Technique optimisée et simplifiée pour la production et la culture de tranches de foie coupées avec précision

Les protocoles de production et de culture de tranches de foie coupées avec précision, ou PCLS, peuvent varier considérablement. Le principal inconvénient des PCLS est leur courte demi-vie, mais ici, nous démontrons que la production et la culture des PCLS peuvent être réalisées dans des conditions de laboratoire standard avec un accès au Vibratome tout en assurant une demi-vie d’au moins quatre jours. PCLS, un modèle attrayant qui comble les lacunes entre les modèles in vitro et in vivo, mais ils sont souvent négligés en raison de leur demi-vie relativement courte. Cependant, ils contiennent tous les types de cellules et une architecture préservée, essentielle à la sommation métabolique, et ressemblent donc à un mini-modèle de l’organe entier, permettant l’étude et le traitement de tissus vivants tout en reproduisant leurs phénotypes complexes. Les tranches continues sont un processus très simple mais techniquement difficile. Pour faciliter cela, notre protocole se concentre sur des étapes clés, telles que l’orientation de la bouture, et l’enrobage du tissu, mais aussi la pertinence d’un mini modèle de volume pour la culture et d’un système dynamique pour augmenter leur demi-vie.

[Narrateur] Avant la récolte, préparez un litre de tampon Krebs-Henseleit, un plateau Vibratome désinfecté et refroidi, des lames Vibratome autoclavées et 4 % d’agarose à faible point de fusion. Le jour de la récolte, conservez l’agarose fondue dans un bain-marie à 37 degrés Celsius jusqu’à utilisation. Ensuite, préparez les plaques de culture en ajoutant 2,6, 1,5 et 0,7 millilitres de milieu complet par puits dans des plaques à six, 12 et 24 puits respectivement. Insérez des inserts poreux de huit micromètres dans chaque puits. Placez les plaques dans un incubateur humidifié réglé à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone et 21 % d’oxygène. Stériliser tous les instruments nécessaires à la récolte en utilisant des méthodes de stérilisation appropriées. Vaporisez l’abdomen de la souris euthanasiée avec de l’éthanol à 70 % pour désinfecter la zone. À l’aide d’une pince et de ciseaux stériles, coupez la peau et le péritoine à partir du milieu de l’abdomen pour ouvrir la cavité abdominale. Disséquez doucement le foie des organes ou des vaisseaux environnants tout en évitant d’endommager les lobes. Ensuite, conservez immédiatement le foie entier dans un tampon Krebs glacé. À l’aide d’une pince émoussée et d’un couteau ou de ciseaux tranchants et stériles, séparez chaque lobe individuellement pour éviter d’endommager les lobes lors de la séparation. À l’aide d’un couteau tranchant et stérile, coupez tous les bords du lobe choisi pour créer des bords droits et maniables pour l’enrobage. Ensuite, versez l’agarose à 4 % à faible point de fusion dans une boîte de Pétri de trois centimètres placée sur de la glace humide pour refroidir uniformément et empêcher le lobe de couler. Laissez l’agarose refroidir pendant encore 30 secondes et placez le lobe coupé au centre de l’agarose, en lui permettant de se déposer au milieu du bloc. Ensuite, coupez les bords extérieurs du bloc d’agarose et délogez le bloc d’agarose du plat. Assurez-vous que la face supérieure et la face collée à la plate-forme du Vibratome sont parallèles au bord supérieur du lobe. Commencez par régler le Vibratome pour couper à une épaisseur de 250 micromètres avec une vitesse de cinq et une fréquence de sept hertz. Après avoir stérilisé le Vibratome et placé le plateau sur le Vibratome, entourez-le de glace pour garder l’environnement froid. Réglez les lames à un angle de 10 degrés vers le bas par rapport au plan horizontal. Ensuite, remplissez le réservoir du Vibratome avec un tampon Krebs glacé. Appliquez une fine couche de colle cyanoacrylate sur la plate-forme pour la préparer au montage du bloc d’agarose. Ensuite, séchez le bord du bloc d’agarose qui sera collé sur la plate-forme à l’aide d’un tissu absorbant stérile. Maintenant, placez le bloc d’agarose sur la plate-forme amovible du Vibratome. Positionnez le lobe du foie à la verticale pour permettre des coupes transversales, ce qui réduit la pression sur le lobe et facilite une coupe plus douce. Attendez une minute que la colle prenne et immergez la plate-forme dans le réservoir Vibratome, en vous assurant que le bloc d’agarose est complètement recouvert de tampon Krebs. Pour programmer le Vibratome pour la coupe, réglez les positions de démarrage et d’arrêt. Ensuite, commencez à couper les tranches jusqu’à ce que le lobe du foie soit atteint. Utilisez une spatule pour recueillir les tranches de foie, car cela évite de les endommager, contrairement aux pinces ou aux brosses. Récupérez les tranches dans un tampon Krebs glacé jusqu’à ce qu’elles soient prêtes pour la culture. À l’aide d’une spatule, transférez les tranches de foie dans les puits préparés contenant les milieux et les inserts. Ensuite, placez les plaques sur un agitateur orbital réglé à 130 tr/min et incubez-les dans un incubateur de culture cellulaire conventionnel à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone et 21 % d’oxygène.