Caractérisation du transfert d’électrons extracellulaire médié dans les bactéries lactiques à l’aide d’un système bioélectrochimique à trois électrodes et deux chambres

Dans notre laboratoire, nous étudions le transfert d’électrons extracellulaires, ou EET, chez des bactéries comme le lactiplantibacillus plantarum, qui est une bactérie fermentative essentielle dans les industries alimentaires. Dans l’EET, la cellule transfère des électrons à un sceptre électronique extracellulaire, comme une électrode dans un système chimique bioélectrique. Nous voulons comprendre et concevoir l’EET pour des applications dans la biodétection, la biocatalyse et la fermentation des aliments.

Nous avons découvert que le tunnel alpin peut acheter du courant par EET en présence de quinone telle que DHNA. Ce processus régénère le NAD plus, accélère la perte globale des voies de fermentation primaires et stimule la croissance cellulaire. De plus, nous constatons que divers dérivés de quinone, autres que la DHNA, peuvent également médier l’EET dans L plantarum.

L’étude de l’EET médiée par l’EET nécessite des configurations biochimiques spécialisées. Plus précisément, nous utilisons un système bioélectrochimique à trois électrodes et deux chambres pour éviter la diaphonie entre les réactions anodiques et cathodiques. Nous utilisons également une électrode de travail à champ de carbone qui a une grande surface pour améliorer le transfert d’électrons à partir de médiateurs d’électrons.

Nos travaux explorant les voies EET chez L plantarum et la façon dont ces voies interagissent avec le métabolisme fermentatif pourraient avoir des applications utiles dans les industries alimentaires. Nous savons que l’EET et le L plantarum modifient le flux métabolique par la fermentation, et que cela pourrait être manipulé pour des applications utiles et pour modifier les saveurs des aliments et produire des produits chimiques précieux dans l’électro-fermentation. À l’avenir, nous continuerons d’accroître nos connaissances fondamentales sur l’EET et de poursuivre de nouvelles applications de l’EET dans des organismes comme L plantarum.

Nous prévoyons de concevoir des protéines dans la voie EET, ce qui nous permettra de contrôler davantage l’EET pour des applications en électrofermentation et en biodétection. Pour commencer, poncez des fils de titane prédécoupés d’un millimètre de diamètre pour le travail dans les contre-électrodes, avec du papier de verre en oxyde d’aluminium jusqu’à ce qu’ils soient uniformément brillants. À l’aide d’une pince, pliez une extrémité de chaque fil d’électrode en un petit crochet.

Faites glisser un rond en feutre de carbone de 16 centimètres carrés sur chaque fil d’électrode fonctionnel, en tissant le fil dans et hors du rond en feutre de carbone une fois et en tirant le rond le long du fil jusqu’à ce qu’il soit fixé sur le crochet. Fixez les électrodes de contact de travail dans les capuchons GL 45 en perçant le septum en caoutchouc avec le fil et en le tirant sur quelques centimètres. Pour construire des réacteurs appariés, assemblez le joint torique et placez une membrane échangeuse de cations prédécoupée, pré-trempée dans de l’eau dans le joint torique assemblé.

Placez le joint torique avec la membrane entre les grandes ouvertures inférieures de deux bouteilles de réacteur appariées. Fixez les bouteilles de paire de réacteurs et un anneau avec la membrane à l’aide d’une pince d’articulation. Déposez une barre d’agitation magnétique dans chaque chambre anodique avant de fermer toutes les petites ouvertures en haut de chaque bouteille avec des bouchons GL14, équipés de septa en caoutchouc.

Remplissez chaque bouteille du réacteur avec 110 millilitres d’eau déminéralisée. Insérez les capuchons équipés d’une électrode de travail ronde en feutre de carbone et appuyez doucement sur le haut du rond en feutre pour le maintenir fixé sur le crochet. Fermez les flacons avec le bouchon GL45 approprié et équipé d’électrodes.

Réacteurs remplis d’eau d’autoclave et capuchons d’électrodes GL14. Dans des conditions stériles, grattez la culture lactoplant d’abasilisk plantarum du haut d’un stock de glycérol et inculquez dans trois millilitres de rugosa sharp à la demande commerciale, ou milieu MRS. Incuber la culture pendant la nuit à 37 degrés Celsius, sans secouer.

Pour commencer, dans une enceinte de biosécurité stérile, jetez l’eau autoclavée des réacteurs du système bioélectrochimique. Remplissez les chambres cathodiques avec 110 millilitres de milieu M9 autoclavé et les chambres anodiques avec 110 millilitres de MCDM fraîchement préparé. Remplacez un capuchon GL14 de la chambre anodique par un capuchon GL14 autoclave avec un anneau de plafond en silicone.

Vaporisez les électrodes de référence préparées avec de l’éthanol à 70 % avant de les placer à travers le capuchon de l’électrode dans chaque chambre anodique. Serrez tous les capuchons et pinces pour éviter les fuites. Pour fixer les réacteurs au système de pompe à eau, placez d’abord chaque réacteur sur la plate-forme de barre d’agitation appropriée.

Raccordez ensuite les embouts des chemises d’eau de chaque réacteur au suivant à l’aide d’un tube en caoutchouc, reliant les réacteurs d’extrémité aux tubes d’entrée et de sortie de la pompe à eau. Remplissez la pompe d’eau et ajoutez quatre à six gouttes de conditionneur d’eau. Allumez le système de pompe et réglez la température à 30 degrés Celsius.

Démarrez la pompe et observez l’écoulement de l’eau à travers toutes les chemises d’eau du réacteur, en confirmant qu’il n’y a pas de fuites. Allumez les plates-formes d’agitation et réglez-les sur une agitation continue à 220 tr/min. Pour fixer les réacteurs aux conduites de gaz d’épargne d’azote, fixez d’abord un filtre à air à une aiguille de calibre 22 et insérez l’aiguille à travers le septum supérieur d’une chambre anodique du réacteur dans le média.

Insérez une aiguille de calibre 18 dans le septum supérieur d’une chambre anodique de réacteur, puis connectez la conduite de gaz d’une source d’azote au filtre à air et ouvrez la vanne pour permettre au gaz de bouillonner doucement à travers le réacteur. Pour fixer les bioréacteurs aux fils du potentiostat, connectez le compteur de travail et les fils de pince crocodile de l’électrode de référence du potentiostat à leurs électrodes correspondantes. Après avoir saisi tous les paramètres, appuyez sur le triangle de départ vert pour commencer la course.

Observez les traces de tension en circuit ouvert pendant quelques minutes pour vous assurer que toutes les inductances se lisent positivement. et rapprochés avec un signal stable. Dans des conditions stériles, la sous-culture de L plantarum précédemment cultivée cultive un à 200 dans 50 millilitres de MMRS.

Faites pousser les cellules pendant la nuit à 37 degrés Celsius, sans secouer. Pour commencer, retirez de l’incubateur la culture L plantarum cultivée dans le MMRS. Transférez la culture dans un tube conique de 50 millilitres dans des conditions stériles et placez le tube sur de la glace.

Centrifugez la culture à 4 000 G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Retirez le surnageant avant de remettre la pastille en suspension dans 50 millilitres de PBS. Après le deuxième lavage, remettre en suspension les cellules dans du PBS froid à une densité optique de 600 nanomètres de 11.

Chargez deux millilitres de cellules remises en suspension dans une seringue de trois millilitres, munie d’une aiguille. À la station du réacteur, décapsulez une seringue cellulaire et insérez l’aiguille dans le haut d’une chambre anodique du réacteur. Une fois que toutes les seringues sont en place, appuyez sur les pistons pour injecter les cellules.

Enregistrer le temps d’injection à partir de la trace chronoampérométrique. Laissez le courant se stabiliser sur la piste pendant deux à quatre heures. Dans le système bioélectrochimique, étiqueter les réacteurs expérimentaux comme plus DHNA, et les réacteurs de contrôle de solvant comme moins DHNA.

Débouchez une seringue chargée de 110 microlitres de 20 milligrammes par millilitre de DHNA et insérez-la dans le haut de la chambre anodique, désignée comme plus DHNA. Insérez une seringue chargée de 110 microlitres de DMSO dans la chambre anodique, désignée comme moins DHNA. À l’aide d’une seringue de trois millilitres munie d’une aiguille de calibre 21, prélever deux millilitres de média de chaque chambre anodique par le septum à petit capuchon inutilisé.

Transférez les échantillons sur une plaque à 24 puits de profondeur pour mesurer le pH pendant le point zéro heure. Appuyez sur les pistons des seringues DHNA et DMSO pour injecter dans les réacteurs. Enregistrer le temps d’injection à partir de la trace chronoampérométrique.

Jetez toutes les seringues et aiguilles. Après 24 heures, retirez deux millilitres de média de chaque chambre anodique comme décrit précédemment, et transférez-le sur une plaque à 24 puits profonds pour des mesures de pH de 24 heures. Exécutez la voltampérométrie cyclique pendant le point de temps de 24 heures.

Mesurer et consigner le pH des échantillons prélevés sur 24 heures dans chaque réacteur. La densité de courant due au transfert d’électrons extracellulaires a atteint un pic d’environ 132 microampères par centimètre carré, huit heures après l’injection de DHNA. En revanche, l’injection de DMSO a entraîné une densité de courant négligeable.

Les données de voltampérométrie cyclique ont montré une nette augmentation du courant oxydatif à 50 millivolts en présence de L plantarum avec DHNA, par rapport à L plantarum avec DMSO et une augmentation de 256 % de la densité de courant à 300 millivolts, par rapport à la trace abiotique DHNA. Le transfert d’électrons extracellulaires a entraîné une baisse notable du pH à une moyenne de 3,33 sur 24 heures dans les échantillons contenant du L plantarum et du DHNA, tandis que les échantillons contenant du L plantarum et du DMSO avaient un pH moyen de 6,50.