Name: Visualisation en temps réel d’une molécule unique du déroulement de l’ADN par CMG Helicase (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-27T14:20:00.000+00:00
Duration: 7 min 37 s
Description: Découvrez une méthode de visualisation en temps réel du déroulement de l'ADN par l'hélicase CMG à l'échelle d'une molécule unique. Cette technique microfluidique révèle les dynamiques de la réplication eucaryote.

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<meta charset="utf8"></head><body>Déroulement de l’ADN médié par CMG observé par la croissance du tractus ssDNA-RPA

<ol><li>Bell, S. P., Labib, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome+Duplication+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Chromosome Duplication in Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 203 (3), 1027-1067 (2016).</li>
<li>Costa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structural+basis+for+MCM2-7+helicase+activation+by+GINS+and+Cdc45%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The structural basis for MCM2-7 helicase activation by GINS and Cdc45.</a> Nat Struct Mol Biol. 18 (4), 471-477 (2011).</li>
<li>Jones, M. L., Baris, Y., Taylor, M. R. G., Yeeles, J. T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+a+human+replisome+shows+the+organisation+and+interactions+of+a+DNA+replication+machine%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Structure of a human replisome shows the organisation and interactions of a DNA replication machine.</a> EMBO J. 40 (23), e108819(2021).</li>
<li>Moyer, S. E., Lewis, P. W., Botchan, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+the+Cdc45%2FMcm2-7%2FGINS+%28CMG%29+complex%2C+a+candidate+for+the+eukaryotic+DNA+replication+fork+helicase%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Isolation of the Cdc45/Mcm2-7/GINS (CMG) complex, a candidate for the eukaryotic DNA replication fork helicase.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (27), 10236-10241 (2006).</li>
<li>Douglas, M. E., Ali, F. A., Costa, A., Diffley, J. F. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+of+eukaryotic+CMG+helicase+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The mechanism of eukaryotic CMG helicase activation.</a> Nature. 555 (7695), 265-268 (2018).</li>
<li>Ilves, I., Petojevic, T., Pesavento, J. J., Botchan, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+the+MCM2-7+helicase+by+association+with+Cdc45+and+GINS+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Activation of the MCM2-7 helicase by association with Cdc45 and GINS proteins.</a> Mol Cell. 37 (2), 247-258 (2010).</li>
<li>Dewar, J. M., Walter, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+DNA+replication+termination%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of DNA replication termination.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 18 (8), 507-516 (2017).</li>
<li>Burnham, D. R., Kose, H. B., Hoyle, R. B., Yardimci, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+of+DNA+unwinding+by+the+eukaryotic+replicative+helicase%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">The mechanism of DNA unwinding by the eukaryotic replicative helicase.</a> Nat Commun. 10 (1), 2159(2019).</li>
<li>Kose, H. B., Larsen, N. B., Duxin, J. P., Yardimci, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+the+eukaryotic+replicative+helicase+at+lagging-strand+protein+barriers+support+the+steric+exclusion+model%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Dynamics of the eukaryotic replicative helicase at lagging-strand protein barriers support the steric exclusion model.</a> Cell Rep. 26 (8), 2113-2125.e6 (2019).</li>
<li>Kose, H. B., Xie, S., Cameron, G., Strycharska, M. S., Yardimci, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Duplex+DNA+engagement+and+RPA+oppositely+regulate+the+DNA-unwinding+rate+of+CMG+helicase%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Duplex DNA engagement and RPA oppositely regulate the DNA-unwinding rate of CMG helicase.</a> Nat Commun. 11 (1), 3713(2020).</li>
<li>Tanner, N. A., Van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+DNA+replication+at+the+single-molecule+level%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Visualizing DNA replication at the single-molecule level.</a> Methods Enzymol. 475, 259-278 (2010).</li>
<li>Swoboda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+oxygen+scavenging+for+photostability+without+ph+drop+in+single-molecule+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Enzymatic oxygen scavenging for photostability without ph drop in single-molecule experiments.</a> ACS Nano. 6 (7), 6364-6369 (2012).</li>
<li>Baris, Y., Taylor, M. R. G., Aria, V., Yeeles, J. T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+and+efficient+DNA+replication+with+purified+human+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Fast and efficient DNA replication with purified human proteins.</a> Nature. 606, 204-210 (2022).</li>
<li>Lewis, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tunability+of+DNA+polymerase+stability+during+eukaryotic+DNA+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Tunability of DNA polymerase stability during eukaryotic DNA replication.</a> Mol Cell. 77 (1), 17-25.e5 (2020).</li>
<li>Li, Z., Xu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-translational+modifications+of+the+mini-chromosome+maintenance+proteins+in+DNA+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Genes%22%5BJournal%5D)">Post-translational modifications of the mini-chromosome maintenance proteins in DNA replication.</a> Genes. 10 (5), 331(2019).</li>
<li>Lewis, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+replication+origin+melting+nucleated+by+CMG+helicase+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mechanism of replication origin melting nucleated by CMG helicase assembly.</a> Nature. 606 (7916), 1007-1014 (2022).</li>
<li>Zeman, M. K., Cimprich, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Causes+and+consequences+of+replication+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Causes and consequences of replication stress.</a> Nat Cell Biol. 16 (1), 2-9 (2014).</li>
<li>Sparks, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CMG+helicase+bypasses+DNA-protein+cross-links+to+facilitate+their+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The CMG helicase bypasses DNA-protein cross-links to facilitate their repair.</a> Cell. 176 (1-2), 167-181.e21 (2019).</li>
<li>Taylor, M. R. G., Yeeles, J. T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+initial+response+of+a+eukaryotic+replisome+to+DNA+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">The initial response of a eukaryotic replisome to DNA damage.</a> Mol Cell. 70 (6), 1067-1080.e12 (2018).</li>
<li>Amunugama, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+fork+reversal+during+DNA+interstrand+crosslink+repair+requires+CMG+unloading%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Replication fork reversal during DNA interstrand crosslink repair requires CMG unloading.</a> Cell Rep. 23 (12), 3419-3428 (2018).</li>
<li>Wu, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRAIP+is+a+master+regulator+of+DNA+interstrand+crosslink+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">TRAIP is a master regulator of DNA interstrand crosslink repair.</a> Nature. 567 (7747), 267-272 (2019).</li>
<li>Vrtis, K. B., Dewar, J. M., Chistol, G., Wu, R. A., Graham, T. G. W., Walter, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-strand+DNA+breaks+cause+replisome+disassembly%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Single-strand DNA breaks cause replisome disassembly.</a> Mol Cell. 81 (6), 1309-1318.e6 (2021).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>2-Mercaptoéthanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3148-25ML</td><td></td></tr><tr><td>Solution acrylamide / Bis 40 % & nbsp ;</td><td>BioRad</td><td>1610148</td><td></td></tr><tr><td>Agarose UltraPure & nbsp ;</td><td>Invitrogen</td><td>16500-500</td><td>Utilisé pour préparer Tris Buffer (pH 8)</td></tr><tr><td>&Auml ; KTA Pure&nbsp ;</td><td>GE Healthcare</td><td>-</td><td>Utilisé avec le collecteur de fractions F9-C ; Système de purification des protéines</td></tr><tr><td>Gel d’affinité ANTI-FLAG M2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2220</td><td></td></tr><tr><td>APS 10 % & nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3678-25G</td><td></td></tr><tr><td>ATP (200 mM)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7699-5G</td><td></td></tr><tr><td>ATP-g-s (100 mM)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11162306001</td><td></td></tr><tr><td>Enveloppe de couverture Biotine-PEG</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Préparé comme décrit : https://doi.org/10.1016/j.ymeth.2012.03.033</td></tr><tr><td>Anticorps anti-digoxigénine biotinylé &nbsp ;</td><td>Perkin Elmer</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Blu Tack</td><td>Bostik</td><td>N/A</td><td>Mastic adhésif</td></tr><tr><td>Acide borique</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>B/3800/53</td><td></td></tr><tr><td>BSA ; 33 mg/mL</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>A3858-10G</td><td>Dilué à partir du stock</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7902</td><td></td></tr><tr><td>CaptoHiRes Q (5/50)</td><td>Cytiva</td><td>29275878</td><td>Relié au système de purification des protéines AKTA ; Colonne de chromatographie à échange d’ions à haute résolution</td></tr><tr><td>Caséine (5 % dans l’eau, 50 mg/mL)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4765-10ML</td><td></td></tr><tr><td>Système ChemiDoc</td><td>Bio-Rad</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Extraits</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Planche à découper</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Tube de dialyse (3,5 kDa)</td><td>Fisher Scientific</td><td>11425859</td><td></td></tr><tr><td>Digoxigénine-11-dUTP</td><td>Roche</td><td>11209256910</td><td></td></tr><tr><td>colorant de chargement ADN 6x&nbsp ;</td><td>NEB</td><td>B7024S</td><td></td></tr><tr><td>dNTP 10 mM</td><td>NEB</td><td>N0447S</td><td></td></tr><tr><td>Ruban double face (0,14 mm d’épaisseur)</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>TDT</td><td>Fluorochem Limited</td><td>M02712-10G</td><td></td></tr><tr><td>DYKDDDDK peptide&nbsp ;</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Synthétisé par le STP de biologie chimique de l’Institut Francis Crick</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D/0700/68</td><td></td></tr><tr><td>EGFP-RPA&nbsp ;</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Purifié tel que dériblé dans ' Analyse à molécule unique », Series Methods in Molecular Biology, Vol. 783 (2011), Peterman, E. J. G. et Wuite G. J. L. éditeurs, Humana Press. Informations sur les protéines : 2 mM, humaine, exprimée dans E. coli.</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>03779-10G</td><td></td></tr><tr><td>Époxy - 5 minutes</td><td>Devcon</td><td>20845</td><td></td></tr><tr><td>Fujifilm FLA-5000&nbsp ;</td><td>Fujifilm</td><td>&nbsp ; FLA-5000&nbsp ;</td><td>Analyseur d’image fluorescente</td></tr><tr><td>Coloration aux acides nucléiques GelRed ; 10000x</td><td>Cambridge Bioscience</td><td>41003-BT</td><td>Exemple de coloration aux acides nucléiques, qui est une alternative plus sûre au bromure d’ethidium.</td></tr><tr><td>Lame en verre ou quartz avec trous pour tubulature & nbsp ;</td><td>Dremel Modèle 395</td><td></td><td>Lame d’épaisseur de 1 mm, coupée à 2,4 cm x 1 cm, deux trous percés à 1,4 mm l’un de l’autre. Les trous doivent être percés de différentes tailles pour accueillir différents tubes à chaque extrémité.</td></tr><tr><td>Glycérol</td><td>Fisher Scientific</td><td>G/0650/17</td><td></td></tr><tr><td>Glycine HCl, pH 3,5</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8898</td><td></td></tr><tr><td>Seringue Hamilton, série 1000 GASTIGHT, verrou Luer en PTFE 1010TLL, verrou Luer en PTFE (avec fentes), volume 10 mL</td><td>Merck</td><td>26211-U</td><td></td></tr><tr><td>HEPES pH 7,5</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>I-CeuI</td><td>NEB</td><td>R0699L</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>P/4280/53</td><td></td></tr><tr><td>Acétate de magnésium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2545</td><td></td></tr><tr><td>Kit de dialyse Maxi GeBaFlex à tube ; MWCO 14 kDa&nbsp ;</td><td>Generon</td><td>D055</td><td></td></tr><tr><td>Spatule métallique</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Pinces métalliques</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2393</td><td></td></tr><tr><td>Millex-GP (filtres à seringue) 0,22 & micro ; m&nbsp ;</td><td>Merck</td><td>SLGP033RS</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Aiguille</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>NotI-HF</td><td>NEB</td><td>R3189L</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE 4 %&ndash ; Gels protéiques bis-tris à 12 %</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10247002;</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE MOPS SDS Exécutant le buffer&nbsp ;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NP0001</td><td></td></tr><tr><td>Chauffage à objectif</td><td>Okolab</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Mélange PCR - 2x</td><td></td><td></td><td>Préparé à partir de Phusion DNA polymérase (20 & micro ; L), 10 mM dNTP (40 & micro ; L), 5x tampon Phusion HF (400 & micro ; L) et de l’eau (540 & micro ; L).</td></tr><tr><td>Peptide NH2-CHHHHHHHHHHLPETGG-COOH, marqué avec LD655-MAL&nbsp ;</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>le peptide NH2-CHHHHHHHHHHLPETGG-COOH, marqué avec LD655-MAL (Lumidyne Technologies) sur le résidu de cystéine, a été synthétisé et purifié par le chimie peptidique STP de l’Institut Francis Crick</td></tr><tr><td>Plasmide pGC261</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>https://doi.org/10.1016/j.cell.2018.10.053</td></tr><tr><td>Polymérase à ADN haute fidélité Phusion</td><td>NEB</td><td>M0530L</td><td></td></tr><tr><td>Pinces en plastique</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Tube en polyéthylène PE20 (diamètre intérieur 0,015 », diamètre extérieur 0,043 »)</td><td>Becton Dickinson</td><td>427406</td><td></td></tr><tr><td>Tube en polyéthylène PE60 (diamètre intérieur 0,03 », diamètre extérieur 0,048 »)</td><td>Becton Dickinson</td><td>427416</td><td></td></tr><tr><td>colonnes de chromatographie Poly-Prep ; 10 ml et 20 ml&nbsp ;</td><td>Bio-Rad</td><td>7311550</td><td></td></tr><tr><td>Glutamate de potassium (L-glutamatique sel de potassium monohydrate)</td><td>Sigma</td><td>G1501-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Cocktail inhibiteur de protéase (cOmplete, sans EDTA)</td><td>Roche</td><td>5056489001</td><td></td></tr><tr><td>Pump 11 Elite Infusion/Retrait programmable seringue simple</td><td>Appareil de Harvard</td><td>70-4504</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR Purification Kit</td><td>QIAGEN</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>Lame de rasoir</td><td>VWR International Ltd</td><td>233-0156</td><td></td></tr><tr><td>tampon rCutSmart ; 10x</td><td>NEB</td><td>B6004S</td><td></td></tr><tr><td>Acétate de sodium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S/2120/53</td><td></td></tr><tr><td>Sortase (pentamutant)</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Purifié basé sur : https://doi.org/10.1073/pnas.1101046108</td></tr><tr><td>Filtres à tubes centrifugeuses Spin-X ; 0,22 & micro ; Acétate de cellulose de m &nbsp ;</td><td>Fisher Scientific</td><td>10310361</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel stérile</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Système de filtration jetable à vide Steritop ; 0,22 hum ; PES ; &nbsp ;</td><td>Millipore</td><td>S2GPT05RE</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidine (1 mg/mL) dans 1x tampon PBS</td><td>Sigma</td><td>S4762-10MG</td><td>20 & micro ; Les aliguettes L</td></tr><tr><td>SYBR Or</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S11494</td><td>Coloration très sensible à l’acide nucléique que nous avons utilisée pour visualiser le substrat de la fourche d’ADN.</td></tr><tr><td>SYTOX orange ; 5 & micro ; M dans DMSO</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S11368</td><td></td></tr><tr><td>Ligase de l’ADN T4</td><td>NEB</td><td>M0202M</td><td></td></tr><tr><td>Tampon de réaction de ligase de l’ADN T4 &nbsp ;</td><td>NEB</td><td>B0202S</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9281-25ML&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Protéase TEV (1 mg/mL) ; EZCut&nbsp ;</td><td>Biovision</td><td>7847-10000</td><td></td></tr><tr><td>Broyeurs de tissus, type Dounce (40 mL, Wheaton)</td><td>DWK Sciences de la Vie</td><td>432-1273</td><td></td></tr><tr><td>Base Tris</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td>Utilisé pour préparer Tris Buffer (pH 8)</td></tr><tr><td>Tris HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3253</td><td></td></tr><tr><td>Préadolescent-20</td><td>Promega UK Ltd</td><td>H5152</td><td></td></tr></tbody></table>

visualisation en temps réel d’une molécule unique du déroulement de l’adn par cmg helicase

Single-Molecule Real-Time Visualization of DNA Unwinding by CMG Helicase

Visualisation en temps réel d’une molécule unique du déroulement de l’ADN par CMG Helicase

Faithful genome duplication is essential for preserving the genetic stability of dividing cells. DNA replication is carried out during the S phase by a ...

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