Quantification de la respiration mitochondriale dans des cellules entières de levure

La respiration mitochondriale est un générateur principal d’énergie cellulaire dans la plupart des circonstances, et un indicateur important du métabolisme cellulaire et de la forme physique. Ainsi, les fonctions mitochondriales délimitent l’état cellulaire bioénergétique. Ce protocole décrit une technique de quantification de la respiration mitochondriale dans les cellules vivantes G en tant que paramètre bioénergétique.

La technique décrite dans ce protocole nous aide à définir le mécanisme bioénergétique de certains polyphénols, comme le resvératrol et le coircitène. Il sert également d’outil pour mesurer le métabolisme des pentoses, également des PTSPT et explique le changement bioénergétique derrière l’arbre à cabine et les effets du travail au sol. Nous nous intéressons à déchiffrer comment les cellules acquièrent certains phénotypes, comme les effets d’arbre à cabine et de travail au sol, avec des changements significatifs dans la bioénergétique cellulaire.

La respiration mitochondriale est un outil essentiel pour élucider les mécanismes moléculaires à l’origine de ce phénomène métabolique. Pour commencer, inoculez un tube à essai en verre de 10 millilitres contenant trois millilitres de milieu YPD avec 250 microlitres de cellules de levure préservées au glycérol. Incuber l’éprouvette pendant la nuit à 30 degrés Celsius avec une agitation constante à 200 tours par minute.

Ensuite, à l’aide d’une boucle stérile, striez une plaque de tarière YPD avec les cellules de levure cultivées dans le tube à essai en verre de 10 millilitres. Incuber la boîte de Pétri à 30 degrés Celsius jusqu’à ce que des colonies isolées apparaissent. Pour préparer un pré-inoculum, inoculez trois millilitres de milieu YPD à 2 % de glucose avec deux ou trois colonies de levures isolées et incuberez.

Obtenez ensuite 100 millilitres de milieu synthétique complet stérile dans un erlenmeyer de 500 millilitres. Inoculer le milieu avec la culture de levure pré-inoculum de nuit à une densité optique initiale de 0,1 à 600 nanomètres. Ajoutez le défi chimique tel que 100 micromolaires de resvératrol pour tester la respiration mitochondriale.

Ensuite, versez les cellules de la phase mi-logarithmique dans un tube conique vide de 15 millilitres pré-pesé, et centrifugez les cellules à 4 000 G pendant cinq minutes. Après avoir jeté le surnageant, lavez la pastille trois fois avec 25 millilitres d’eau déminéralisée. Pesez le tube conique contenant la pastille lavée pour obtenir le poids humide en soustrayant le poids du tube vide.

Ensuite, remettez en suspension la pastille lavée dans deux millilitres d’eau déminéralisée. Pour commencer, obtenez les cellules de levure traitées avec des médicaments appropriés, tels que le resvératrol. Placez cinq millilitres de tampon MES-TEA de 10 millimolaires et 50 milligrammes de cellules humides dans la chambre de greffe polaire.

Positionnez doucement l’électrode à oxygène de type Clark, en vous assurant qu’aucune bulle ne se forme. Mettez sous tension le moniteur YSI 5300A et l’ordinateur d’acquisition de données. Sélectionnez la molette de réglage du canal un sur l’air et ajustez le canal un à 100 % avec le cadran d’étalonnage du canal un.

Commencez à enregistrer les données et commencez à mesurer le temps à l’aide d’un chronomètre. À l’aide d’une seringuse de chromatographie, ajoutez le substrat oxydable à une concentration finale de 10 millimolaires et maintenez la chambre fermée avec une agitation constante. Ensuite, à l’aide d’une seringue de chromatographie, ajoutez de l’oligomycine pour obtenir une concentration finale de 0,01 millimolaire dans la chambre de l’oxymètre et enregistrez le pourcentage de consommation d’air.

De même, ajoutez CCCP à une concentration finale de 0,015 millimolaire dans la chambre de l’oxymètre pour déterminer la capacité respiratoire maximale. Ensuite, ajoutez des inhibiteurs de la chaîne de transport d’électrons, la triflurositone dentaire et huileuse, ou TTFA, à un millimolaire, suivi de l’antimycine A à un milligramme par millilitre. Lavez la chambre trois fois chacune avec de l’éthanol à 70 %, puis de l’eau déminéralisée, avant de passer à la source de carbone suivante.

Pour commencer, effectuez un test de consommation d’oxygène avec des cellules de levure, en utilisant diverses sources de carbone et des contrôles. Créez un nouveau fichier de projet dans le logiciel statistique et choisissez XY dans la section de création. Sélectionnez ensuite entrer ou importer des données dans une nouvelle table dans la section de la table de données.

Dans la section des options, sélectionnez les numéros dans la sous-section X et dans la sous-section Y. Cliquez sur entrer trois valeurs répliquées dans des sous-colonnes côte à côte. Entrez les données de temps dans les colonnes X et entrez les données de pourcentage d’air dans les colonnes Y.

Pour effectuer une analyse de régression linéaire, cliquez sur analyser dans la barre de menus et, sous analyse, sélectionnez Régression linéaire simple sur l’analyse XY, puis cliquez sur OK. Obtenez la valeur de pente à partir de la section des résultats dans les tables de données. Copiez les valeurs de pente calculées dans une feuille de données.

Soustraire la valeur de pente obtenue à partir du mélange d’inhibiteurs respiratoires de celles du substrat oxydable, de l’oligomycine et du CCCP pour éliminer les autres sources de consommation d’oxygène. Maintenant, multipliez les valeurs de pente par 237 micromolaires d’oxygène, ce qui représente la solubilité de l’oxygène dans cette condition et le tampon. Convertissez les valeurs en micromolaires d’oxygène par minute, en ajustant en fonction du temps par graphique.

Divisez les résultats par 50, ce qui représente les milligrammes de cellules utilisées dans l’expérience. Enfin, la consommation d’oxygène est exprimée en micromolaires d’oxygène par milligramme de cellules par minute. Les cellules cultivées avec 0,5 % de glucose ont montré une consommation d’oxygène significativement plus élevée dans la respiration basale, la respiration liée à l’ATP et la capacité respiratoire maximale, par rapport à celles cultivées dans 5 % de glucose.

La quercétine a considérablement réduit la respiration mitochondriale dans les cellules cultivées avec 0,5 % de glucose, affectant la respiration basale, liée à l’ATP et maximale. D’autre part, la quercétine n’a pas, de manière significative, affecté la respiration mitochondriale dans les cellules, cultivées à 5 % de glucose.