Name: Criblage de fragments covalents à l’aide du test quantitatif de liaison irréversible (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-02-28T12:10:00.000+00:00
Duration: 6 min 17 s
Description: Découvrez le test qIT pour identifier des fragments covalents sélectifs ciblant des protéines anticancéreuses. Cette méthode par fluorescence contrôle la réactivité des composés sans spectrométrie de masse.

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1. Construction d’une bibliothèque de fragments
<ol>
	<li>Concevez une bibliothèque de fragments électrophiles et synthétisez-les ou achetez-les. Les banques de fragments électrophiles sont généralement constituées d’électrophiles légèrement réactifs (tels que les acrylamides, les chloroacétamides et les sulfamides de vinyle) ajoutés à un large éventail d’échafaudages chimiques. Les bibliothèques de fragments électrophiles sont largement disponibles auprès des fournisseurs commerciaux, et plus de détails sur leur conception et leur construction sont examinés ailleurs 5,11.</li>
	<li>Dissoudre chaque composé dans du DMSO à une concentration de 50 mM, puis distribuer un composé différent dans chaque puits des colonnes 3 à 22 d’une plaque de réservoir de 384 puits, appelée plaque de bibliothèque de fragments.<ol>
		<li>Distribuez du DMSO dans chaque puits des colonnes 1, 2, 23 et 24 pour les témoins positifs et négatifs. La disposition des plaques peut varier en fonction du nombre de composés criblés (Figure 2). Le volume ajouté à la plaque de bibliothèque dépendra du nombre de tamis à effectuer, compte tenu du fait qu’environ 1,8 μL de chaque puits est nécessaire par tamis qIT. Préparez cette Fragment Library Plate à l’avance et conservez-la à 4 °C.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67178/67178fig02.jpg"> 
Figure 2 : Disposition de la plaque. Vue d’ensemble de la disposition des plaques à 384 puits pour le test qIT. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67178/67178fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
2. Configuration du test (Figure 3)
<ol>
	<li>Préparez les solutions suivantes : solution protéique recombinante (protéine cible dans n’importe quel tampon), tampon de dosage qIT (150 mM de NaCl, 25 mM de Hepes (pH 8)), tampon de trempe de test qIT (150 mM de NaCl, 25 mM de Hepes (pH 7,5)) et solutions mères composées (fragment électrophile (50 mM) dans du DMSO). REMARQUE : Un pH de 8 est utilisé dans le tampon de réaction pour accélérer la réaction entre le résidu de cystéine cible et les fragments, ce qui permet de mesurer la vitesse de réaction même pour des fragments extrêmement légèrement réactifs. Un pH légèrement inférieur de 7,5 est utilisé dans le tampon d’extinction, car la liaison thioéther formée entre le maléimide du CPM et le thiol de cystéine est sujette à l’hydrolyse à des pH plus basiques (par exemple, des travaux antérieurs ont montré que les conjugués cystéine-maléimide sont beaucoup plus stables à un pH de 7,3 qu’à un pH de 8à 12).</li>
	<li>Retirer les solutions mères de fragments de DMSO de l’entrepôt et les laisser à température ambiante pendant au moins 2 h pour permettre aux stocks composés de dégeler.</li>
	<li>Dégazer le tampon de dosage qIT en le faisant bouillonner avec du gaz argon pendant environ 30 min.</li>
	<li>Remplacez soigneusement la solution protéique cible dans un tampon de dosage qIT dégazé. Il est crucial que les agents réducteurs tels que le DTT et le TCEP soient complètement éliminés à des concentrations &lt; 100 nM, car ils interfèrent avec la quantification des thiols. Cette étape peut être effectuée via une série répétitive d’échanges de tampons, comme décrit ci-dessous.<ol>
		<li>Diluer la solution protéique en excès de tampon de dosage qIT dégazé dans une unité de filtre de spin, concentrer par centrifugation (4000 x g, 4 °C, 15 min) et répéter. En règle générale, 4 cycles de dilutions de 1 sur 15 sont nécessaires pour éliminer suffisamment le DTT (1 mM) de 1 mL de solution mère de protéines recombinantes, bien que cette étape puisse être ajustée en fonction de la concentration d’agent réducteur dans la solution de protéines recombinantes d’origine. REMARQUE : Alternativement, la dialyse de la solution protéique cible contre un grand excès de tampon de test qIT dégazé peut obtenir le même résultat.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Diluer la solution protéique cible (produite à l’étape 2.1) jusqu’à une concentration protéique de 15 μM dans un tampon de dosage qIT dégazé. Environ 9 mL de solution protéique cible sont nécessaires pour remplir une plaque de 384 puits avec un volume mort suffisant.</li>
	<li>Préparez une suspension à 1,5 % (v/v) d’agarose TCEP dans un tampon de dosage qIT dégazé. Environ 9 mL de suspension de PTCE et d’agarose sont nécessaires par plaque de criblage.</li>
	<li>Distribuer 20 μL de solution de PTEP-agarose dans chaque puits de deux plaques de 384 puits.</li>
	<li>Préparez un stock de glutathion de 15 μM dans un tampon de dosage qIT dégazé. Celui-ci doit être préparé immédiatement avant le placage car le glutathion s’oxyde rapidement en solution sans agent réducteur.</li>
	<li>Distribuez 20 μL de tampon de dosage qIT dans les colonnes 1 et 2 des deux plaques à 384 puits.</li>
	<li>Distribuer 20 μL de solution de protéine 15 μM ou de glutathion (conformément à la plaque prévue) dans les colonnes 3 à 24 de la plaque à 384 puits. Celles-ci sont appelées plaque de réaction protéique et plaque de réaction du glutathion. Laisser réduire à RT pendant 1 h.</li>
	<li>Distribuez 58,2 μL de tampon d’analyse qIT dégazé dans chaque puits d’une plaque de 384 puits, puis transférez 1,8 μL de chaque puits correspondant de la plaque de bibliothèque de fragments pour créer une plaque de dilution de composé, où chaque composé est dilué à une concentration de 1,5 mM dans un tampon d’analyse qIT plus 3 % de DMSO. REMARQUE : Cette étape est facilitée par une station de pipetage de 384 personnes, qui permet de transférer des stocks composés pour chaque puits en une seule opération.</li>
	<li>Après 1 h d’incubation de protéines et de glutathion avec du TCEP-agarose, transférez 20 μL de solution composée de chaque puits de la plaque de dilution composée dans les plaques de réaction des protéines et du glutathion pour commencer l’essai. Cette étape est également facilitée par une station de pipetage de 384 personnes. Les étapes de l’analyse sont résumées à la figure 3. REMARQUE : La concentration en fragments peut être modifiée au besoin, et les tests qIT peuvent être répétés pour les résultats à des concentrations plus faibles, si nécessaire, pour confirmer que l’affinité protéique n’est pas un artefact de la concentration élevée en fragments. La concentration relativement élevée de fragments est utilisée pour élever le kpro et le kGSH afin de garantir que des taux précis sont déterminables pour les composés légèrement réactifs (qui peuvent afficher t1/2 (GSH) &gt; 24 h dans les conditions de dosage). De plus, bien qu’une concentration de fragments de 500 μM soit élevée, des concentrations de μM élevées à faibles mM ont été utilisées dans le criblage de fragments, par exemple13.</li>
	<li>Démarrez une minuterie - le test a commencé et les trempes doivent être effectuées à des moments réguliers conformément à la section ci-dessous.</li>
</ol>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67178/67178fig03v2.jpg"> 
Figure 3 : Résumé du test qIT. Un résumé illustrant les étapes clés de la configuration d’un puits de réaction de test qIT. (créé à l’aide de BioRender). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67178/67178fig03largev2.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
3. Trempe CPM
REMARQUE : Des trempes CPM sont effectuées pour quantifier la quantité de thiol n’ayant pas réagi restant dans les plaques de réaction des protéines et du glutathion. Celles-ci doivent être effectuées à des points temporels discrets (par exemple, les points temporels suivants sont généralement utilisés : 7, 15, 30, 60, 120, 240, 360, 1220 et 1440 min) pour permettre de surveiller la cinétique de réaction.
<ol>
	<li>Préparez des solutions mères de MPC (500 μM) dans du DMSO, distribuez-les dans des aliquotes de 111,2 μL dans des tubes de microcentrifugation et stockez-les à -20 °C. Ces stocks de CPM peuvent être préparés à l’avance, et 1 aliquote sera nécessaire par point de temps de trempe.</li>
	<li>Préparez une solution d’extinction de CPM (1,4 μM) en décongelant une solution mère de CPM congelée (500 μM) et en l’ajoutant à 40 mL de tampon d’extinction de test qIT.</li>
	<li>Versez 27 μL de solution de trempe CPM dans chaque puits de deux plaques de 384 puits - deux sont nécessaires pour tremper les plaques de réaction des protéines et du glutathion. Celles-ci sont appelées plaques de trempe CPM, préparez-les au maximum 30 min avant utilisation.</li>
	<li>Centrifuger la plaque de réaction protéique à 200 x g pendant 3 min pour s’assurer que l’agarose TCEP est granulée.</li>
	<li>À des moments prédéterminés, transférez 3 μL d’échantillon de chaque puits de la plaque de réaction protéique vers une plaque de trempe CPM préremplie. Cette étape est également simplifiée grâce à une station de pipetage de 384 personnes.</li>
	<li>Mélangez la plaque de trempe CPM en aspirant et en distribuant 3 x 25 μL. Il est important de retirer l’échantillon par le haut du puits pour éviter d’aspirer l’agarose TCEP par le bas, ce qui interférerait avec la trempe CPM.</li>
	<li>Répétez les étapes 3.4 à 3.6 avec la plaque de réaction au glutathion.</li>
	<li>Incuber les plaques de trempe CPM (préparées en 3.4-3.6) à température ambiante pendant 1 h.</li>
	<li>Mesurer l’intensité de fluorescence de la plaque de trempe CPM (excitation à 384 nm et émission à 470 nm).</li>
</ol>
4. Analyse des données et sélection des résultats
<ol>
	<li>Pour chaque trempe, calculez Z' comme mesure de la qualité du dosage. Toute transition du CPM avec Z' &lt; 0,5 ne doit pas être prise en compte. Z' = 1 - ((3σcontrôle positif + 3σcontrôle négatif) / (μcontrôle positif - μcontrôle négatif)) où σ = écart-type de l’intensité de fluorescence et μ = moyenne de l’intensité de fluorescence</li>
	<li>Calculer les valeurs moyennes de fluorescence pour les puits témoins négatifs et positifs (colonnes 1 et 2, et 23 et 24, respectivement).</li>
	<li>Normalisez bien chaque réaction en fonction des valeurs moyennes de fluorescence des témoins positifs et négatifs : % modifié = 100 x (fluorescence de puits composé - fluorescence de contrôle négatif) / (fluorescence de contrôle positif - fluorescence de contrôle négatif)</li>
	<li>Tracer séparément le pourcentage modifié en fonction du temps pour chaque composé réagissant avec le glutathion et avec la protéine cible.</li>
	<li>Ajustez les données normalisées en fonction du pourcentage modifié en fonction du temps à un modèle de décroissance exponentielle monophasée pour la réaction avec les protéines et avec le glutathion à l’aide de l’équation : % modifié = ae - kt + c Où a = l’intervalle des valeurs modifiées en %, k = vitesse de réaction, t = temps, c = valeur en % modifié à l’infini. L’ajustement de la courbe et la détermination des paramètres peuvent être effectués à l’aide d’un logiciel commercial (tel que Graphpad).</li>
	<li>Utilisez la vitesse à laquelle les fragments réagissent avec la protéine (kpro) et le glutathion (kGSH) pour calculer la valeur du facteur d’augmentation du taux (REF) pour chaque fragment : REF = kpro / kGSH</li>
	<li>Utilisez les valeurs REF pour sélectionner les fragments d’accès. Cela peut être fait en fixant un seuil REF (par exemple, REF &gt; 3), un taux de réussite arbitraire (par exemple, les 2 % supérieurs) ou en sélectionnant des fragments dont les écarts-types REF 3 sont supérieurs à la moyenne géométrique.</li>
</ol>

<meta charset="utf8"></head><body>Ethering quantitatif irréversible : criblage efficace des ligands électrophiles

<ol><li>Boike, L., Henning, N. J., Nomura, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+covalent+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Advances in covalent drug discovery.</a> Nat Rev Drug Discov. 21, 881-898 (2022).</li>
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<li>Flanagan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+and+computational+methods+for+the+characterization+of+covalent+reactive+groups+for+the+prospective+design+of+irreversible+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Chemical and computational methods for the characterization of covalent reactive groups for the prospective design of irreversible inhibitors.</a> J Med Chem. 57, 10072-10079 (2014).</li>
</ol>

Les ligands covalents ciblés réactifs à la cystéine (molécules qui exercent un effet biologique en réagissant avec un résidu de cystéine sélectionné sur une protéine spécifique) sont devenus de plus en plus populaires en tant qu’outils chimiques et thérapeutiques au cours des dernières décennies1. Ceux-ci consistent généralement en un électrophile légèrement réactif (tel qu’un acrylamide, un chloroacétamide ou un vinylsulfone) ajouté à un fragment ligand ayant une forte affinité pour une cible protéique2. Idéalement, l’interaction ligand-protéine se déroule via un mécanisme en deux étapes impliquant une liaison initiale du ligand non covalent, suivie de la formation d’une liaison covalente irréversible entre la cystéine cible et l’électrophile3.
Plusieurs ligands covalents ciblés précocement, y compris l’inhibiteur de la tyrosine kinase de Bruton, l’ibrutinib, ont été développés en fournissant un ligand réversible précédemment identifié avec une poignée électrophile4. Cependant, cette approche n’est pas toujours couronnée de succès, et d’autres tentatives ont montré que l’installation électrophile nécessitait une optimisation significative5. Au lieu de cela, les approches électrophiles, en particulier l’utilisation de fragments électrophiles, sont devenues plus populaires ces dernières années. Celles-ci impliquent généralement l’incubation d’une bibliothèque d’électrophiles avec une protéine, puis la sélection de composés ayant un taux de réaction accru envers une cystéine, qui est supposé être induit par des interactions non covalentes productives entre le ligand et la poche de liaison6. Notamment, ces méthodes ont été appliquées avec succès lors du développement de l’inhibiteur de KRAS (G12C) Sotorasib1.
Le criblage électrophile d’abord pose plusieurs défis uniques par rapport au criblage traditionnel de ligands non covalents, principalement en raison de la grande variabilité de la réactivité au sein et entre les classes d’ogives7. La plupart des électrophiles réactifs à la cystéine réagiront, au fil du temps, avec tous les résidus de cystéine exposés au solvant, indépendamment de toute interaction sélective pour la protéine cible. L’occupation des ligands augmentera donc avec le temps pour presque tous les électrophiles, et sans contrôle de la réactivité, la sélection des coups sera souvent biaisée vers des fragments plus réactifs qui engagent une cible plus rapidement8.
De plus, les méthodes de dépistage électrophiles utilisent souvent la spectrométrie de masse pour détecter la formation d’adduits protéine-ligand, qui est limitée dans le débit9. Un échantillonnage réactionnel régulier est nécessaire sur une longue période (de quelques heures à quelques jours) pour caractériser correctement la cinétique réactionnelle d’une bibliothèque de composés ayant une électrophilie variée10. Un criblage de 300 fragments échantillonnés à 10 points temporels nécessitera donc la réalisation de 3000 spectres de masse, dépassant le débit de la plupart des systèmes de spectrométrie de masse protéique. Des méthodes à haut débit de surveillance de la formation d’adduits protéine-ligand sont donc souhaitables.
L’approche décrite ici, le dosage du partage de connexion irréversible quantitatif (qIT), est une méthode de criblage électrophile qui contrôle la réactivité intrinsèque et utilise une simple lecture de fluorescence7. Les protéines, ou glutathion (un tripeptide non structuré contenant des thiols utilisé comme contrôle de la réactivité intrinsèque) sont incubées avec une bibliothèque de fragments électrophiles, et des échantillons réguliers sont prélevés pour être trempés dans une solution de CPM (7-Diethylamino-3-(4'-Maleimidylphenyl)-4-Methylcoumarin, un agent fluorogène de quantification des thiols). La formation d’adduits entre la cystéine et le fragment électrophile réduit la quantité de thiol disponible pour la réaction avec le CPM, réduisant ainsi la fluorescence résultante lors de l’extinction. La fluorescence CPM agit donc comme un proxy pour le thiol n’ayant pas réagi, ce qui permet de déterminer la cinétique de la réaction thiol avec chaque fragment électrophile. Les fragments électrophiles présentant une réactivité protéique significativement améliorée par rapport au glutathion sont sélectionnés comme résultats positifs et prioritaires pour un développement ultérieur (Figure 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67178/67178fig01.jpg"> 
Figure 1 : Schéma de qIT. Un aperçu schématique du test qIT. (créé à l’aide de BioRender). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67178/67178fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
La sélection des occurrences à l’aide des valeurs REF contrôle la réactivité intrinsèque et garantit que les fragments ne sont sélectionnés comme occurrences que s’ils forment des interactions productives non covalentes avec une cible protéique. La simple lecture de fluorescence signifie également que le test qIT est hautement évolutif et ne nécessite pas de méthodes de surveillance de réaction basées sur la spectrométrie de masse.
Ici, une procédure complète pour le test qIT est décrite, avec des exemples de résultats inclus pour illustrer les performances du test et la sélection des résultats.

<table><tbody><tr><td>Gaz argon</td><td>BOC</td><td>I1149</td><td></td></tr><tr><td>Corning 384 puits, à bride basse, à fond plat Plaques</td><td>d’essai Corning</td><td>3575</td><td></td></tr><tr><td>CPM</td><td>Invitrogen</td><td>D346</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>TCEP-agarose</td><td>immobilisé Pierce</td><td>77712</td><td></td></tr><tr><td>Lecteur de microplaques</td><td>CLARIOstar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Scellement de plaque PCR</td><td>BioRad</td><td>MSA5001</td><td></td></tr><tr><td>L-glutathion réduit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G4251</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de sodium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Hepes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>RES6007H-A7</td><td></td></tr></tbody></table>

criblage de fragments covalents à l’aide du test quantitatif de liaison irréversible

Covalent Fragment Screening Using the Quantitative Irreversible Tethering Assay

Le test qIT est utilisé ici pour identifier les occurrences de fragments covalents pour une protéine cystéine unique sans nom. MgCl2 (10 mM) a été ajouté aux tampons de réaction, car la protéine cible est connue pour se lier aux ions Mg2+ . Le criblage a été effectué en trois exemplaires, et la vitesse à laquelle chaque fragment a réagi avec la protéine cible (kpro) et le glutathion (kGSH) a été déterminée. Les valeurs de Z étaient supérieures à 0,5 pour toutes les plaques de trempe et étaient en moyenne de 0,75 pour les trempes protéiques et de 0,79 pour les trempes au glutathion, ce qui indique une excellente performance de dosage. Les valeurs REF ont ensuite été calculées pour chaque fragment, et les résultats ont été sélectionnés où REF &gt; 3.
Les résultats représentatifs (Figure 4) fournissent un exemple de sélection de hit à l’aide du test qIT. Le composé 1 a réagi à un taux 6,0 fois plus élevé avec le résidu cystéine sur la protéine cible qu’avec le glutathion et, en utilisant un critère de REF &gt; 3, a été sélectionné comme résultat positif (figure 4B). Cette accélération de vitesse indique la présence d’un effet de modèle, par lequel les interactions non covalentes positionnent 1 dans l’orientation correcte de la cystéine sur la protéine cible pour réagir avec l’ogive du chloroacétamide. En revanche, 2 est un exemple de fragment non touché car la réaction entre 2 et le résidu cystéine cible n’est pas accélérée par rapport à la réaction entre 2 et le glutathion. L’absence d’accélération de la vitesse indique qu’il n’y a pas d’interactions non covalentes productives, positionnant 2 dans la bonne orientation pour réagir avec le résidu cystéine cible.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67178/67178fig04v2.jpg"> 
Figure 4 : Résultats représentatifs. Les résultats montrent une surveillance des réactions des protéines et du glutathion par qIT pour (A) une réactivité intrinsèque élevée, un fragment de hit possiblement faussement positif et (B) un fragment de hit. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67178/67178fig04largev2.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>

Criblage de fragments covalents à l’aide du test quantitatif de liaison irréversible

Compounds that form covalent bonds with specific target proteins offer a variety of advantages&#160;as chemical probes and therapeutic agents. Most ...

covalent-fragment-screening-using-quantitative-irreversible-tethering

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JoVE Journal

Biochemistry

Biochimie

L'interaction entre les canaux HCN et leur sous-unité auxiliaire a été identifié comme une cible thérapeutique dans le trouble dépressif majeur. Ici, une méthode basée sur la polarisation de fluorescence pour identifier les petites molécules inhibitrices de cette interaction protéine-protéine, est présentée.

Procédé pour l&#39;identification d&#39;inhibiteurs de petites molécules de l&#39;interaction protéine-protéine entre HCN1 et TRIP8b

Dans cet article, un protocole détaillé pour quantifier la longueur des télomères en utilisant une analyse de fragment de restriction terminale modifiée est discuté qui fournit une mesure directe rapide et efficace de la longueur des télomères. Cette technique peut être appliquée à une variété de sources cellulaires d'ADN pour quantifier la longueur des télomères.

Analyse modifiée des fragments de restriction des terminaux pour quantifier la longueur de télomère à l&#39;aide de l&#39;hybridation en gel

Ce protocole décrit l’immobilisation covalente de protéines avec un hétérobifonctionnel agent de couplage silane aux surfaces d’oxyde de silicium conçu pour la spectroscopie de force force atomique microscopie basée seule molécule qui est illustrée par la interaction de RrgA (adhésine pilus-1 pointe de S. pneumoniae) avec la fibronectine.

Immobilisation covalente de protéines pour la spectroscopie de Force seule molécule

Une méthode très parallèle pour mesurer le clivage spécifique au site de l’ADN au niveau de la molécule unique est décrite. Ce protocole démontre la technique utilisant la restriction endonuclease NdeI. La méthode peut facilement être modifiée pour étudier n’importe quel processus qui aboutit à un clivage d’ADN spécifique au site.

Essai cinétique à molécule unique à haut débit parallèle pour le clivage d’ADN spécifique au site

À l’aide de l’ADN marqué par des points quantiques et de la microscopie à fluorescence à réflexion interne totale, nous pouvons étudier le mécanisme de réaction des endonucléases de restriction tout en utilisant des protéines non marquées. Cette technique à molécule unique permet d’observer massivement multiplexée les interactions protéine-ADN individuelles, et les données peuvent être regroupées pour générer des distributions de temps de séjour bien remplies.

Analyse du temps de séjour d’une molécule unique du clivage de l’ADN médié par l’endonucléase de restriction

Le criblage de fragments cristallographiques au Helmholtz-Zentrum Berlin est effectué à l’aide d’un flux de travail avec des bibliothèques de composés dédiées, des outils de traitement des cristaux, des installations de collecte de données rapides et une analyse de données largement automatisée. Le protocole présenté vise à maximiser le résultat de telles expériences pour fournir des points de départ prometteurs pour la conception de ligands basés sur la structure en aval.

Flux de travail et outils pour le criblage de fragments cristallographiques au Helmholtz-Zentrum Berlin

Le criblage par fragments par RMN est une méthode robuste pour identifier rapidement les liants de petites molécules aux biomacromolécules (ADN, ARN ou protéines). Des protocoles décrivant la préparation des échantillons basée sur l’automatisation, les expériences RMN et les conditions d’acquisition, ainsi que les flux de travail d’analyse sont présentés. La technique permet une exploitation optimale des noyaux actifs RMN 1H et 19F pour la détection.

Criblage de fragments basé sur la RMN dans un échantillon minimum mais un mode d’automatisation maximal

Cet article décrit le processus complet de XChem pour le criblage de fragments à base de cristaux, à partir de la demande d’accès et de toutes les étapes ultérieures jusqu’à la diffusion des données.

Réalisation d’un criblage efficace des fragments dans l’installation de XChem à Diamond Light Source

La surveillance des changements dans la température de fusion d’une protéine cible(c.-à-d.essai de décalage thermique, TSA) est une méthode efficace pour filtrer les bibliothèques de fragments de quelques centaines de composés. Nous présentons un protocole TSA mettant en œuvre la fluorimétrie à balayage nano-différentiel assistée par robotique (nano-DSF) pour surveiller la fluorescence intrinsèque du tryptophane et la rétrodiffusion de la lumière pour le criblage des fragments.

Fluorimétrie à balayage nano-différentiel pour le criblage dans la découverte de plomb à base de fragments

Ici, nous décrivons une méthode de co-expression bactérienne de protéines marquées différentiellement à l’aide d’un ensemble de vecteurs compatibles, suivie des techniques conventionnelles de pulldown pour étudier les complexes protéiques qui ne peuvent pas s’assembler in vitro.

Essai de pulldown couplé à une co-expression dans les cellules bactériennes en tant qu’outil rapide pour tester des interactions protéine-protéine difficiles

Nous décrivons ici des protocoles pour la caractérisation biophysique de la formation de complexes ternaires induite par protéolyse ciblant les chimères (PROTACS) qui impliquent les ubiquitine ligases Von Hippel-Lindau, E3 ligase (VHL) et Cereblon (CRBN).  Les méthodes biophysiques illustrées ici comprennent la résonance plasmonique de surface (SPR), l’interférométrie de biocouche (BLI) et la calorimétrie de titrage isotherme (ITC).

le développement et l’application de tests biophysiques pour l’évaluation de la formation de complexes ternaires induite par la protéolyse ciblant les chimères (PROTACS)

Découvrez le test qIT pour identifier des fragments covalents sélectifs ciblant des protéines anticancéreuses. Cette méthode par fluorescence contrôle la réactivité des composés sans spectrométrie de masse.

Criblage de fragments covalents à l’aide du test quantitatif de liaison irréversible

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