Criblage de fragments covalents à l’aide du test quantitatif de liaison irréversible

Nous travaillons entre les départements de chimie et de sciences de la vie, développant de nouveaux ligands covalents réactifs pour une gamme de cibles de médicaments anticancéreux. On espère que ces molécules seront utilisées à l’avenir, soit comme thérapeutiques, soit peut-être comme sondes chimiques. Il existe donc plusieurs technologies pour le criblage des ligands covalents.

Celles-ci peuvent être divisées en deux grandes catégories : les techniques protéomiques où les composés sont incubés avec des cellules cultivées et la spectrométrie de masse utilisée pour déterminer quelles protéines les molécules marquent, et les méthodes basées sur des cibles où des bibliothèques d’électrophiles sont incubées avec des protéines individuelles. Un défi expérimental important concerne la réactivité des ligands covalents. Les molécules trop réactives apparaîtront souvent comme des résultats lors des tests de criblage, mais ne conviennent pas car elles marqueront de manière non sélective de nombreuses protéines différentes dans la cellule.

Le composé d’activité est donc crucial à prendre en compte à chaque étape de la découverte d’un médicament covalent. C’est pourquoi les groupes Mann et Armstrong de l’Imperial ont mis au point une nouvelle méthode de criblage des électrophiles contre une cible protéique, appelée le quantitatif irréversible ou le test qIT. Notre protocole fournit une nouvelle méthode indispensable de criblage d’électrophiles contre une cible protéique, qui est évolutive, ne nécessite pas de spectrométrie de masse et contrôle la réactivité intrinsèque du composé.

Pour commencer, préparez toutes les solutions mères requises et laissez-les à température ambiante pendant deux heures avant l’expérience. Dégazer le tampon de dosage quantitatif, irréversible ou qIT avec du gaz argon pendant environ 30 minutes. Pour effectuer un échange de tampon, diluez la solution protéique en excès de tampon de test qIT dégazé dans une unité de filtre de spin, et tournez à 4 000 G pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius pour concentrer la protéine.

Diluez ensuite la solution protéique cible à une concentration de 15 micromolaires dans un tampon de dosage qIT dégazé pour préparer neuf millilitres de solution. Distribuer la solution de TCEP-agraose, le tampon qIT et le stock de glutathion dans les puits appropriés des plaques de 384 puits. Transférez 1,8 microlitre de chaque puits correspondant de la plaque de bibliothèque de fragments pour créer une plaque de dilution composée diluant chaque composé à 1,5 millimolaire dans un tampon de dosage qIT, plus 3 % de DMSO.

À l’aide d’une station de pipetage 384, transférez 20 microlitres de solution composée de chaque puits de la plaque de dilution composée dans les deux plaques de réaction. Pour commencer, mettez en place le dosage quantitatif irréversible ou qIT avec la protéine et le glutathion souhaités. Distribuez du stock de 500 micromolaires CPM dans des aliquotes de 111,2 microlitres dans des tubes de microcentrifugation et stockez-les à 20 degrés Celsius.

Après avoir décongelé le stock de CPM, ajoutez-le à 40 millilitres de tampon de trempe de dosage qIT pour préparer une solution de 1,4 micromolaire Distribuez 27 microlitres de solution de trempe CPM dans chaque puits de deux plaques fraîches de 384 puits. Centrifuger la plaque de réaction protéique à 200 G pendant trois minutes pour granuler le TCEP-agarose. À des moments prédéterminés, utilisez une station de pipetage 384 pour transférer trois microlitres d’échantillon de chaque puits de la plaque de réaction des protéines vers la plaque de trempe CPM.

Retirer l’échantillon par le haut du puits en évitant d’aspirer du TCEP-agarose par le bas. Incuber les plaques de trempe CPM à température ambiante pendant une heure, et mesurer l’intensité de la fluorescence avec une excitation à 384 nanomètres et une émission à 470 nanomètres. Pour commencer, effectuez le tethering quantitatif irréversible ou le test qIT avec la protéine souhaitée et trempez les échantillons dans la plaque CPM.

Pour chaque trempe, calculez Z prime comme mesure de la qualité du dosage. Calculez ensuite les valeurs moyennes de fluorescence pour les puits de contrôle négatifs des colonnes un et deux et des puits de contrôle positifs des colonnes 23 et 24. Normalisez bien chaque réaction en fonction des valeurs de fluorescence moyennes des témoins positifs et négatifs, et tracez séparément le pourcentage de modifications en fonction du temps pour chaque composé réagissant avec le glutathion et avec la protéine cible.

À l’aide de GraphPad, ajustez les données normalisées en fonction du pourcentage de modifications en fonction du temps à un modèle de décroissance exponentielle monophasique pour les deux réactions à l’aide de l’équation AE à la puissance de KT C.Utilisez la vitesse à laquelle les fragments réagissent avec les protéines et le glutathion pour calculer le facteur d’augmentation de taux ou la valeur REF pour chaque fragment. Enfin, pour sélectionner des fragments d’accès, définissez un seuil REF, un taux d’accès arbitraire ou sélectionnez des fragments avec un REF supérieur de trois écarts-types à la moyenne géométrique. Le composé un a réagi avec le résidu cystéine sur la protéine cible à un taux six fois plus élevé qu’avec le glutathion, répondant au critère Hit de REF supérieur à trois.

Le composé deux n’a pas montré de vitesse de réaction accélérée avec le résidu cystéine cible par rapport au glutathion, ce qui indique un manque d’interactions non covalentes productives et n’a donc pas été sélectionné comme un succès.