Name: Détermination de la stabilité sérique de l’enzyme adénosine désaminase 1 humaine (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-27T14:25:00.000+00:00
Duration: 4 min 17 s
Description: Découvrez comment évaluer la stabilité sérique d'enzymes pour prédire leur profil pharmacocinétique et leur efficacité thérapeutique. Cette méthode guide l'ingénierie des protéines biologiques.

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1. Incubation sérique
<ol><li>Préparez une quantité 10x de HsADA1 dans 1x PBS pH 7,4 (1x PBS) à une concentration finale de 10 μM. Décongelez une aliquote de 15 mL de sérum humain mélangé et préchauffez-la à 37 °C. Préchauffer une aliquote de 50 mL de 1x PBS à 37 °C.</li>
	<li>Préparez les mélanges d’incubation enzyme-sérum en ajoutant 100 μL de la matrice 10x HsADA1 à 900 μL de sérum humain mélangé dans un tube de microcentrifugation à faible liaison, appelé mélange enzyme + sérum. Dans un tube de microcentrifugation séparé à faible liaison, ajoutez 100 μL de la matrice 10x HsADA1 à 900 μL de 1x PBS pour comparaison avec un témoin non sérum, appelé mélange enzyme + 1x PBS. La concentration finale de HsADA1 dans chaque mélange sera de 1 μM.</li>
	<li>Préparez un témoin supplémentaire dans un tube de microcentrifugation à faible liaison composé de 100 μL de 1x PBS mélangé à 900 μL de sérum humain mélangé. Cela servira de contrôle non enzymatique pour le mélange enzyme + sérum. De plus, faites un contrôle composé de 1 mL de 1x PBS. Cela servira de contrôle non enzymatique pour le mélange enzyme + 1x PBS.</li>
	<li>Aliquote 100 μL de chaque mélange à partir de l’étape 1.2 dans des tubes séparés à faible liaison et diluer 1:1 avec 100 μL de glycérol à 30 % (v/v) dans 1x PBS. Congeler rapidement avec de l’azote liquide et conserver à -80 °C. Ces échantillons seront le point temporel du jour 0, et la concentration de HsADA1 dans ceux-ci sera de 500 nM. Répétez cette étape pour les mélanges de contrôle non enzymatiques à partir de 1.3. Scellez toutes les enzymes et les mélanges de contrôle avec un film transparent et placez-les dans un incubateur à 37 °C.</li>
	<li>Après 24 h, aliquote 100 μL de chaque échantillon incubé et diluer 1:1 avec 100 μL de glycérol à 30 % (v/v) dans 1x PBS. Congeler rapidement avec de l’azote liquide et conserver à -80 °C. Ces échantillons seront le point temporel du jour 1. Remettre tous les mélanges d’enzymes et de témoins dans l’incubateur à 37 °C. Répétez cette étape à 72 h et 120 h. REMARQUE : Les échantillons aliquotes n’ont pas nécessairement besoin d’être surgelés. L’utilisateur peut également effectuer le test sur microplaques immédiatement après le prélèvement de chaque échantillon, bien que de nouvelles courbes standard et des stocks de substrat d’adénosine doivent être préparés chaque fois qu’un échantillon est testé.</li>
</ol>2. Dosage sur microplaque
<ol><li>Préparez le lecteur de microplaques en mettant en place un protocole de lecture cinétique (Figure 2) pour mesurer l’absorbance à 260 nm avec l’intervalle de lecture le plus court pendant 30 min et préchauffer le lecteur à un point de consigne de 37 °C.</li>
	<li>Décongeler tous les échantillons prélevés sur de la glace. Diluer chaque échantillon décongelé à l’aide de 1x PBS préchauffé à 37 °C comme diluant dans des tubes de microcentrifugation à faible liaison. La nouvelle concentration de HsADA1 dans ces échantillons sera de 50 nM.</li>
	<li>Faites une dilution 10x dans 1x PBS à partir de l’échantillon de contrôle sérique non enzymatique également. De plus, préparez un stock d’adénosine de 5 mM en ajoutant 66,8 mg d’adénosine à 50 mL de 1x PBS. Préparez une dilution de 250 μM d’adénosine en ajoutant 400 μL de la pâte d’adénosine à 7 600 μL de 1x PBS et préchauffez-la à 37 °C dans un incubateur.</li>
	<li>À une microplaque compatible avec les UV à 96 puits, ajoutez 160 μL de dilution d’adénosine de 250 μM et 40 μL de chaque échantillon de protéine diluée en trois exemplaires pour un volume total de 200 μL. Cela donnera une concentration finale d’adénosine de 200 μM et une concentration finale d’enzyme de 10 nM.</li>
	<li>Répéter la dilution pour les échantillons témoins en ajoutant 40 μL de sérum dilué ou 1 témoin PBS et 160 μL de la dilution de 250 μM d’adénosine en trois exemplaires. Cela donnera également une concentration finale d’adénosine de 200 μM mais sans enzyme. REMARQUE : Il peut être avantageux d’ajouter d’abord tous les échantillons d’enzymes et de contrôle dilués individuellement à la microplaque, puis d’ajouter le substrat d’adénosine avec une micropipette à 12 canaux pour réduire le temps de chargement total. De plus, des plaques transparentes aux UV doivent être utilisées dans cette étape pour éviter que la plaque elle-même ne confonde le signal d’absorbance mesuré.</li>
	<li>Mesurer l’absorbance de chaque puits à 260 nm pendant 30 min à 37 °C. Une fois cela fait, exportez les données vers une feuille de calcul pour une analyse plus approfondie.</li>
</ol>3. Analyse des données des lecteurs de microplaques
<ol><li>Déterminez la pente de la région linéaire des données d’absorbance en fonction du temps pendant les premières minutes des données de microplaques. Pour les échantillons dilués dans le sérum, cela correspondait aux premiers ~120 s. Pour les échantillons 1x dilués par PBS, cela correspondait aux premiers ~270 s. Cette pente de valeurs d’absorbance décroissantes aura une valeur numérique négative et aura des unités de variation en unités d’absorbance par seconde (ΔA260/s).</li>
	<li>Soustrayez la pente du témoin négatif constitué de sérum humain regroupé de la pente des données enzyme + sérum. Effectuez la même opération sur les mélanges enzyme + 1x PBS en soustrayant la pente du témoin 1x PBS.</li>
	<li>Normalisez toutes les pentes ajustées à la pente d’origine à t = 0 h pour obtenir la fraction d’activité restante à l’aide de l’équation 1. <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/67216/67216eq01.jpg" style="margin: auto;">Équation 1</li>
	<li>Tracez la fraction d’activité restante en fonction du temps.</li>
</ol>

<meta charset="utf8"></head><body>Évaluation de la stabilité sérique de HsADA1 : une approche basée sur des microplaques

<ol><li>Valero, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+serum-stable+RNA+aptamer+specific+for+SARS-COV-2+neutralizes+viral+entry%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A serum-stable RNA aptamer specific for SARS-COV-2 neutralizes viral entry.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 118 (50), e2112942118(2021).</li>
<li>Iannuzo, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+screening+identifies+synthetic+peptides+with+antibacterial+activity+against+mycobacterium+abscessus+and+serum+stability%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Omega%22%5BJournal%5D)">High-throughput screening identifies synthetic peptides with antibacterial activity against mycobacterium abscessus and serum stability.</a> ACS Omega. 7 (27), 23967-23977 (2022).</li>
<li>Ma, M. T., Jennings, M. R., Blazeck, J., Lieberman, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Catalytically+active+holo+homo+sapiens+adenosine+deaminase+i+adopts+a+closed+conformation%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallograph+Sect+D%22%5BJournal%5D)">Catalytically active holo homo sapiens adenosine deaminase i adopts a closed conformation.</a> Acta Crystallograph Sect D. 78 (1), 91-103 (2022).</li>
<li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+4+nucleosides+via+one+reference+compound+in+chinese+cordyceps+by+hplc-uv+at+equal+absorption+wavelength%5BTitle%5D)+AND+%22Natural+Prod+Comm%22%5BJournal%5D)">Determination of 4 nucleosides via one reference compound in chinese cordyceps by hplc-uv at equal absorption wavelength.</a> Natural Prod Comm. 18 (3), 1934578X231161410(2023).</li>
<li>Whitmore, K. V., Gaspar, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenosine+deaminase+deficiency+-+more+than+just+an+immunodeficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Adenosine deaminase deficiency - more than just an immunodeficiency.</a> Front Immunol. 7, 314(2016).</li>
<li>Jennings, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+expression+and+purification+of+a+human+adenosine+deaminase+in+E.+coli+and+characterization+of+its+asp8asn+variant%5BTitle%5D)+AND+%22Prot+Express+Purificat%22%5BJournal%5D)">Optimized expression and purification of a human adenosine deaminase in E. coli and characterization of its asp8asn variant.</a> Prot Express Purificat. 213, 106362(2024).</li>
<li>Blazeck, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bypassing+evolutionary+dead+ends+and+switching+the+rate-limiting+step+of+a+human+immunotherapeutic+enzyme%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Catalysis%22%5BJournal%5D)">Bypassing evolutionary dead ends and switching the rate-limiting step of a human immunotherapeutic enzyme.</a> Nat Catalysis. 5 (10), 952-967 (2022).</li>
<li>Lu, J., Grenache, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+rapid%2C+microplate-based+kinetic+assay+for+measuring+adenosine+deaminase+activity+in+body+fluids%5BTitle%5D)+AND+%22Clinica+Chimica+Acta%22%5BJournal%5D)">Development of a rapid, microplate-based kinetic assay for measuring adenosine deaminase activity in body fluids.</a> Clinica Chimica Acta. 413 (19), 1637-1640 (2012).</li>
<li>Maciel, L. G., Dos Anjos, J. V., Soares, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+and+low-cost+evaluation+of+hydroxykynurenine+activity%5BTitle%5D)+AND+%22MethodsX%22%5BJournal%5D)">Fast and low-cost evaluation of hydroxykynurenine activity.</a> MethodsX. 7, 100982(2020).</li>
<li>Bokman, A. H., Schweigert, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3-hydroxyanthranilic+acid+metabolism.+Iv.+Spectrophotometric+evidence+for+the+formation+of+an+intermediate%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Biochem+Biophys%22%5BJournal%5D)">3-hydroxyanthranilic acid metabolism. Iv. Spectrophotometric evidence for the formation of an intermediate.</a> Arch Biochem Biophys. 33 (2), 270-276 (1951).</li>
<li>Tanford, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTanford%2C+C+%22Advances+in+protein+chemistry%22">Advances in protein chemistry</a>. 23, Academic Press. 121-282 (1968).</li>
<li>Tritsch, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validity+of+the+continuous+spectrophotometric+assay+of+kalckar+for+adenosine+deaminase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Validity of the continuous spectrophotometric assay of kalckar for adenosine deaminase activity.</a> Anal Biochem. 129 (1), 207-209 (1983).</li>
<li>Gracia, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+catalytic+site+structural+gate+of+adenosine+deaminase+allosterically+modulates+ligand+binding+to+adenosine+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">The catalytic site structural gate of adenosine deaminase allosterically modulates ligand binding to adenosine receptors.</a> FASEB J. 27 (3), 1048-1061 (2013).</li>
<li>Kalckar, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+spectrophotometry+of+purine+compounds+by+means+of+specific+enzymes%3A+Iii.+Studies+of+the+enzymes+of+purine+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bio+Chem%22%5BJournal%5D)">Differential spectrophotometry of purine compounds by means of specific enzymes: Iii. Studies of the enzymes of purine metabolism.</a> J Bio Chem. 167 (2), 461-475 (1947).</li>
<li>Hartwick, R., Jeffries, A., Krstulovic, A., Brown, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+assay+for+adenosine+deaminase+using+reverse+phase+high+pressure+liquid+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatographic+Sci%22%5BJournal%5D)">An optimized assay for adenosine deaminase using reverse phase high pressure liquid chromatography.</a> J Chromatographic Sci. 16 (9), 427-435 (1978).</li>
<li>Paul, M. K., Grover, V., Mukhopadhyay, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Merits+of+hplc-based+method+over+spectrophotometric+method+for+assessing+the+kinetics+and+inhibition+of+mammalian+adenosine+deaminase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatography+B%22%5BJournal%5D)">Merits of hplc-based method over spectrophotometric method for assessing the kinetics and inhibition of mammalian adenosine deaminase.</a> J Chromatography B. 822 (1), 146-153 (2005).</li>
<li>Ubbink, J. B., Vermaak, W. J. H., Bissbort, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-performance+liquid+chromatographic+assay+of+human+lymphocyte+kynureninase+activity+levels%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatography+B%3A+Biomed+Sci+Appl%22%5BJournal%5D)">High-performance liquid chromatographic assay of human lymphocyte kynureninase activity levels.</a> J Chromatography B: Biomed Sci Appl. 566 (2), 369-375 (1991).</li>
<li>Tsentalovich, Y. P., Snytnikova, O. A., Forbes, M. D. E., Chernyak, E. I., Morozov, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photochemical+and+thermal+reactivity+of+kynurenine%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Photochemical and thermal reactivity of kynurenine.</a> Exp Eye Res. 83 (6), 1439-1445 (2006).</li>
<li>Demain, A. L., Vaishnav, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+recombinant+proteins+by+microbes+and+higher+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Adv%22%5BJournal%5D)">Production of recombinant proteins by microbes and higher organisms.</a> Biotechnol Adv. 27 (3), 297-306 (2009).</li>
<li>Gräslund, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+production+and+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Protein production and purification.</a> Nat Methods. 5 (2), 135-146 (2008).</li>
<li>Faber, M. S., Whitehead, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Data-driven+engineering+of+protein+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Data-driven engineering of protein therapeutics.</a> Curr Opin Biotechnol. 60, 104-110 (2019).</li>
<li>Das, S., Zhao, L., Elofson, K., Finn, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzyme+stabilization+by+virus-like+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Enzyme stabilization by virus-like particles.</a> Biochemistry. 59 (31), 2870-2881 (2020).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Adénosine&nbsp ;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9251-25G</td><td>25 g</td></tr><tr><td>BioTek Synergy HT Lecteur</td><td></td><td></td><td></td>de microplaques</tr><tr><td>Eppendorf LoBind Microcentrifugeuses Tubes : Protéines&nbsp ;</td><td>Fisher Scientific&nbsp ;</td><td>13-698-795</td><td>2 mL</td></tr><tr><td>de glycérol</td><td>Fisher Scientific&nbsp ;</td><td>G33-4</td><td>4 L</td></tr><tr><td>HsKYNase66-W102H-T333N</td><td>Sérum humain interne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>, Pooled</td><td>MP Biomedicals</td><td>92931149</td><td>100 mL</td></tr><tr><td>Hydroxy-kynurenine</td><td>Cayman Chemicals</td><td>27778</td><td></td></tr><tr><td>Inosine&nbsp ;</td><td>TCI</td><td>I0037</td><td>25 g</td></tr><tr><td>PBS, 1x&nbsp ; pH 7,4+/- 0,1</td><td>Corning</td><td>21-040-CM</td><td></td></tr><tr><td>Pyridoxal 5-phosphate monohydraté, 99 %&nbsp ;</td><td>Thermo Scientifc</td><td>228170010</td><td>1 g</td></tr><tr><td>UV-STAR MICROPLATE, 96 PUITS, COC, F-BOTTOM</td><td>Greiner Bio</td><td>&nbsp ; </td><td></td>655801</tr><tr><td>Wildtype Adénosine désaminase humaine 1</td><td>en interne</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

détermination de la stabilité sérique de l’enzyme adénosine désaminase 1 humaine

Determining the Serum Stability of Human Adenosine Deaminase 1 Enzyme

Les figures montrent les résultats de l’analyse lorsqu’elle a été menée avec HsADA1 de type sauvage. Les figures 3A et B illustrent les courbes de baisse de l’absorbance à 260 nm des échantillons provenant des mélanges 1x PBS/sérum et enzymes pour HsADA1 de type sauvage après ajout d’adénosine. Cette absorbance décroissante en fonction des données temporelles est ce à quoi l’utilisateur peut s’attendre une fois le test sur microplaque réussi et est similaire aux données d’absorbance qui résulteraient de l’ajout de quantités suffisantes de HsADA1 fonctionnelle à l’adénosine. La figure 3C,D illustre les courbes d’absorbance des témoins négatifs testés, qui ne contiennent aucune enzyme après l’ajout d’adénosine. Par rapport aux échantillons d’enzymes réels, la variation de l’absorbance de ces témoins négatifs est presque négligeable. Sur la figure 3, on peut voir que les pentes des courbes enzymatiques changent en fonction du temps d’incubation. Par exemple, la pente du point de temps du jour 0 est considérablement plus raide que celle du point de temps du jour 5.
La figure 4 illustre la fraction de l’activité conservée par HsADA1 de type sauvage en fonction du temps lorsqu’il est incubé dans 1x PBS ou dans un sérum humain mélangé à 37 °C. Plus précisément, les pentes de toutes les courbes de baisse de l’absorbance de la figure 3A et B sont normalisées en fonction des pentes du jour 0 de leurs groupes respectifs. Comme on peut le voir sur la figure 4, il existe une divergence dans l’activité conservée pour le HsADA1 de type sauvage dans 1x PBS par rapport au sérum humain mélangé. Plus précisément, l’enzyme perd son activité plus rapidement dans le sérum humain mélangé, l’enzyme conservant environ 10 % de son activité d’origine au jour 5. Une perte d’activité est toujours détectable lorsque HsADA1 est incubé dans 1x PBS, bien que l’enzyme conserve environ 75% de son activité. Ceci est conforme aux résultats de Jennings et al., qui signalent également une diminution de l’activité après incubation avec du sérum à 37 °C de près de 40 % après 48 h6. Lu et al. ont également montré que l’activité de HsADA1 diminue dans les fluides corporels pleuraux, péritonéaux et céphalo-rachidiens à température ambiante (25 °C)8.
Pour démontrer la flexibilité de ce protocole, nous l’avons utilisé pour tester la stabilité sérique d’une autre enzyme d’origine humaine, une variante modifiée de la kynurénase humaine précédemment baptisée HsKYNase66-W102H-T333N7. HsKYNase66_W102H-T333N catalyse efficacement la conversion de OH-Kyn en OH-AA, similaire à l’enzyme HsKYNase de type sauvage, bien qu’il s’agisse en fait d’un mutant de réversion à deux acides aminés d’une variante de kynurénase humaine modifiée avec une spécificité de substrat modifiée, c’est-à-dire qui dégrade efficacement la kynurénine en acide anthranilique7. OH-Kyn absorbe fortement à 379 nm, contrairement à OH-AA, ce qui entraîne une baisse mesurable de l’absorbance lors de l’ajout de notre variante HsKYNase modifiée à OH-kyn 9,10. La figure 5A,B illustre les courbes de baisse de l’absorbance à 379 nm des échantillons provenant des mélanges 1x PBS/sérum-enzymes pour HsKYNase après l’ajout de OH-Kyn. La figure 5C,D illustre les courbes d’absorbance des témoins testés qui ne contiennent pas d’enzymes. Comme on l’a vu avec HsADA1, il y a une nette différence dans les pentes des courbes d’absorbance entre les échantillons. Cela est particulièrement évident dans la figure 5A, car la pente du point de temps de 0 h est beaucoup plus raide que celle des points de temps de 3 h et de 24 h. La figure 6 illustre la fraction correspondante de l’activité retenue pour la HsKYNase testée en fonction du temps. Comme HsADA1, HsKYNase66-W102H-T333N perd de l’activité dans le sérum plus rapidement que dans le PBS (~85% d’activité perdue contre ~40% au cours de 24 heures). Bien que la stabilité sérique de cette variante enzymatique n’ait pas été testée auparavant, elle suit la tendance générale des autres variantes de la HsKYNase, qui ont également perdu la majeure partie de leur activité en 24 heures dans le sérum à 37 °C7. 
D’une manière générale, les enzymes peuvent perdre de leur activité au fil du temps en raison d’une foule de facteurs, notamment le pH, la concentration en sel, la température, etc. 11. Par conséquent, un résultat qui ne suit pas cette tendance pourrait être considéré comme anormal. Par exemple, si l’activité enzymatique augmente considérablement au fil du temps, cela pourrait indiquer que les résultats ne sont pas valides. Cela suppose que les conditions enzymatiques ne sont pas modifiées, et nous parlons strictement dans un sens temporel.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67216/67216fig01.jpg"> Figure 1 : Organigramme détaillant les étapes du protocole pour HsADA1. La figure montre les étapes suivies dans ce protocole. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67216/67216fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67216/67216fig02.jpg"> Figure 2 : Paramètres de lecture cinétique du lecteur de microplaques. Un protocole de lecture cinétique a été créé pour mesurer l’absorbance à 260 nm pendant 30 min à 37 °C avec l’intervalle minimum. La figure représente les paramètres choisis pour configurer ce protocole. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67216/67216fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67216/67216fig03.jpg"> Figure 3 : Courbes d’absorbance en fonction du temps pour HsADA1 après l’ajout de 200 μM d’adénosine. (A) Courbes d’absorbance en fonction du temps pour HsADA1 incubée dans le sérum après l’ajout de 200 μM d’adénosine. (B) 1x HsADA1 incubé par PBS. (C) Contrôle sérique négatif. (D) 1x témoin négatif PBS (n = 3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67216/67216fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67216/67216fig04.jpg"> Figure 4 : Rétention de l’activité HsADA1. L’activité est évaluée dans 1x PBS par rapport au sérum humain combiné à 37 °C. La fraction de l’activité initiale retenue pour HsADA1 incubée dans 1x PBS par rapport au sérum humain combiné sur une période de 5 jours a été déterminée (barres = moyenne ± écart-type, n = 3). Un test t bilatéral non apparié a été utilisé *p&lt;0,05, **p &lt; 0,01 et ***p &lt; 0,001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67216/67216fig04large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67216/67216fig05.jpg"> Figure 5 : Courbes d’absorbance en fonction du temps pour HsKYNase66-W102H-T333N après l’ajout de 400 μM OH-Kyn. (A) Courbes d’absorbance en fonction du temps pour la HsKYNase incubée dans le sérum après l’ajout de 400 μM OH-Kyn. (B) 1x HsKYNase incubée par PBS. (C) Contrôle sérique négatif. (D) 1x témoin négatif PBS (n=3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67216/67216fig05large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67216/67216fig06.jpg"> Figure 6 : Rétention d’activité HsKYNase66-W102H-T333N. L’activité est évaluée dans 1x PBS par rapport au sérum humain combiné à 37 °C. La fraction de l’activité initiale retenue pour HsKYNase66-W102H-T333N incubée dans 1x PBS par rapport au sérum humain mélangé au cours de 24 h a été déterminée (barres = moyenne ± écart-type, n = 3). Un test t bilatéral non apparié a été utilisé ; p &lt; 0,001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67216/67216fig06large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
Figure supplémentaire 1 : Courbe standard de l’adénosine et de l’inosine. Le graphique a été dessiné pour 0-200 μM. L’adénosine ou l’inosine a été ajoutée à 1x PBS aux concentrations notées, puis l’absorbance à 260 nm a été mesurée. (n=3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67216/Supplementary%20Figure%201.pdf" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>
Figure supplémentaire 2 : Courbe standard de OH-Kyn. Le graphique a été dessiné pour 0-400 μM. OH-Kyn a été ajouté à 1x PBS aux concentrations notées, puis l’absorbance à 379 nm a été mesurée. (n=3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67216/Supplementary%20Figure%202.pdf" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>
Figure supplémentaire 3 : Courbes d’absorbance en fonction du temps à 260 nm avec des concentrations croissantes de HsADA1 après l’ajout de 200 μM d’adénosine. (A) Courbes de réaction pour diverses concentrations de HsADA1. (B) Variation du pli de la pente de la région linéaire des courbes d’absorbance par rapport à un témoin PBS 1x (barres = moyenne ± SD, n = 3). Un test t bilatéral non apparié a été utilisé **p &lt; 0,01 et ****p &lt; 0,0001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67216/Supplementary%20Figure%203.pdf" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>
Figure supplémentaire 4 : Courbes d’absorbance en fonction du temps à 379 nm avec des concentrations croissantes de HsKYNase modifiée après l’ajout de 400 μM d’OH-Kyn. (A) Courbes de réaction pour diverses concentrations de HsKYNase modifiée. (B) Variation du pli de la pente de la région linéaire des courbes d’absorbance par rapport à un témoin PBS 1x (barres = moyenne ± SD, n = 3). Un test t bilatéral non apparié a été utilisé ****p &lt; 0,0001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67216/Supplementary%20Figure%204.pdf" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>
Figure supplémentaire 5 : Courbes d’absorbance en fonction du temps à 379 nm à l’aide d’une enzyme désactivée par la chaleur dans 400 μM d’OH-Kyn. L’enzyme HsKYNase désactivée par la chaleur a été ajoutée à 400 μM d’OH-Kyn dans 1x PBS, puis l’absorbance à 379 nm a été mesurée. (n=3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67216/Supplementary%20Figure%205.pdf" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>

Détermination de la stabilité sérique de l’enzyme adénosine désaminase 1 humaine

The concept of enzyme stability is typically used to refer to an enzyme's thermostability - its ability to retain structure and activity as temperature ...

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Détection directe de l&#39;activité Acétate de formation de l&#39;acétate kinase Enzyme

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base HPLC-Assay pour surveiller extracellulaires Nucleotide / nucléosidiques Métabolisme dans les chroniques cellules leucémie lymphocytaire humaines

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Permettre une compensation en temps réel dans les oxydations photochimiques rapides des protéines pour la détermination des changements de topographie des protéines

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Découvrez comment évaluer la stabilité sérique d'enzymes pour prédire leur profil pharmacocinétique et leur efficacité thérapeutique. Cette méthode guide l'ingénierie des protéines biologiques.

Détermination de la stabilité sérique de l’enzyme adénosine désaminase 1 humaine

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