table pour qu'elle corresponde à la hauteur du poumon fourni, connectez la tubulure de surveillance de la pression à l'artère pulmonaire et à la tubulure de perfusion veineuse, ouvrez la vanne, démarrez le collecteur de données et mettez le système à zéro.</li>
	<li>Ouvrez la valve de gaz hypoxique, faites passer le gaz hypoxique à travers la membrane pulmonaire pendant 10 minutes jusqu’à ce que la solution de perfusion atteigne un état hypoxique stable, fermez la valve de gaz et mettez en pause la pompe péristaltique, en attendant l’arrivée du poumon donneur pour une perfusion pulmonaire ex vivo.</li>
	<li>Préparez la table d’opération et les instruments chirurgicaux près de la plate-forme EVLP pour petits animaux et pré-stérilisez-les avec une stérilisation à la vapeur à haute pression.</li>
</ol>
5. Perfusion pulmonaire ex vivo
<ol>
	<li>Remplissez le piège à bulles avec une quantité suffisante de solution de perfusion pour éviter que les bulles ne pénètrent dans les poumons (provoquant une embolie gazeuse).</li>
	<li>Placez l’unité cardiopulmonaire dans la chambre de l’organe, connectez-la à l’appareil EVLP, allumez le ventilateur et la pompe péristaltique, puis démarrez la perfusion EVLP (Figure 4B).</li>
	<li>Commencer la perfusion à 20 % du débit cible ; augmenter progressivement le débit jusqu’au débit cible dans l’intervalle de 1 h ; calculer le débit cible à 20 % du débit cardiaque (75 mL/min/250 g de poids du donneur).</li>
	<li>Réglez l’échangeur de chaleur à 40 °C pour maintenir une température pulmonaire de 37,5 °C. En 20 min, la température de la solution de perfusion passe de 25°C à 37°C.</li>
	<li>Retirer la pince endotrachéale 20 min après le début de la perfusion. Démarrer la ventilation mécanique avec une fréquence respiratoire (RR) de 60 bpm, une pression expiratoire positive (PEP) de 3 cmH2O et un volume courant initial (VT) de 4 mL/kg, pour atteindre un volume courant maximal de 6 mL/kg en 10 min.</li>
	<li>Commencer l’écoulement du gaz hypoxique (8 % de CO2, 6 % d’O2 et 86 % de N2) pour maintenir la solution de perfusion PCO2 pénétrant dans l’artère pulmonaire entre 35 et 45 mmHg simultanément pendant la ventilation.</li>
	<li>Surveillez en permanence le débit de la solution de perfusion, la pression artérielle, la pression de pointe des voies respiratoires et les paramètres de la fonction pulmonaire pendant la perfusion.</li>
</ol>

Evaluation of Apoptosis and Lung Injury in DCD Donor Lungs Preserved by EVLP

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</ol>

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Cette étude présente une conception modulaire et rentable pour une plateforme EVLP pour petits animaux et la validation de l’efficacité de cette plateforme dans un modèle de DCD chez le rat. Les résultats indiquent que l’EVLP peut améliorer considérablement la qualité des poumons de donneurs décédés, élargissant ainsi le bassin de donneurs potentiels pour la transplantation pulmonaire. La rareté des poumons de donneurs pour la transplantation reste un défi majeur. Pour remédier à ce problème, certains pays ont commencé à mettre en œuvre des programmes de DDC28. Cette approche offre une stratégie précieuse pour augmenter le nombre de greffes d’organes viables. Notamment, de nombreuses études ont montré que les taux de survie à long terme après une transplantation hépatique à l’aide d’organes de DDC sont comparables à ceux utilisant des organes de DBD29,30. Cependant, l’utilisation des poumons des donneurs de DDC reste limitée en raison des dommages importants causés par une ischémie prolongée31. L’évaluation et l’utilisation efficaces des ressources pulmonaires limitées obtenues des donneurs de DDC offrent un immense potentiel pour atténuer la pénurie de poumons transplantables. L’EVLP est une technique prometteuse qui permet d’améliorer la qualité des poumons et d’allonger leur temps de conservation avant la transplantation. Pour valider l’efficacité de l’EVLP par rapport à l’entreposage frigorifique à 4 °C, nous avons utilisé un modèle de mort circulatoire chez le rat. Nous émettons l’hypothèse que notre technique de perfusion peut atténuer les dommages causés par les lésions d’ischémie-reperfusion et améliorer la fonction pulmonaire après une mort circulatoire. Nos résultats expérimentaux sont cohérents avec les résultats récents rapportés par Wang et al.32 et Hasenauer et al.33.
Le maintien d’une température constante tout au long du circuit de perfusion est crucial pour un fonctionnement optimal de l’EVLP. Cependant, de nombreux systèmes EVLP existants ne disposent pas de mécanismes de contrôle de la température fiables et adaptables. Les systèmes d’échange de chaleur simples nécessitent souvent des ajustements qui modifient la température à des endroits spécifiques. Cette fluctuation de température peut affecter la composition du liquide de perfusion, perturber les mesures de l’indice d’oxygénation et, en fin de compte, compromettre la précision des résultats expérimentaux. Afin de surmonter cette difficulté, un système EVLP a été créé et équipé de trois échangeurs de chaleur à bain d’eau séparés qui ont été placés dans le réservoir, les zones de perfusion de l’artère pulmonaire et la chambre de l’organe. De plus, le système utilise un minimum de tuyauterie pour minimiser les pertes de chaleur et assurer un contrôle précis de la température dans une plage de 4 à 40 °C. Cette configuration permet un contrôle très précis de la température, les températures mesurées dans chaque segment de circuit ne s’écartant pas de plus de ± 0,2 °C du point de consigne. La conception répond efficacement aux exigences strictes de contrôle de la température pour les expériences EVLP. 
Les modèles de petits animaux, en raison de leurs organes plus petits, sont particulièrement sensibles à l’œdème pulmonaire et à l’atélectasie34. Ces complications entravent considérablement la réalisation d’expériences de perfusion de longue durée. Pour relever ce défi et assurer une protection pulmonaire optimale pendant la perfusion, nous avons adopté l’approche de Toronto, la référence actuelle en matière de pratique clinique. Cette méthode implique une augmentation progressive du débit de perfusat et de la ventilation sur une période de temps définie35. La perfusion a été amorcée à 10 % du débit cible (20 % du débit cardiaque = 75 mL/min/250 g de poids du donneur) et a augmenté progressivement sur 1 h. De même, la ventilation a été amorcée à un faible rythme (4 mL/kg), et le volume courant a été augmenté progressivement jusqu’à un maximum de 6 mL/kg sur 10 min. La recherche met également en évidence les avantages de l’ajout d’albumine sérique bovine (BSA) au perfusat. La supplémentation en BSA augmente la pression osmotique colloïdale, réduisant ainsi l’œdème tissulaire36. Dans l’EVLP des petits animaux, il existe deux configurations de perfusion primaires basées sur la canulation auriculaire : en boucle fermée et en boucle ouverte. Les systèmes en boucle fermée maintiennent une pression constante et basse à l’intérieur des oreillettes, imitant les conditions physiologiques et facilitant des mesures précises des gaz du sang. Une étude de Linacr et al. a démontré que le maintien d’une pression auriculaire spécifique pendant la perfusion peut améliorer la fonction pulmonaire et réduire l’œdème34. Cependant, des pics de pression peuvent se produire si le muscle auriculaire obstrue le circuit. De plus, l’attache de l’oreillette et la présence de bulles d’air peuvent compromettre les résultats expérimentaux en raison de lésions potentielles des fibres myocardiques et de lectures de pression incohérentes7. Pour surmonter ces limitations et obtenir une perfusion efficace en boucle fermée, une canule auriculaire spécialement conçue a été fabriquée. Cette canule est dotée d’une attelle saillante à son extrémité pour éviter l’obstruction par le muscle auriculaire. De plus, les rainures annulaires le long du corps de la canule facilitent le placement sécurisé de la ligature. De plus, le système intègre des pièges à bulles et des techniques de pré-perfusion pour éliminer l’embolie gazeuse et maintenir une pression de perfusion constante. 
Les plateformes EVLP pour petits animaux sont privilégiées dans la recherche scientifique pour leurs nombreux avantages : conditions animales contrôlées, rentabilité, prise en charge d’échantillons de grande taille et faible consommation de liquide de perfusion. De plus, l’utilisation d’une seule souche animale de petite taille (par exemple, les rats dans cette étude, mais aussi les cobayes et les lapins 24,35,36) permet un contrôle méticuleux du régime alimentaire et des paramètres expérimentaux. La polyvalence du système permet de s’adapter à toutes ces espèces en ajustant les paramètres respiratoires et le débit de perfusion. Les vidéos d’accompagnement détaillent le modèle animal et les procédures EVLP, offrant aux chercheurs une compréhension complète. En suivant ces protocoles, les chercheurs peuvent améliorer le succès des expériences, minimiser la souffrance animale et réduire l’utilisation globale des animaux.
Bien que la recherche ait permis d’établir un système EVLP abordable, modulaire et convivial pour les petits animaux qui surpasse les options commerciales en termes de stabilité, de qualité de perfusion et d’ajustement, des recherches supplémentaires sont nécessaires pour optimiser les protocoles EVLP, y compris les paramètres de perfusion et de ventilation, et identifier les médicaments de protection pulmonaire les plus efficaces. Cette technologie conviviale et efficace a permis de réaliser des tests réussis sur de nombreux poumons de donneurs en tirant parti de l’infrastructure. Les efforts de recherche actuels sont axés sur la restauration et la conservation des poumons provenant de donneurs.

La transplantation pulmonaire (LTx) reste le seul traitement définitif pour les patients atteints d’une maladie pulmonaire en phase terminale. Le succès de la transplantation pulmonaire dépend de la disponibilité de poumons de donneurs de haute qualité et d’une fonction adéquate. Cependant, une liste d’attente croissante pour les greffes de poumons est apparue à l’échelle mondiale en raison d’une pénurie critique de poumons de donneurs1. De nombreux patients sur la liste d’attente connaissent un déclin de leur santé, voire la mort, dans l’attente d’un poumon de donneur compatible dans un délai raisonnable2. Par conséquent, il est crucial d’élargir le pool de greffons potentiels pour répondre aux besoins des patients sur la liste d’attente de greffe. Le don après mort cardiocirculatoire (DCD)1,3 et la perfusion pulmonaire ex vivo (EVLP)4,5 sont deux stratégies prometteuses pour augmenter le nombre de poumons disponibles pour la transplantation. À l’heure actuelle, le don après la mort cérébrale (DBD)6 est la principale source de transplantations pulmonaires. Cependant, en raison de la pénurie actuelle de greffes, le DCD gagne du terrain. Ce changement est dû aux limites des greffes DBD, où les changements dans le flux sanguin, la ventilation mécanique, l’infection et l’aspiration peuvent compromettre la qualité du greffon. La qualité du greffon a un impact direct sur les résultats du patient et sur la survie à long terme après la transplantation. Le processus de perfusion pulmonaire ex vivo (EVLP) a effectivement augmenté le nombre de greffes pulmonaires disponibles en réévaluant les greffons pulmonaires de donneurs après une mort cardiaque (DCD), ce qui a donné des résultats similaires à court et à long terme 7,8. Le but de cette étude était de développer un système de perfusion pulmonaire extracorporelle chez des rats dont les poumons sont cycliquement morts et d’évaluer avec précision les donneurs de DCD. Afin de réduire la probabilité de dysfonctionnement primaire du greffon (DPI), les dommages causés aux donneurs de TDC9 peuvent être minimisés en utilisant des diagnostics moléculaires10 et en utilisant des traitements ciblés spécialisés.
EVLP est une technique qui reproduit l’environnement naturel des poumons à l’extérieur du corps, en maintenant une température physiologique normale. Il permet une surveillance et une évaluation continues des poumons11,12, prolonge le temps de conservation des greffes13, et utilise la perfusion externe, la ventilation et les médicaments pour améliorer la qualité des poumons marginaux, les rendant adaptés à la transplantation14. La première utilisation réussie de poumons de donneurs marginaux pour la transplantation pulmonaire à l’aide de l’EVLP a été signalée par Steen et al. en 200715. Depuis lors, l’utilisation de la technologie EVLP s’est progressivement intégrée dans la pratique clinique 16,17. L'équipe de Toronto a par la suite adapté l'approche EVLP en utilisant la ventilation à faible volume courant et les faibles débits en conjonction avec la stratégie de protection pulmonaire idéale d'une pompe centrifuge ; Cela a entraîné une perfusion régulière pendant une durée de 12 h18.
EVLP offre plusieurs avantages, notamment la réduction du risque d'échec du greffon primaire, la minimisation de l'œdème pulmonaire, l'atténuation de l'inflammation liée à la mort cérébrale, la préparation du système immunitaire du receveur à la transplantation et la prévention des infections pulmonaires, de l'aspiration, de l'embolie pulmonaire et des lésions d'ischémie-reperfusion14,19,20. Bien que l’EVLP offre des avantages significatifs, il est nécessaire d’améliorer les méthodes pour améliorer la qualité des greffons.
Actuellement, il n’y a pas de consensus sur les paramètres spécifiques de perfusion et de ventilation dans la plateforme EVLP pour rats. Ohsumi et al.21 ont conçu un nouveau modèle pour étudier comment les poumons de donneurs qui ont été soumis à de longues périodes d’ischémie froide (CIT) pouvaient conserver leur fonction pulmonaire pendant le processus de perfusion pulmonaire ex vivo (EVLP) et après avoir été transplantés. À l’échelle internationale, plusieurs efforts ont été déployés pour créer des modèles de perfusion pulmonaire ex vivo (EVLP) chez le rat22,23,24,25,26,27 afin d’obtenir une perfusion plus fiable et plus précise. Par conséquent, il est essentiel de développer un système EVLP pour petits animaux rentable, hautement reproductible et étroitement contrôlé afin de faciliter la poursuite des recherches dans ce domaine. Les systèmes EVLP existants pour les petits animaux sont souvent coûteux et ont une flexibilité limitée en termes de modification des conditions de fonctionnement pour différents besoins de recherche. Cet article propose une conception de système EVLP rentable et adaptable. En outre, il fournit une explication détaillée des étapes techniques et chirurgicales nécessaires à sa mise en œuvre. Nous avons utilisé un modèle utilisant des rats morts en arrêt circulatoire pour démontrer que l’EVLP améliore la qualité des poumons DCD, augmentant ainsi le nombre de donneurs de poumons viables pour la transplantation. Notre objectif est de partager notre expérience réussie pour aider d’autres chercheurs à établir une plateforme EVLP facilement disponible pour les petits animaux après une mort cardiocirculatoire.

<table><tbody><tr><td>Tubulure aseptique médicale 3,0 mm</td><td>Zhifang Pump industry Co., LTD, Hebei, Chine</td><td>3,0 mm</td><td>Dans la circulation du sang, plutôt que des vaisseaux sanguins</td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine</td><td>Sigma-Aldrich Trading Co.Ltd, Shanghai, Chine</td><td>BSAV-RO</td><td>Améliorer la pression osmotique colloïdale de la perfusion</td></tr><tr><td>Transducteur de pression artérielle intravasculaire BP-100 / 102</td><td>iWorx Systems, Inc, New Hampshire, États-Unis</td><td>BP-100 / 102</td><td>Enregistrements de la pression vasculaire pulmonaire chez le rat</td></tr><tr><td>Cefazolin</td><td>Beijing psaitong Biotechnology Co., Ltd, Pékin, Chine</td><td>PHR1291</td><td></td></tr><tr><td>Désoxygénateur</td> antibactérien <td>Dongguan Kewei Medical Instrument, Guangdong, Chine</td><td>Aucune spécification de modèle Remplacer</td><td>la fonction pulmonaire du rat Échange gazeux dans le sang</td></tr><tr><td>F500 Appareil d’anesthésie générale pour petits animaux</td><td>Beijing Yi Zejia Technology Co., LTD, Pékin, Chine</td><td>F500</td><td>Administrer une anesthésie gazeuse pour l’administration d’un mélange de</td></tr><tr><td>gaz (6 % O2, 8 % CO2, 86 % N2)</td><td>Beijing Oriental Medical Gas Co., LTD, Pékin, Chine</td><td>Aucune spécification de modèle Maintenir</td><td>l’équilibre acido-basique sanguin, simule la physiologie vasculaire pulmonaire</td></tr><tr><td>Échangeur de chaleur</td><td>Changhong Precision Instrument Center, Shenzhen, Chine</td><td>DHC-05-B</td><td>Contrôle de la température dans le circuit de perfusion</td></tr><tr><td>héparine</td><td>Beijing psaitong Biotechnology Co., Ltd, Pékin, Chine</td><td>H0200000</td><td>Anti-micro thrombose</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>RWD Life Science Co., Ltd, Shenzhen, Chine</td><td>R510-22</td><td>Rats anesthésiés</td></tr><tr><td>Chambre d’isolement</td><td>Fabriqué à la main de Shanghai Leighton Industrial Co., LTD, Shanghai, Chine</td><td>Aucune spécification de modèle</td><td>Stockage de poumons de rat</td></tr><tr><td>Analyseur clinique portable i-STAT 1</td><td>Point of Care Abbott, Inc, NJ, États-Unis</td><td>300G</td><td>L’analyse des gaz du sang en perfusion</td></tr><tr><td>Enregistreur iWorx RA-834</td><td>iWorx Systems, Inc, New Hampshire, États-Unis</td><td>RA-834</td><td>Sortie du signal de pression des vaisseaux sanguins</td></tr><tr><td>pulmonaires Pompe péristaltique multicanal LabMate</td><td>Zhifang Pump industry Co., LTD, Hebei, Chine</td><td>LabMate2</td><td>Fournit de l’énergie pour le processus de circulation de perfusion</td></tr><tr><td>PERFADEX Plus</td><td>XVIVO Perfusion, Göteborg, Suède</td><td>NA</td><td>Le poumon du rat donneur a subi un prélavage ; solution à faible teneur en potassium&nbsp ;</td></tr><tr><td>canule pulmonaire</td><td>En acier inoxydable</td><td>304 acier inoxydable/SUS304</td><td>2.0/2.5 mm</td></tr><tr><td>Canule veineuse pulmonaire</td><td>En acier inoxydable</td><td>304/SUS304</td><td>4.0mm</td></tr><tr><td>QAH-INF-1 kit de dosage</td><td>Innopsys, Parcd’Activit&eacute ; s Activestre</td><td></td><td></td></tr><tr><td>R415 Ventilateur pour petits animaux</td><td>RWD Life Science Co., Ltd, Shenzhen, Chine</td><td>R415</td><td>La ventilation du poumon de rat</td></tr><tr><td>Réservoir</td><td>Shanghai Leighton Industrial Co., LTD, Shanghai, Chine</td><td>Capacité 1 L</td><td>Stockage de perfusion</td></tr><tr><td>SOLU-MEDROL</td><td>Beijing psaitong Biotechnology Co., Ltd, Pékin, Chine</td><td>M0639</td><td></td></tr><tr><td>NA Capteur de température (TM-100)</td><td>iWorx Systems, Inc, New Hampshire,</td><td>États-Unis TM-100</td><td>Enregistrer la température de perfusion pulmonaire</td></tr></tbody></table>

mise en place d’un nouveau système de perfusion pulmonaire ex vivo pour les poumons de rat après mort circulatoire

Establishment of a Novel Ex Vivo Lung Perfusion System for Rat Lungs After Circulatory Death

La rareté croissante des poumons de donneurs pour la transplantation a suscité un intérêt significatif pour l’utilisation des organes obtenus auprès de donneurs après une mort cardiaque (DCD). Cependant, il reste un défi critique à relever pour maximiser le nombre de poumons viables qui répondent à des critères stricts d’utilisation clinique. La perfusion pulmonaire ex vivo (EVLP) apparaît comme une technologie prometteuse pour évaluer et potentiellement améliorer la fonction des poumons donnés. Cet article décrit le développement d’une plateforme expérimentale rentable et reproductible sur les petits animaux, spécialement conçue pour la recherche EVLP. Cette plateforme offre un haut degré de personnalisation, permettant aux chercheurs d’adapter les paramètres expérimentaux pour répondre à des questions de recherche spécifiques dans le domaine de l’EVLP. L’équipe a établi un modèle de rat pour simuler le DCD et a mis en œuvre une approche de préservation en deux étapes. Les poumons ont été soumis à un stockage frigorifique statique à l’aide d’une solution de perfusat à 4 °C pendant 4 h, suivie d’une EVLP normothermique pendant 4 heures supplémentaires. Les chercheurs ont évalué divers paramètres de la fonction pulmonaire, notamment la résistance vasculaire pulmonaire, la compliance dynamique pulmonaire, les mesures des gaz sanguins du perfusat et la mort cellulaire apoptotique dans les tissus pulmonaires. L’étude démontre que l’EVLP pourrait améliorer considérablement les performances fonctionnelles des poumons DCD par rapport à un simple stockage frigorifique à 4 °C, ce qui suggère que l’EVLP a le potentiel d’atténuer les lésions d’ischémie-reperfusion et d’améliorer la fonction du greffon après une mort circulatoire, augmentant ainsi le nombre de poumons transplantables.

Évaluer le nombre de cellules apoptotiques détectées par coloration TUNEL, les niveaux de marqueurs inflammatoires (détectés dans le liquide de perfusion à l'aide du kit d'analyse QAH-INF-1) et l'aspect physique général (coloré à l'hématoxyline et à l'éosine (H&amp;E)) des poumons de donneurs à cœur battant dans tous les groupes est nécessaire pour déterminer dans quelle mesure l'EVLP a préservé les poumons de donneurs DCD. Tous les poumons de donneurs DCD ont subi 4 h de perfusion. La plupart des poumons ont présenté une compliance stable, avec une diminution progressive observée au cours des 4 heures (Figure 5B). Aucune différence significative n'a été observée concernant la résistance vasculaire et les niveaux d'oxygénation du greffon pulmonaire parmi les poumons de donneurs DCD (Figure 5A,C). Les niveaux de glucose dans le liquide de perfusion ont diminué au fil du temps, sans différence significative observée entre les rats individuels (Figure 5D). Les niveaux d'électrolytes dans le liquide de perfusion sont restés similaires entre les groupes (Figure 5E-F).
La coloration TUNEL a été réalisée à l'aide de la technique de marquage des extrémités cassées de l'ADN par la transférase de désoxynucléotidyl terminal dUTP, en utilisant le kit de détection de l'apoptose, conformément aux instructions du fabricant pour la détection nucléaire des cellules apoptotiques. La coloration TUNEL a été utilisée afin de quantifier l'apoptose (mort cellulaire programmée) des cellules épithéliales alvéolaires dans les poumons de donneurs DCD soumis à différentes conditions de préservation. Une analyse en aveugle du nombre de cellules apoptotiques a révélé un nombre significativement plus élevé de cellules positives dans le groupe de donneurs par rapport aux autres groupes. De plus, le groupe soumis à la préservation à froid a présenté un nombre plus élevé de cellules positives comparé aux poumons de donneurs DCD perfusés en EVLP (Figure 6). Cinq variables indépendantes ont été utilisées pour évaluer les sections histopathologiques colorées à l'hématoxyline et éosine (H&amp;E) : 1) l'infiltration de cellules inflammatoires dans l'espace alvéolaire, 2) l'épaississement du septum alvéolaire, 3) les hémorragies intra- et extra-alvéolaires, 4) l'œdème intra-alvéolaire, et 5) la formation de membranes hyalines. Chaque variable a été notée de 0 à 4 : 0 = négatif, 1 = léger, 2 = modéré, 3 = élevé et 4 = sévère. La somme des notes attribuées aux différentes variables a permis d'obtenir les scores totaux de lésion pulmonaire. Le score de lésion pulmonaire est significativement plus faible dans le groupe EVLP que dans le groupe de préservation statique à froid et dans le groupe témoin (Figure 7A). Un épaississement de la paroi alvéolaire et une hémorragie alvéolaire peuvent être observés dans le groupe de préservation statique à froid de 4 h (Figure 7B). La structure alvéolaire normale est conservée dans le groupe EVLP (Figure 7C).
<img alt="Schéma du montage de la circulation extracorporelle, oxygénation membranaire, schéma, méthode expérimentale." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67168/67168fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 1"> 
Figure 1 : Schéma et photographie du circuit de perfusion pulmonaire ex vivo (EVLP) pour petits animaux. Les lettres du schéma correspondent aux lettres de la photographie afin d'expliquer la fonction de chaque composant. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67168/67168fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Composants du système de chromatographie ; schéma des raccords métalliques, des embouts et des pièces de tuyauterie." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67168/67168fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 2"> 
Figure 2 : Canules sur mesure. (A) Canule de l'artère pulmonaire. (B) Canule trachéale. (C) Canule de l'oreillette gauche. (D) Un ensemble de canules pour la perfusion pulmonaire ex vivo chez le rat. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67168/67168fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Schéma de la procédure chirurgicale chez le rongeur montrant les étapes de la dissection cardiovasculaire et l'exposition des organes." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67168/67168fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 3"> 
Figure 3 : Isolement du poumon de rat. (A) La canule trachéale est mise en place et fixée à l’aide d’un point de suture en soie. (B) L’artère pulmonaire est canulée et ligaturée avec le point de suture en soie précédemment placé. (C) La canule de l’oreillette gauche est fixée avec un point de suture en soie. (D) Le tissu conjonctif est disséqué par voie émoussée afin d’extraire l’ensemble cœur-poumon. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67168/67168fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Dispositif expérimental de perfusion d'organe ; A : raccordements des tubulures, B : organe dans la chambre de conservation à des fins de recherche." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67168/67168fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 4"> 
Figure 4 : Dispositif de perfusion pulmonaire chez le rat. (A) Le bloc cœur-poumon est placé dans le circuit de perfusion pulmonaire ex vivo. (B) Un poumon correctement ventilé et perfusé, connecté au circuit EVLP. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67168/67168fig04large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Graphiques des paramètres physiologiques au fil du temps : PaO2/FiO2, CDyn, PVR, glucose, sodium, potassium." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67168/67168fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 5"> 
Figure 5 : Fonction pulmonaire au cours du protocole EVLP chez le rat. (A-F) Analyse de la fonction pulmonaire et des gaz sanguins des poumons donneurs soumis à une perfusion extracorporelle (EVLP) après une ischémie à chaud d'une heure (WIT). (A) Indice d'oxygénation pulmonaire. (B) Complaisance dynamique pulmonaire (Cdyn). (C) Résistance vasculaire pulmonaire (PVR). (D) Niveau de glucose dans la perfusion 4 heures après l'EVLP. (E) Niveau de sodium dans la perfusion 4 heures après l'EVLP. (F) Niveau de potassium dans la perfusion 4 heures après l'EVLP. Les barres d'erreur indiquent l'écart type. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67168/67168fig05large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Schéma de l&#x27;essai TUNEL avec coloration par DAPI, comparant les conditions DCD, DCD+COLD, DCD+EVLP." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67168/67168fig06.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 6"> 
Figure 6: Images représentatives de l'essai TUNEL pour différents cas. Cellules TUNEL-positives : la fluorescence verte montre les cellules apoptotiques ; DAPI : la fluorescence bleue représente le noyau ; Fusion : toutes les cellules, y compris celles subissant une mort cellulaire programmée (apoptose) ; DCD désigne le groupe de prélèvement pulmonaire direct. DCD+COLD désigne le groupe soumis à une préservation statique froide de 4 h. DCD+EVLP désigne le groupe soumis à 4 h de perfusion pulmonaire ex vivo. ex vivo perfusion pulmonaire ex vivo (EVLP) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67168/67168fig06large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Graphique en barres du score de lésion pulmonaire et analyse histologique des tissus pulmonaires, représentation des résultats expérimentaux." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67168/67168fig07.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 7"> 
Figure 7 : Score de lésion pulmonaire et observations histologiques. (A) Le score de lésion pulmonaire dans le groupe témoin, le groupe SCS et le groupe EVLP (*, p &lt;0,05). (B) Coupes représentatives colorées à l’hématoxyline et à l’éosine (H&amp;E) de donneurs conservés par préservation statique à froid (SCS). La flèche noire indique une rupture de l’épithélium capillaire pulmonaire, et les flèches bleues indiquent un épaississement des parois alvéolaires. (C) Coupes représentatives colorées à l’H&amp;E de donneurs soumis à l’EVLP. La flèche rouge indique une infiltration de cellules inflammatoires. (D) Coupes représentatives colorées à l’H&amp;E de donneurs prélevés directement (témoin). Les flèches noires indiquent une rupture et un saignement de l’épithélium capillaire pulmonaire. Les barres d’erreur indiquent l’écart type ; l’analyse de significativité a été réalisée par analyse de variance unidirectionnelle (ANOVA). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67168/67168fig07large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.</a>

L’objectif est de développer un nouveau modèle de perfusion pulmonaire ex vivo (EVLP) chez le rat capable de maintenir une fonction pulmonaire constante pendant 4 h tout au long de l’EVLP et de fournir à l’industrie des spécificités de mise en œuvre qui offriront une méthode solide pour appliquer l’EVLP à des modèles de rongeurs.

Mise en place d’un nouveau système de perfusion pulmonaire ex vivo pour les poumons de rat après mort circulatoire

The increasing scarcity of donor lungs for transplantation has spurred significant interest in the utilization of organs procured from donors after ...

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Cette vidéo montre une technique ex vivo de perfusion pulmonaire isolée. Il s’agit d’un outil de recherche pulmonaire qui aidera à l’étude de divers mécanismes physiologiques et pathologiques impliqués dans les procédures de transplantation pulmonaire.

Perfusion pulmonaire ex vivo : une technique de recherche pulmonaire dans un modèle de lapin

Ex-Vivo pulmonaire Perfusion (EVLP) a permis la transplantation pulmonaire chez l'homme pour devenir plus facilement accessible en permettant la capacité d'évaluer les organes et d'élargir le bassin de donneurs. Ici, nous décrivons l'élaboration d'un programme et des améliorations qui permettent un modèle reproductible pour l'expansion future EVLP de rat.

Méthode de isolé<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Lung perfusion dans un modèle rat: Leçons tirées élaboration d&#39;un programme EVLP Rat

La préparation pulmonaire isolée du lapin est un outil de référence dans la recherche pulmonaire. Cette publication vise à décrire la technique telle que développée pour l’étude des mécanismes physiologiques et pathologiques impliqués dans la réactivité des voies respiratoires, la préservation des poumons et la recherche préclinique dans la transplantation pulmonaire et l’œdème pulmonaire.

Système de perfusion pulmonaire isolé dans le modèle de lapin

Les poumons ex vivo sont utiles pour une variété d’expériences afin de recueillir des données physiologiques tout en excluant les variables confondantes des expériences in vivo. Les configurations commerciales sont souvent coûteuses et limitées dans les types de données qu’elles peuvent collecter. Nous décrivons une méthode de construction d’une configuration entièrement modulaire, adaptable à divers modèles d’étude.

Conception et mise en œuvre d’un modèle de perfusion pulmonaire ex vivo chez le rat

Ici, nous décrivons les étapes nécessaires à l’établissement d’un modèle EVLP chez le rat et montrons le profil inflammatoire associé aux poumons perfusés. L’objectif est de propager les connaissances et les expériences sur le modèle EVLP du rat, permettant la compréhension intégrale des réponses biologiques associées à cette technique révolutionnaire.

Etablissement d’un modèle de rat de perfusion pulmonaire ex vivo pour des connaissances translationnelles en transplantation pulmonaire

Ce protocole présente un modèle de perfusion pulmonaire ex-vivo chez le rat intégrant une exposition transitoire à un stress thermique calibré, favorisant des mécanismes de protection endogènes pour le reconditionnement thérapeutique des greffons pulmonaires endommagés. L’approche est évolutive et reproductible et soutient le développement de thérapies non médicamenteuses pour améliorer le succès de la transplantation pulmonaire.

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Les mécanismes conduisant au développement de l'hyperplasie intimale (IH) et la veine échec de la greffe sont encore mal compris. Cette étude décrit un système ex vivo pour perfuser les veines humaines sous écoulement et pression contrôlée. En outre, l'efficacité de renforcement de maille externe pour limiter le développement d'IH a été évaluée.

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Découvrez un modèle de perfusion pulmonaire ex vivo chez le rat maintenant la fonction pulmonaire pendant 4 heures. Cette méthode simple et reproductible permet d'étudier l'amélioration des poumons de donneurs marginaux.

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