Name: Quantification des phénotypes oculaires de Drosophila melanogaster : une approche computationnelle intégrant ilastik et Flynotyper (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-04T14:35:00.000+00:00
Duration: 5 min 25 s
Description: Découvrez une méthode computationnelle combinant ilastik et Flynotyper pour quantifier les phénotypes oculaires de Drosophila melanogaster. Cette approche réduit les biais du classement manuel et améliore la fiabilité des modèles de maladies neurodégénératives.

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<meta charset="utf8"></head><body>Quantification impartiale des ommatidies dans des modèles oculaires de drosophile

<ol><li>Iyer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+assessment+of+eye+phenotypes+for+functional+genetic+studies+using+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22G3%22%5BJournal%5D)">Quantitative assessment of eye phenotypes for functional genetic studies using Drosophila melanogaster.</a> G3. 6 (5), 1427-1437 (2016).</li>
<li>Thomas, B. J., Wassarman, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fly%27s+eye+view+of+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">A fly's eye view of biology.</a> Trends Genet. 15 (5), 184-190 (1999).</li>
<li>Roignant, J. -Y., Treisman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pattern+formation+in+the+Drosophila+eye+disc%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Pattern formation in the Drosophila eye disc.</a> Int J Dev Biol. 53 (5-6), 795-804 (2009).</li>
<li>Diez-Hermano, S., Ganfornina, M. D., Vegas, E., Sanchez, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Machine+learning+representation+of+loss+of+eye+regularity+in+a+Drosophila+neurodegenerative+model%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Machine learning representation of loss of eye regularity in a Drosophila neurodegenerative model.</a> Front Neurosci. 14 (1), 1-14 (2020).</li>
<li>Appocher, C., Klima, R., Feiguin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+screening+in+Drosophila+reveals+the+conserved+role+of+REEP1+in+promoting+stress+resistance+and+preventing+the+formation+of+Tau+aggregates%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Functional screening in Drosophila reveals the conserved role of REEP1 in promoting stress resistance and preventing the formation of Tau aggregates.</a> Hum Mol Genet. 23 (25), 6762-6772 (2014).</li>
<li>Pandey, U. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HDAC6+rescues+neurodegeneration+and+provides+an+essential+link+between+autophagy+and+the+UPS%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">HDAC6 rescues neurodegeneration and provides an essential link between autophagy and the UPS.</a> Nature. 447 (7146), 860-864 (2007).</li>
<li>Outa, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+a+Drosophila+model+of+wild-type+and+T315I+mutated+BCR-ABL1+in+chronic+myeloid+leukemia%3A+an+effective+platform+for+treatment+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Haematologica%22%5BJournal%5D)">Validation of a Drosophila model of wild-type and T315I mutated BCR-ABL1 in chronic myeloid leukemia: an effective platform for treatment screening.</a> Haematologica. 105 (2), 387-397 (2019).</li>
<li>Shirinian, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transgenic+Drosophila+melanogaster+model+to+study+human+T-lymphotropic+virus+oncoprotein+Tax-1-driven+transformation+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">A transgenic Drosophila melanogaster model to study human T-lymphotropic virus oncoprotein Tax-1-driven transformation in vivo.</a> J Virol. 89 (15), 8092-8095 (2015).</li>
<li>Diez-Hermano, S., Valero, J., Rueda, C., Ganfornina, M. D., Sanchez, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+automated+image+analysis+method+to+measure+regularity+in+biological+patterns%3A+a+case+study+in+a+Drosophila+neurodegenerative+model%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Neurodegener%22%5BJournal%5D)">An automated image analysis method to measure regularity in biological patterns: a case study in a Drosophila neurodegenerative model.</a> Mol Neurodegener. 10 (1), 1-10 (2015).</li>
<li>Yusuff, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+models+of+pathogenic+copy-number+variant+genes+show+global+and+non-neuronal+defects+during+development%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Drosophila models of pathogenic copy-number variant genes show global and non-neuronal defects during development.</a> PLoS Genet. 16 (6), e1008792-e1008792 (2020).</li>
<li>Berg, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ilastik%3A+interactive+machine+learning+for+%28bio%29image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">ilastik: interactive machine learning for (bio)image analysis.</a> Nat Methods. 16, 1226-1232 (2019).</li>
<li>Chalmers, M. R., Kim, J., Kim, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eip74EF+is+a+dominant+modifier+for+ALS-FTD-linked+VCPR152H+phenotypes+in+the+Drosophila+eye+model%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Res+Notes%22%5BJournal%5D)">Eip74EF is a dominant modifier for ALS-FTD-linked VCPR152H phenotypes in the Drosophila eye model.</a> BMC Res Notes. 16 (1), 1-5 (2023).</li>
<li>Baek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TDP-43+and+PINK1+mediate+CHCHD10S59L+mutation-induced+defects+in+Drosophila+and+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">TDP-43 and PINK1 mediate CHCHD10S59L mutation-induced defects in Drosophila and in vitro.</a> Nat Commun. 12 (1), 1-20 (2021).</li>
</ol>

<table><tbody><tr>Spécifications <td></td><td></td><td>de l’ordinateur</td><td>Ryzen 5, 16 GB RAM, Nvidia RTX 3070 Super, Windows 10</td></tr><tr><td>Flynotyper</td><td>Iyer, J. et al. (2016)</td><td>Téléchargez le logiciel ici : https://flynotyper.sourceforge.net/imageJ.html</td><td>Logiciel open source. N’utilisez pas Flynotyper 2.0. Au moment de la publication, la version 2.0 était relativement nouvelle et ce protocole est optimisé pour la version originale de Flynotyper.</td></tr><tr><td>ilastik</td><td>Berg, S. et al. (2019)</td><td>Téléchargez le logiciel ici : https://www.ilastik.org/download.html</td><td>Logiciel open source. Téléchargez la version 1.4.0.post1 sous Versions normales correspondant au système d’exploitation de votre ordinateur.</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td></td><td>Téléchargez le logiciel ici : https://imagej.net/ij/download.html</td><td>Logiciel open source. Les versions 1.53 et 1.54 ont été utilisées. La version 1.54 est la version mise à jour et est le téléchargement par défaut.</td></tr><tr><td>Leica Application Suite (LAS X)</td><td>Leica Microsystems</td><td>LASX Office 1.4.6 28433</td><td>Système et logiciel utilisés pour l’acquisition de la pile z.</td></tr><tr><td>Microscope Leica Z16 APO avec caméra DMC2900</td><td>Leica Microsystems</td><td>10 447 173, 12 730 466</td><td>Appelé microscope et caméra Z-stack dans le texte. Ce produit est maintenant archivé.</td></tr></tbody></table>

quantification des phénotypes oculaires de drosophila melanogaster : une approche computationnelle intégrant ilastik et flynotyper

Quantifying Drosophila melanogaster Eye Phenotypes: A Computational Approach Integrating ilastik and Flynotyper

Dans une étude précédente, nous avons utilisé ce protocole pour déterminer les modificateurs génétiques de la protéine VCP mutante liée à la sclérose latérale amyotrophique avec démence frontotemporale (ALS-FTD)12. De plus, cette méthode a également été utilisée dans un autre article pour évaluer la toxicité de CHCHD10 ALS-FTD médiée parS59L, même lors de l’utilisation d’un stéréomicroscope plus ancien13. Pour valider davantage ces résultats, nous avons utilisé ilastik et Flynotyper dans la même mutation de la maladie ALS-FTD que Baek et al.13 ; Cependant, un personnel de laboratoire non formé a réalisé l’expérience et a obtenu des résultats similaires. Ainsi, la combinaison d’ilastik et de Flynotyper est une méthode robuste pour évaluer de manière impartiale la dégénérescence de la drosophile ommatidie.
Nous privilégions l’utilisation d’une lampe annulaire car elle permet de meilleures évaluations qualitatives (Figure 3). Cependant, l’utilisation d’une lumière annulaire provoque une ombre que Flynotyper ne peut pas analyser directement. Pour pallier cela, nous avons prétraité les images dans ilastik avant de quantifier les P-Scores avec Flynotyper. Dans l’ensemble, les scores P de l’œil de mouche non dégénéré (GMR-GAL4) étaient significativement plus faibles que ceux d’un œil modérément dégénéré (2x_S81L) et d’un œil gravement dégénéré (3x_S81L) (Figure 4A, B et Tableau 1). C’est le résultat attendu, car des P-Scores plus élevés générés par Flynotyper indiquent un œil plus dégénéré1. Lorsque l’ilastik n’a pas été utilisé, il y avait des différences négligeables dans les scores P entre un œil non dégénéré et un œil modérément dégénéré (figure 4C et tableau 1). Cela suggère que Flynotyper a du mal à identifier avec précision les motifs d’ommatidies dans des conditions de lumière annulaire sans utiliser d’ilastik. En effet, Flynotyper est conçu pour utiliser des images prises avec une lumière à double point qui est convertie en niveaux de gris avec des ajustements supplémentaires pour identifier le centre ommatidien1. Ilastik reproduit ce processus en incorporant un point au centre de chaque ommatidium, ce qui permet la quantification au sein de Flynotyper.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67219/67219fig01.jpg"> Figure 1 : Exemple de flux de travail ilastik. (A) Création d’un nouveau projet dans ilastik. (B) Choix de l’image standard. (C) Sélection des valeurs sigma sous Sélection de caractéristiques. (D) Marquage du premier plan des ommatidies pour la sensibilité. (E) Marquage de l’arrière-plan des ommatidies pour la sensibilité. (F) Sélection de la façon dont le logiciel exportera les fichiers traités. (G) Choisir les images expérimentales d’yeux de mouche à analyser. (H) Montrer quelles images expérimentales d’yeux de mouche seront analysées. (I) Produit fini après l’exécution du logiciel. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67219/67219fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67219/67219fig02.jpg"> Figure 2 : Exemple de flux de travail Flynotyper. (A) Sélection uniquement de l’œil de la mouche pour une analyse plus approfondie. (B) Ouverture de l’image de l’œil coupé dans une nouvelle fenêtre. (C) Sélection des images coupées à analyser et des paramètres à vérifier pour l’analyse. (D) Exemples de résultats. Les scores phénotypiques sont présentés à l’extrême droite. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67219/67219fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67219/67219fig03.jpg"> Figure 3 : Images qualitatives de l’œil de la drosophile. Le même œil de mouche pris avec une lumière annulaire (à gauche) et pris avec une lumière à double point (à droite) dans des conditions non dégénérées (en haut) et dégénérées (en bas). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67219/67219fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67219/67219fig04.jpg"> Figure 4 : Utilisation d’ilastik avant Flynotyper pour une quantification précise du phénotype de l’œil rugueux chez la drosophile. (A) Images représentatives de l’œil de la drosophile d’un œil non dégénéré (GMR-GAL4), d’un œil modérément dégénéré (2x_S81L) et d’un œil sévèrement dégénéré (3x_S81L). (B) Résultats de quantification de Flynotyper après l’utilisation d’ilastik. Les valeurs p d’un test t de permutation bilatéral ont été calculées pour faciliter l’interprétation des résultats (GMR-GAL4 vs 2x_S81L : p = 0, GMR-GAL4 vs 3x_S81L : p = 0) (C) Résultats de quantification de Flynotyper sans utiliser d’ilastik. Les valeurs p d’un test t de permutation bilatéral ont été calculées pour faciliter l’interprétation des résultats (GMR-GAL4 vs 2x_S81L : p = 0,597, GMR-GAL4 vs 3x_S81L : p = 0,687). N = 3 pour chaque groupe. Les points de données sont secoués ou empilés sur l’axe des x pour plus de clarté visuelle. La ligne horizontale continue représente la moyenne. Les barres d’erreur représentent l’écart-type. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67219/67219fig04large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="2">GMR-GAL4</td>
			<td colspan="2">2x_S81L</td>
			<td colspan="2">3x_S81L</td>
		</tr><tr><td>Avec ilastik</td>
			<td>Sans ilastik</td>
			<td>Avec ilastik</td>
			<td>Sans ilastik</td>
			<td>Avec ilastik</td>
			<td>Sans ilastik</td>
		</tr><tr><td>26.7</td>
			<td>55.7</td>
			<td>52.5</td>
			<td>51.2</td>
			<td>59.9</td>
			<td>55.6</td>
		</tr><tr><td>17.4</td>
			<td>53.5</td>
			<td>50</td>
			<td>54.9</td>
			<td>60.7</td>
			<td>52</td>
		</tr><tr><td>22.8</td>
			<td>55.5</td>
			<td>56.8</td>
			<td>55.2</td>
			<td>60.1</td>
			<td>55.1</td>
		</tr></tbody></table>Tableau 1 : Scores P lors de l’utilisation de Flynotyper avec ilastik et lors de l’utilisation de Flynotyper seul. 
Figure supplémentaire S1 : Support de tête de mouche configuré pour l’acquisition d’images. Voici un exemple de configuration pour l’acquisition d’images à l’aide de plusieurs feuilles de papier. Cependant, toute méthode qui assure une bonne orientation de la tête et de l’œil de la mouche peut être utilisée. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67219/Publication%20JoVE%20Sup%20Fig%201.pdf" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>
Figure supplémentaire S2 : Résultats quantitatifs d’ilastik et de Flynotyper lors de l’utilisation d’une valeur sigma de 2,5 sous sélection de caractéristiques. L’utilisation d’une valeur sigma autre que 5,0 sous la sélection de caractéristiques dans ilastik peut entraîner une quantification inexacte. Plus précisément, une valeur sigma de 2,5 entraîne une perte de sensibilité. Les valeurs p d’un test t de permutation bilatéral ont été calculées pour faciliter l’interprétation des résultats (GMR-GAL4 vs 2x_S81L : p = 0,192, GMR-GAL4 vs 3x_S81L : p = 0). N = 3 pour chaque groupe. Les points de données sont secoués ou empilés sur l’axe des x pour plus de clarté visuelle. La ligne horizontale continue représente la moyenne. Les barres d’erreur représentent l’écart-type. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67219/Publication%20JoVE%20Sup%20Fig%202.pdf" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>
Figure supplémentaire S3 : Perte de sensibilité et scores P imprécis dus à des plaques nécrotiques. Des flèches blanches pointent vers des segments de plaques nécrotiques. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67219/Publication%20JoVE%20Sup%20Fig%203.pdf" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>
Tableau supplémentaire S1 : P-Scores lors de l’utilisation d’une valeur sigma de 2,5 sous la sélection de caractéristiques. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67219/67219_Supp%20Table%201.zip" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>

Quantification des phénotypes oculaires de Drosophila melanogaster : une approche computationnelle intégrant ilastik et Flynotyper

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