Name: Technique optimisée et simplifiée pour la production et la culture de tranches de foie coupées avec précision (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-22T14:10:00.000+00:00
Duration: 6 min
Description: Apprenez à produire et cultiver des tranches de foie coupées avec précision chez la souris. Cette méthode simple prolonge leur demi-vie à quatre jours minimum pour étudier le métabolisme hépatique.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<meta charset="utf8"></head><body>Protocole normalisé pour la culture de tranches de foie dans des laboratoires de base

<table><tbody><tr><td>Boîte de Pétri de 3 cm</td><td>Tout</td><td></td><td>convient à la culture cellulaire</td></tr><tr><td>Plaque de culture 6, 12, 24 puits</td><td>Tout</td><td></td><td>convient à la culture cellulaire</td></tr><tr><td>Super colle cyanoacrylate</td><td>Tout</td><td></td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Gibco</td><td>A24940</td><td></td></tr><tr><td>Éosine</td><td>Merck</td><td>HT110316</td><td></td></tr><tr><td>Éthanol</td><td>N’importe quel</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin</td><td>ThermoFisher</td><td>26400044</td><td></td></tr><tr><td>Gentamycin&nbsp ;</td><td>Gibco</td><td>15750060</td><td></td></tr><tr><td>Hématoxyline</td><td>Merck</td><td>51275</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>H0887</td><td></td></tr><tr><td>inserts 8um, pour plaques 12 puits</td><td>Strastedt</td><td>83.3931.800</td><td></td></tr><tr><td>inserts 8um, pour plaques 24 puits</td><td>Strastedt</td><td>83.3932.800</td><td></td></tr><tr><td>inserts 8um, pour plaques 6 puits</td><td>Strastedt</td><td>83.3930.800</td><td></td></tr><tr><td>KREBS</td><td>Merck</td><td>K3753</td><td></td></tr><tr><td>Hotte</td><td></td><td></td> à flux laminaire <td>Filtration de l’air Hepa Agarose</td></tr><tr><td>à faible point de fusion&nbsp ;</td><td>ThermoFisher</td><td>16520050</td><td></td></tr><tr><td>réactif de tétrazolium MTS’sp ;</td><td>Lecteur</td> de plaques multipuits <td>Abcam ab197010</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp ;</td><td>N’importe quel</td><td></td><td></td></tr><tr><td>comprimé PBS</td><td>ThermoFisher</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline/Streptomycine</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Lame de scalpel</td><td>N’importe quel</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pince chirurgicale</td><td>N’importe laquelle</td><td></td><td>avec une pointe carrée plate.</td></tr><tr><td>Ciseaux chirurgicaux</td><td>Tout</td> Vibratome Leica <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>VT1000 S</td><td></td></tr><tr><td>William' s Medium E avec GlutaMAX (WME)</td><td>ThermoFisher</td><td>W4125</td><td></td></tr></tbody></table>

technique optimisée et simplifiée pour la production et la culture de tranches de foie coupées avec précision

Optimized and Simplified Technique for the Production and Culture of Precision-Cut Liver Slices

Lors de la récolte, la perfusion de l’animal est délibérément omise pour assurer un traitement rapide de l’organe et éviter les lésions organiques. Le foie est extrait rapidement après l’incision et immédiatement placé dans un tampon protecteur d’organe glacé, par exemple le tampon Krebs24,29. Bien que le tranchage de tissu hépatique frais sans enrobage aitété décrit précédemment1, l’enrobage du foie dans de l’agarose à faible point de fusion30 (Figure 1) combiné à un tampon protecteur d’organe permettra des conditions de coupe optimales sur le vibratome, réduisant les lésions tissulaires et augmentant la reproductibilité de l’épaisseur de la section. L’épaisseur des tissus est essentielle car les sections minces permettent à davantage de couches cellulaires d’accéder aux nutriments et à l’oxygène31 et de réduire la mort cellulaire. Cependant, les sections trop fines deviennent difficiles à couper de manière homogène. À l’inverse, les tranches de plus de 400 μm d’épaisseur présenteront un taux de pénétration des nutriments plus faible. Les sections ont été incubées dans une interface liquide-air à l’aide d’un insert (figure 1) et incubées avec 5 % de CO2 et 21 % d’O2 à 37 °C sur un agitateur. Les sections doivent être incubées dans un milieu de culture dans les 3 heures suivant la récolte, après quoi la mort cellulaire se produit rapidement32.
Pour déterminer la viabilité du PCLS, la viabilité cellulaire a été évaluée par un test de 4,5-diméthylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxyméthoxyphényl)-2-(4-sulfophényl)-2H-tétrazolium (MTS), qui nécessite des déshydrogénases NAD(P)H-dépendantes, c’est-à-dire des cellules métaboliquement actives, pour réduire le MTS. Les valeurs MTS ont été normalisées en fonction du poids de la tranche respective. Pour optimiser la viabilité du PCLS, un volume minimal de milieu de culture était essentiel pour maintenir la viabilité après 24 h d’incubation. Un volume de 0,7 mL dans les plaques de 24 puits a montré une réduction significative de la viabilité par dosage par SMT (p = 0,02) comparativement à 1,5 mL dans les plaques de 12 puits et à 2,6 mL dans les plaques de 6 puits (figure 2A). Ces volumes ont été choisis pour permettre de couvrir légèrement les sections, mais ils peuvent nécessiter des ajustements en fonction du type d’inserts et de plaques utilisés. Comme d’autresplaques 33, 12 puits sont utilisées comme le meilleur compromis pour une survie optimale dans un plus petit volume de milieu de culture.
L’agitation est essentielle et augmente la viabilité du PCLS de 50 % 24 h après l’incubation par rapport à une culture statique (figure 2B). L’agitation crée une interface air-liquide critique, optimisée grâce à l’utilisation de puits de transbordement, permettant l’accès aux nutriments et à l’oxygène sur les deux faces de la section. L’absorption d’oxygène et de nutriments est également augmentée par le flux constant créé par le mouvement de secousse, qui passe également à travers la membrane du transwell.
Le test MTS a été évalué de 1 h d’incubation jusqu’au jour 6 de l’incubation. La viabilité cellulaire est demeurée constante du jour 0 au jour 4 après l’incubation avant d’observer une diminution significative (p = 0,05) au jour 6 (figure 2C). La morphologie du PCLS évaluée par coloration à l’hématoxyline et à l’éosine (H&amp;E) n’a montré aucun changement des voies biliaires et de l’architecture jusqu’à 5 jours après l’incubation (figure 3A-D). Par rapport au jour 0 (Figure 3A), la PCLS n’a montré aucune différence histologique au jour 1 (Figure 3B) et au jour 2 (Figure 3C) après l’incubation, avec une hyperchromasie nucléaire, un infiltrat inflammatoire léger, une vacuolisation en faveur d’un processus de mort cellulaire modéré au jour 5 après l’incubation (Figure 3D). L’ensemble de ce protocole de culture PCLS permet une viabilité d’au moins 4 jours, ce qui correspond à des études utilisant des coupes dans des conditions similaires31.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67202/67202fig01.jpg"> 
Figure 1 : Schéma résumant le protocole de génération de PCLS. Ce chiffre a été modifié par rapport à34. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67202/67202fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67202/67202fig02.jpg"> 
Figure 2 : Le protocole optimisé de la culture PCLS montre une viabilité satisfaisante pendant 5 jours. (A) Effet de la taille du puits sur la prolifération cellulaire (n=3). (B) Effet de l’agitation sur la prolifération cellulaire (n = 6 par condition). (C) Test de prolifération cellulaire MTS à partir de coupes de foie de j0 à j6 jours d’incubation (n = 5 par point temporel). OD unité arbitraire, normalisée pour trancher le poids frais. Le graphique montre la moyenne ± écart-type. Test t de Student non apparié à 2 queues, ns = non significatif, *p&lt;0,05, **p&lt;0,01. Ce chiffre a été modifié par rapport à34. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67202/67202fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67202/67202fig03.jpg"> 
Figure 3 : Résultats histologiques. (A-D) Images représentatives de l’histologie du PCLS hépatique après coloration H&amp;E. Barre d’échelle = 100 μM. Ce chiffre a été modifié par rapport à34. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67202/67202fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>

Technique optimisée et simplifiée pour la production et la culture de tranches de foie coupées avec précision

This protocol presents a simple system for the creation and culture of Precision-cut Liver Slices (PCLS). PCLS contains all cells in an intact environment ...

optimized-simplified-technique-for-production-culture-precision-cut

Research

Recherche

JoVE Journal

Biology

Biologie

Les cultures d’explants de tissus primaires organotypiques, qui comprennent des tranches découpées avec précision, représentent l’architecture tissulaire tridimensionnelle (3D) ainsi que les interactions multicellulaires des tissus natifs. Cette vidéo décrit la culture de tranches de tissus murins dérivés d’une tumeur pulmonaire à l’aide d’une unité d’incubation rotative, un système qui permet une exposition intermittente des tissus à l’oxygène et aux nutriments. Le protocole décrit la...

Culture d’explants de tissus de tumeurs pulmonaires : une procédure pour générer et cultiver des tranches de tumeurs pulmonaires coupées avec précision

Dans cette vidéo, nous décrivons une procédure permettant de gonfler des poumons humains isolés avec de l’agarose et de préparer des tranches de poumons humains découpées avec précision. Les coupes pulmonaires ex vivo préparées peuvent être utilisées pour d’autres expériences immunologiques.

Préparation à base d’agarose de tranches de poumon humain coupées avec précision

Une technique permettant d’isoler des hépatocytes humains et des cellules hépatiques non parenchymateuses du même donneur est décrite. Les différents types de cellules hépatiques constituent la base des modèles hépatiques fonctionnels et de l’ingénierie tissulaire. Cette nouvelle méthode vise à isoler les cellules hépatiques avec un rendement et une viabilité élevés.

Protocole pour l&#39;isolement des hépatocytes humains primaires et correspondant Principales populations de cellules hépatiques non parenchymateuses

lésions hépatiques sont accompagnés par l'expansion des cellules progénitrices qui représente une population hétérogène de cellules. classification Novel de ce compartiment cellulaire permet la distinction de plusieurs sous-ensembles. La méthode décrite ici illustre l'analyse par cytométrie de flux et d'isolement de haute pureté de divers sous-ensembles qui peuvent être utilisés pour d'autres analyses.

Isolement et enrichissement du foie progénitrices sous-ensembles identifiés par une combinaison de marqueurs de surface Novel

Ce protocole fournit une méthode simple et fiable pour la production de tranches de foie de précision viables de souris. Les échantillons de tissu ex vivo peuvent être maintenus dans des conditions de culture tissulaire de laboratoire pendant plusieurs jours, fournissant un modèle flexible pour examiner la pathobiologie de foie.

Murine Precision-Cut Liver Slices comme un modèle Ex Vivo de biologie du foie

Présenté ici est un protocole pour préserver la contractilité vasculaire du tissu pulmonaire murin PCLS, résultant en une image tridimensionnelle sophistiquée du système vasculaire pulmonaire et des voies respiratoires, qui peut être préservée jusqu’à 10 jours et qui est sensible à de nombreuses procédures.

Les tranches pulmonaires coupées avec précision comme outil efficace pour les études ex vivo sur la structure et la contractilité des vaisseaux pulmonaires

Ce protocole présente une technique optimisée de perfusion hépatique de collagénase en deux étapes dans un modèle de rat et montre l’utilisation d’hépatocytes isolés pour la culture in vitro à long terme d’organoïdes 3D.

Perfusion hépatique de rat et isolement des hépatocytes primaires : une procédure ancienne cruciale pour la culture d’organoïdes 3D de pointe

Cette vidéo montre le protocole d'un essai angiogenèse in vitro que les stades récapitule plusieurs de l'angiogenèse. Time-lapse images de la germination, la formation de lumière, la ramification et anastomose - caractéristiques essentielles de l'angiogenèse - sont présentés.

Optimisé fibrine billes de gel d&#39;analyse pour l&#39;étude de l&#39;angiogenèse

Ce protocole décrit la production de KLRG1 tétramère, qui est un outil puissant pour l'analyse des KLRG1 ligands.

Un protocole pour la production de KLRG1 tétramère

Whole technique de culture d'embryons de souris nous permet de culture et d'embryons de...

La méthode de culture des embryons rongeurs entier en utilisant le système des rotateurs de type flacon de culture

Apprenez à produire et cultiver des tranches de foie coupées avec précision chez la souris. Cette méthode simple prolonge leur demi-vie à quatre jours minimum pour étudier le métabolisme hépatique.

Technique optimisée et simplifiée pour la production et la culture de tranches de foie coupées avec précision

Explorer plus de vidéos