Quantification des leucocytes adhérents induits par le diabète dans le système vasculaire rétinien

L’objectif de la recherche dans notre laboratoire est d’apprendre ce qui cause la rétinopathie dans le diabète et comment elle peut être évitée. Plusieurs laboratoires ont montré que la leucostase, la suraccumulation de globules blancs, dans les petits vaisseaux de l’œil augmente le diabète. Et cela pourrait contribuer à l’occlusion et à la dégénérescence des vaisseaux de la rétine dans le diabète. Cette technique permet de visualiser et de quantifier la sévérité de la leucostase dans le système vasculaire rétinien. Et il peut être utilisé dans les études qui veulent évaluer l’efficacité de différentes thérapies, y compris les médicaments.

[Instructeur] Pour installer l’infuseur à pression, connectez en série le sac de solution saline à 0,9 %. le jeu de cathéter intraveineux, une valve à quatre voies et l’aiguille de gavage. Ouvrez le système de perfusion et rincez les conduites et les orifices avec une solution saline pendant deux minutes à un débit de 18 à 20 millilitres par minute pour éliminer les bulles d’air. Placez la souris anesthésiée en décubitus dorsal sur la scène de perfusion. Identifiez visuellement le processus xiphoïde. Avec l’hémostat dans la main dominante, fixez et verrouillez la peau. Transférez ensuite l’hémostat dans la main non dominante et soulevez la peau. Ensuite, à l’aide de ciseaux, coupez une partie de la peau à un angle de 90 degrés par rapport à la colonne vertébrale pour exposer la paroi abdominale externe. Avec l’apophyse xiphoïde et la cage thoracique visibles, disséquez bilatéralement à travers la paroi abdominale, en évitant soigneusement tout organe ou vaisseau majeur. Maintenant, visualisez le cœur, les ventricules et les poumons à travers le diaphragme. À l’aide de la pointe des ciseaux, faites une incision dans le diaphragme d’un côté près de la colonne vertébrale. Exposez le cœur dans la cavité thoracique après avoir coupé le sternum en deux. Avec une pince dans la main non dominante, saisissez le cœur près de son apex. À l’aide de la main dominante, tenez l’aiguille de gavage attachée au cathéter intraveineux et perforez l’apex du cœur. Assurez-vous que la pointe de la bille de l’aiguille du gavage dépasse légèrement du site de ponction pour éviter de perforer complètement le ventricule gauche ou de pénétrer dans le système vasculaire pulmonaire. Ensuite, ouvrez le robinet d’arrêt pour permettre l’écoulement de 0,9 % de solution saline. Simultanément, utilisez des ciseaux pour ouvrir l’oreillette droite. Continuez la perfusion pendant deux à trois minutes, en déplaçant doucement l’aiguille d’un côté à l’autre et de haut en bas pour éviter le pliage vasculaire et augmenter le drainage sanguin du cœur. Après la perfusion, tournez la poignée du robinet d’arrêt pour couper l’écoulement de la solution saline et permettre l’écoulement de la seringue vers l’aiguille du gavage. Ensuite, perfuser manuellement 10 millilitres de solution de concanavaline A en 30 à 35 secondes. Après avoir perfusé le cœur d’une souris anesthésiée avec la solution de concanavaline A, tournez la souris sur le côté. Placez l’index de la main non dominante sur la paupière supérieure et le pouce sur la paupière inférieure. Rétractez doucement les paupières et la peau environnante pour étaler l’œil, lui permettant de sortir partiellement de l’orbite. Ensuite, à l’aide des ciseaux incurvés dans la main dominante, ramassez sous l’œil à un angle de 45 degrés. Coupez les attaches musculaires et le nerf optique. À l’aide des ciseaux comme d’une spatule, transférez l’œil dans un petit récipient. Placez l’œil sur la cire dentaire pour préparer l’ouverture du globe. Sous le microscope de dissection, à l’aide de micro-pinces, tenez le pli scléral ou les restes musculaires attachés à la partie postérieure de l’œil et orientez l’œil de manière à ce que la cornée soit tournée d’un côté. Faites une incision derrière et parallèlement au limbe. Utilisez des micro-ciseaux pour séparer le segment antérieur de l’œil, y compris le cristallin autour du périmètre de l’œilleton, en veillant à ce que la rétine soit complètement détachée de la sclère. Retirez la rétine de la sclérotique à l’aide de la microspatule. Si la rétine est toujours attachée par le nerf optique, insérez des micro-ciseaux entre la rétine et la sclérotique pour sectionner le nerf optique. Placez la rétine non fixée sur une lame avec une goutte de PBS. Faites quatre à cinq coupes radiales dans la rétine, créant un motif de feuille de trèfle de sorte qu’elle repose à plat. Observez la rétine montée à plat au microscope à un grossissement de 100x à l’aide d’un objectif de 10x. La microscopie à fluorescence du système vasculaire rétinien a montré que les rétines diabétiques présentaient une leucostase légère avec généralement 3 à 12 leucocytes par rétine contre 1 à 3 chez les témoins non diabétiques. Des amas de leucocytes significatifs ont été observés dans des modèles inflammatoires défiés par des lipopolysaccharides, contrairement à l’agrégation légère dans les échantillons de diabétiques.