Name: Mise en place d’un tri réussi pour l’isolement des vésicules extracellulaires (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-11T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: Découvrez le tri des vésicules extracellulaires dérivées de cellules stromales mésenchymateuses pour la régénération tissulaire. Ce protocole optimise les paramètres instrumentaux pour isoler des EV de haute pureté.

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<meta charset="utf8"></head><body>Tri par fluorescence de vésicules extracellulaires dérivées du tissu adipeux

<ol><li>Welsh, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+%28misev2023%29%3A+From+basic+to+advanced+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22J+Extracell+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Minimal information for studies of extracellular vesicles (misev2023): From basic to advanced approaches.</a> J Extracell Vesicles. 13 (2), e12404(2024).</li>
<li>Xu, R., Greening, D. W., Zhu, H. J., Takahashi, N., Simpson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicle+isolation+and+characterization%3A+Toward+clinical+application%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicle isolation and characterization: Toward clinical application.</a> J Clin Invest. 126 (4), 1152-1162 (2016).</li>
<li>Dixson, A. C., Dawson, T. R., Di Vizio, D., Weaver, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Context-specific+regulation+of+extracellular+vesicle+biogenesis+and+cargo+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Context-specific regulation of extracellular vesicle biogenesis and cargo selection.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 24 (7), 454-476 (2023).</li>
<li>Witwer, K. W., Wolfram, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles+versus+synthetic+nanoparticles+for+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mater%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles versus synthetic nanoparticles for drug delivery.</a> Nat Rev Mater. 6 (2), 103-106 (2021).</li>
<li>Cheng, L., Hill, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutically+harnessing+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Therapeutically harnessing extracellular vesicles.</a> Nat Rev Drug Discov. 21 (5), 379-399 (2022).</li>
<li>Du, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles%3A+A+rising+star+for+therapeutics+and+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nanobiotechnology%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles: A rising star for therapeutics and drug delivery.</a> J Nanobiotechnology. 21 (1), 231(2023).</li>
<li>Keshtkar, S., Azarpira, N., Ghahremani, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cell-derived+extracellular+vesicles%3A+Novel+frontiers+in+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles: Novel frontiers in regenerative medicine.</a> Stem Cell Res Ther. 9 (1), 63(2018).</li>
<li>Orbay, H., Tobita, M., Mizuno, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+isolated+from+adipose+and+other+tissues%3A+Basic+biological+properties+and+clinical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Int%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells isolated from adipose and other tissues: Basic biological properties and clinical applications.</a> Stem Cells Int. 2012, 461718(2012).</li>
<li>Caplan, A. I., Dennis, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+as+trophic+mediators%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biochem%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells as trophic mediators.</a> J Cell Biochem. 98 (5), 1076-1084 (2006).</li>
<li>Rani, S., Ryan, A. E., Griffin, M. D., Ritter, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cell-derived+extracellular+vesicles%3A+Toward+cell-free+therapeutic+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles: Toward cell-free therapeutic applications.</a> Mol Ther. 23 (5), 812-823 (2015).</li>
<li>Galipeau, J., Sensébé, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stromal+cells%3A+Clinical+challenges+and+therapeutic+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stromal cells: Clinical challenges and therapeutic opportunities.</a> Cell Stem Cell. 22 (6), 824-833 (2018).</li>
<li>Jia, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+extracellular+vesicles+isolation+and+separation%3A+Current+techniques%2C+pending+questions+and+clinical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">Small extracellular vesicles isolation and separation: Current techniques, pending questions and clinical applications.</a> Theranostics. 12 (15), 6548-6575 (2022).</li>
<li>Ohnuma, K., Yomo, T., Asashima, M., Kaneko, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sorting+of+cells+of+the+same+size%2C+shape%2C+and+cell+cycle+stage+for+a+single+cell+level+assay+without+staining%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Sorting of cells of the same size, shape, and cell cycle stage for a single cell level assay without staining.</a> BMC Cell Biol. 7, 25(2006).</li>
<li>Morales-Kastresana, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-fidelity+detection+and+sorting+of+nanoscale+vesicles+in+viral+disease+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Extracell+Vesicles%22%5BJournal%5D)">High-fidelity detection and sorting of nanoscale vesicles in viral disease and cancer.</a> J Extracell Vesicles. 8 (1), 1597603(2019).</li>
<li>Mortati, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+study+of+extracellular+vesicles+migration+in+cartilage-derived+osteoarthritis+samples+using+real-time+quantitative+multimodal+nonlinear+optics+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">In vitro study of extracellular vesicles migration in cartilage-derived osteoarthritis samples using real-time quantitative multimodal nonlinear optics imaging.</a> Pharmaceutics. 12 (8), 734(2020).</li>
<li>Andreu, Z., Yanez-Mo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tetraspanins+in+extracellular+vesicle+formation+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Tetraspanins in extracellular vesicle formation and function.</a> Front Immunol. 5, 442(2014).</li>
<li>Mildmay-White, A., Khan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+surface+markers+on+adipose-derived+stem+cells%3A+A+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Stem+Cell+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">Cell surface markers on adipose-derived stem cells: A systematic review.</a> Curr Stem Cell Res Ther. 12 (6), 484-492 (2017).</li>
<li>Welsh, J. A., Tang, V. A., Van Der Pol, E., Gorgens, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MIFlowCyt-EV%3A+The+next+chapter+in+the+reporting+and+reliability+of+single+extracellular+vesicle+flow+cytometry+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">MIFlowCyt-EV: The next chapter in the reporting and reliability of single extracellular vesicle flow cytometry experiments.</a> Cytometry A. 99 (4), 365-368 (2021).</li>
<li>Maia, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Employing+flow+cytometry+to+extracellular+vesicles+sample+microvolume+analysis+and+quality+control%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Employing flow cytometry to extracellular vesicles sample microvolume analysis and quality control.</a> Front Cell Dev Biol. 8, 593750(2020).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Diacétate de 5(6)-carboxyfluorescéine&nbsp ; N-succinimidyl ester</td><td>Merck</td><td>150347-59-4</td><td></td></tr><tr><td>Cellules stromales mésenchymateuses adipeuses</td><td>Wepredic, Parc d’affaires, 35760 Saint-Græacute ; goire, France</td><td></td><td>Cellules utilisées dans cette étude</td></tr><tr><td>Alexa 488 anti-cavéoline</td><td>R& D Systems</td><td>IC5736G</td><td>Anticorps de cytométrie en flux</td></tr><tr><td>APC anti-humain CD44</td><td>BioLegend</td><td>338805</td><td>Anticorps de cytométrie en flux</td></tr><tr><td>APC anti-humain CD63</td><td>BioLegend</td><td>353007</td><td>Anticorps de cytométrie en flux</td></tr><tr><td>APC anti-humain CD81 (TAPA-1)</td><td>BioLegend</td><td>349509</td><td>Anticorps de cytométrie en flux</td></tr><tr><td>APC anti-humain CD9</td><td>BioLegend</td><td>312107</td><td>Cytométrie en flux anticorps</td></tr><tr><td>BC CytoFLEX S</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>BC CytoFLEX S équipé de 3 lasers, Bleu, Rouge et Violet</td></tr><tr><td>Flow-Check Pro Fluorospheres</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63493</td><td>Billes de contrôle fluorescentes pour MoFLO Astrios EQ</td></tr><tr><td>Logiciel FlowJo (version 10.8.1)</td><td>BD</td><td>version 10.8.1</td><td>Logiciel d’analyse</td></tr><tr><td>IntraSure kit</td><td>BD Biosciences</td><td>641776</td><td>Fixation et perméabilisation pour la coloration intracellulaire Billes de</td></tr><tr>polystyrène<td>Megamix-Plus FSC</td><td>BioCytex</td><td>7802</td><td>FSC&nbsp ;</td></tr><tr><td>MoFLO Astrios EQ</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>MoFLO Astrios EQ équipé de 4 lasers, Bleu, Jaune - Vert, Violet et Rouge</td></tr><tr><td>Souris anticorps anti-FLOT1</td><td>BD Transduction Laboratories</td><td>610820</td><td>Anticorps Western Blot</td></tr><tr><td>NanoSight NS300</td><td>Malvern</td><td>NS300</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps anti-Calnexin Origene</td><td></td><td>TA336279</td><td>Western Blot</td></tr><tr><td>Anticorps anti-CD9 et CD81 chez le lapin (kit d’anticorps ExoAb)</td><td>System Biosciences</td><td>EXOAB-KIT-1</td><td>Anticorps Western Blot</td></tr><tr><td>Anticorps anti-TSG101 chez le lapin&nbsp ;</td><td>Anticorps Merck</td><td>HPA006161</td><td>Western Blot</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Merck</td><td>9036-19-5</td><td></td></tr><tr><td>Ultra Rainbow Fluorescent Particles</td><td>Spherotech</td><td>URFP-30-2</td><td></td></tr><tr><td>Ultracel 100 kDa MWCO</td><td>Merck</td><td>UFC910024</td><td></td></tr><tr><td>VER01 - Verity Shells</td><td>Exometry</td><td></td><td>Organo billes de silice pour l’étalonnage de la diffusion</td></tr></tbody></table>

mise en place d’un tri réussi pour l’isolement des vésicules extracellulaires

Setting a Successful Sorting for Extracellular Vesicle Isolation

Les billes de polystyrène FSC ont été triées pour valider la configuration de l’instrument et les conditions de tri. Les billes de polystyrène FSC sont un mélange de billes fluorescentes allant de 100 nm, 300 nm, 500 nm et 900 nm et sont visibles sur le canal FITC. La figure 7A montre le diagramme logarithmique de la SSC par rapport au diagramme logarithmique de la FITC avec les quatre populations de billes avant le tri. Les populations fluorescentes de 100 nm, 300 nm et 500 nm ont été contrôlées et triées. La pureté et l’enrichissement des billes triées ont été analysées à titre de preuve de concept initiale (figure 7B). Toutes les populations étaient pures après tri. Le bruit de fond de référence est toujours visible dans les diagrammes à points avant et après le tri.
Afin de répondre aux exigences énumérées dans MISEV2018/2023 et de démontrer la nature des vésicules et leur degré de pureté, des expériences ont été menées pour analyser les marqueurs présents ou absents sur les VE. Les VE sont positifs pour certains marqueurs de surface spécifiques15 : CD9, CD63, CD81 et CD44. CD9, CD63 et CD81 appartiennent à la famille des protéines membranaires tétraspanines et sont les marqueurs les plus courants pour identifier les exosomes16. CD44 est un marqueur fortement exprimé par les CSM et les CSA17.
Les VE sont également positives pour la protéine cytosolique cavéoline, comme l’a démontré l’expérience de cytométrie en flux intracellulaire. De plus, le western blot confirme la positivité pour CD9, CD81, TSG101, Flotillin et la négativité pour Calnexin (Figure 2).
Ensuite, les ASC-EV étiquetés CFSE ont été triés comme indiqué dans le protocole. Cette procédure de tri a été répétée quatre fois, en maintenant exactement les mêmes conditions pour la préparation, la coloration et le tri des échantillons (tableau 1). De cette façon, la répétabilité du protocole a été démontrée.
Une série d’expériences a été réalisée afin d’analyser la population d’ASC-EV triés par CFSE et de démontrer que leurs caractéristiques n’ont pas changé par le tri. En particulier, l’expression de CD9, CD63, CD81 et CD44 ne change pas après le tri (Figure 6A).
Un autre point critique concerne les dimensions des VE et la façon dont ils peuvent changer après la procédure de tri en raison de la contrainte induite par la pression. L’analyse post-tri a été difficile à effectuer en raison de la petite quantité d’échantillon, mais l’analyse de suivi des nanoparticules démontre que la distribution des deux échantillons ASC-EVs (pré et post tri) était la même (Figure 6B). Enfin, l’analyse des VE par TEM démontre que leur morphologie ne semble pas significativement altérée suite au tri (Figure 6C).
Il convient de noter que, comme le suggèrent les lignes directrices du cadre MIFlowCyt-EV18, une réduction de la quantité de VE positives au CFSE après le traitement d’un échantillon de Triton X-100 à 0,1 % a été observée, ce qui soutient leur origine vésiculaire (figure 8).
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67232/67232fig07.jpg"> 
Figure 7 : Tri des billes de polystyrène FSC. (A) Diagramme à points SSC/FITC des billes avant le tri. Diagramme à points SSC/FITC des billes réanalysées après le tri : (B) billes triées de 100 nm, (C) billes triées de 300 nm et (D) billes triées de 500 nm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67232/67232fig07large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67232/67232fig08.jpg"> 
Figure 8 : Dégradation de la membrane EV en présence de Triton X-100. Triton X-100 à la concentration de 0,1 % a été ajouté à l’échantillon pendant 15 min à température ambiante. Des diagrammes de dispersion représentatifs de trois expériences indépendantes d’échantillons non traités (à gauche) et traités (à droite) sont présentés. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67232/67232fig08large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Expérience</td>
			<td>Nombre de VE triés</td>
			<td>Nombre de VE triés par CFSE+</td>
			<td>Pression (psi)</td>
			<td>Buse mm</td>
			<td>Fréquence (Hz)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td>74 x 106</td>
			<td>4,8 x 106</td>
			<td>35</td>
			<td>70</td>
			<td>66000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2</td>
			<td>44 x 106</td>
			<td>7 x 106</td>
			<td>35</td>
			<td>70</td>
			<td>66000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3</td>
			<td>38 x 106</td>
			<td>3 x 106</td>
			<td>35</td>
			<td>70</td>
			<td>66000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4</td>
			<td>16 x 106</td>
			<td>2 x 106</td>
			<td>35</td>
			<td>70</td>
			<td>66000</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tableau 1 : Répétabilité de la procédure de tri

Mise en place d’un tri réussi pour l’isolement des vésicules extracellulaires

Extracellular vesicles (EVs) released by mesenchymal stromal cells (MSCs) contain a set of microRNAs with regenerative and anti-inflammatory roles. ...

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Recherche

JoVE Journal

Biology

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