Flux de travail de biofabrication évolutif pour produire et isoler des produits biothérapeutiques anticancéreux extracellulaires dérivés de cellules tueuses naturelles

Notre recherche porte sur de petites vésicules produites par un type de cellules immunitaires qui sont naturellement efficaces pour tuer les cellules cancéreuses. Ces vésicules présentent un potentiel thérapeutique prometteur pour le traitement des tumeurs solides, tant au niveau des sites primaires que secondaires tels que le cerveau. Dans cette étude, nous utilisons une résine bimodale pour isoler les vésicules par chromatographie d’exclusion stérique, maximisant ainsi la pureté du produit en séparant physiquement les vésicules des contaminants tout en piégeant davantage les contaminants dans la résine par des forces électrostatiques.

Ensuite, nous stérilisons, concentrons et échangeons les vésicules avant de les utiliser. Les détails du flux de travail de biofabrication dans cette vidéo utilisent des conditions cliniquement pertinentes et sont évolutifs en termes de coûts, produisant efficacement de grandes quantités de vésicules extracellulaires de haute pureté. Cela rend la technique accessible aux laboratoires universitaires pour investir en toute confiance des ressources dans l’étude de ces thérapies avec un processus de production et d’isolement fiable. Nous étudions actuellement le potentiel thérapeutique de ces vésicules et de ces modèles précliniques et renforçons notre compréhension de leur fonctionnement.

Pour commencer, effectuez l’amorce du système de chromatographie liquide rapide des protéines conformément aux instructions du fabricant. Effectuez les connexions à l’aide de la méthode goutte à goutte pour vous assurer qu’aucun air n’est introduit à l’intérieur de la colonne. Installez le collecteur de fractions avec des tubes de collecte appropriés pour collecter les échantillons.

Modifiez les paramètres de fractionnement en fonction du volume de collecte souhaité. Retirez 40 à 80 millilitres de vésicule extracellulaire préalablement préparée ou de milieu conditionné riche en VE du congélateur à 80 degrés Celsius et décongelez rapidement à 37 degrés Celsius. Faites tourner l’échantillon à 10 000 G pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius et transférez le surnageant dans un nouveau tube.

Pour réduire les niveaux d’ADN double brin, traitez le milieu conditionné riche en EV avec cinq millimoles de chlorure de magnésium et 50 unités par millilitre d’endonucléase. Incuber l’échantillon pendant deux à quatre heures à 37 degrés Celsius avec un mélange modéré. Une fois que le système de chromatographie est prêt, chargez le milieu conditionné riche en EV dans une seringue de 60 millilitres et connectez-le à la ligne d’échantillonnage.

Cliquez sur Exécution manuelle pour démarrer le système et régler le débit sur zéro. Suivez les instructions du logiciel pour enregistrer l’exécution de manière préventive. Cliquez ensuite sur Démarrer.

Sélectionnez le PBS à double filtre à battement de ligne et exécutez à une vitesse d’écoulement de deux millilitres par minute, en veillant à ce que la solution traverse la colonne. Une fois que l’absorbant s’est stabilisé, appuyez sur Auto Zero UV. Modifiez la trajectoire d’écoulement pour diriger l’échantillon vers la bouteille de déchets avant la colonne. Après cinq à 20 secondes, dirigez l’échantillon vers la colonne.

Une fois que les lectures UV atteignent environ 230 unités de milliabsorbance, cliquez sur Fractionnement. Une fois l’injection de l’échantillon terminée, basculez le système tampon sur le PBS à double filtre pour poursuivre la purification. Lorsque la valeur UV atteint environ 1 600 unités de milliabsorbance, cliquez à nouveau sur Fractionnement.

Une fois le cycle terminé, enregistrez le chromatogramme en tant que document PDF. Rincez chaque composant de l’appareil d’ultrafiltration avec 20 à 30 millilitres d’éthanol à 90 %. Faites tourner à 4 000 g pendant cinq à 10 minutes et jetez le flux.

Effectuez ensuite le rinçage avec du PBS stérile pour équilibrer l’appareil et répétez les étapes de centrifugation comme précédemment. Combinez toutes les fractions diluées de NK-EV. Pour maximiser la stérilité, filtrez la solution diluée de NK-EV à l’aide d’un filtre à seringue de 0,22 micromètre, pré-humidifié avec du PBS à double filtre.

Recueillir le filtrat dans l’appareil de concentration stérilisé. Faites tourner le filtrat à 4 000 G pendant 15 à 40 minutes. Après l’essorage, mélangez la solution dans le compartiment supérieur du filtre à l’aide d’une pipette sérologique.

Encore une fois, tournez à 4 000 G pendant 10 minutes. Renversez le dispositif de filtration et fixez-le au dispositif de collecte pour collecter le NK-EV. Faites tourner le NK-EV à 2 000 G pendant deux minutes et transférez le produit purifié dans un tube stérile.

Lancer le système d’analyse de suivi des nanoparticules selon les instructions du fabricant. Observez la cellule d’écoulement pour les bulles d’air. Si une bulle d’air est présente, retirez-la en rinçant la cellule d’écoulement avec de l’éthanol à 20 % et de l’eau doublement filtrée.

Une fois dégagé, réinsérez soigneusement le module laser dans l’instrument d’analyse de suivi des nanoparticules. Fermez la porte et cliquez sur Démarrer l’appareil photo. Modifiez les paramètres de capture pour un gain d’écran de deux et un niveau de caméra de 14.

Allumez le chauffage pour stabiliser la température de la cellule d’écoulement. Cliquez sur Mesure standard pour créer un script sous l’onglet SOP afin de collecter une capture sur une minute à un débit de 30 à 23 degrés Celsius. Ajoutez le nom du dossier et du fichier au nom du chemin d’accès pour enregistrer les données.

Vortex le produit NK-EV purifié et préparer leur dilution à l’aide de PBS doublement filtré. Après avoir vortex l’échantillon dilué, chargez-le dans la seringue d’acquisition de 1 millilitre sans introduire de bulles d’air. Connectez soigneusement la seringue à la ligne de chargement de l’instrument.

Poussez lentement la moitié de l’échantillon, en laissant environ 0,5 millilitre dans la seringue. Une fois que les particules sont visibles à l’écran, faites la mise au point de la caméra pour avoir un maximum d’un halo autour de chaque particule, Sous l’onglet Matériel, cliquez sur Infuser et réglez un taux de 1 000 pendant cinq secondes. Ensuite, ramenez le taux à 30.

Appuyez sur Exécuter le script. Après vous être assuré que les paramètres sont corrects, cliquez sur Oui et suivez les instructions du logiciel. Une fois la capture terminée, cliquez sur Annuler lorsque le logiciel vous demande de traiter ou d’exporter des fichiers.

Après avoir enregistré cinq captures par dilution, importez les cinq captures pour analyse. Mettez les fichiers en surbrillance et cliquez sur Traiter les fichiers sélectionnés. Sous l’onglet Processus, ajustez les paramètres d’analyse sur un gain d’écran de deux et un seuil de détection de 15.

Cochez et cliquez sur OK pour l’analyse. Après le traitement, cliquez sur Oui sans cliquer sur des cases supplémentaires ou cliquez sur Exporter pour exporter les fichiers. La taille des particules de NK-EV purifiées variait de 76,30 à 174,30 nanomètres avec une concentration moyenne de 1,39 fois 10 à la puissance de 12 VE par millilitre.

De plus, la quantification par fluorimètre a montré une concentration en protéines d’environ 300 milligrammes par millilitre et une concentration d’ADN double brin de 225 milligrammes par millilitre. Le traitement des cellules leucémiques humaines K562 avec des NK-EV a montré une diminution dose-dépendante de la viabilité cellulaire avec une EC 50 de 9,33 fois 10 à la puissance neuf VE par millilitre.