Isolement et caractérisation d’exosomes dérivés de tissus de rate de souris
20 septembre 2024
Ici, nous présentons un protocole pour isoler les exosomes dérivés de la rate de souris en utilisant une combinaison de digestion avec de la collagénase de type I et d’ultracentrifugation.
Les exosomes dérivés des tissus ont attiré de plus en plus d’attention en raison de leur capacité à refléter avec précision la spécificité des tissus et le microenvironnement. Notre recherche s’est concentrée sur la compréhension des rôles fondamentaux et translationnels des exosomes dérivés de la rate dans les maladies cardiovasculaires. Dans cette étude, nous développons un protocole pratique pour isoler les exosomes des tissus de la rate de souris, fournissant une technique reproductible pour l’analyse d’identification ultérieure et les études fonctionnelles.
Nous utilisons une collagénase de type I pour la digestion, suivie d’une filtration par ultracentrifugation différentielle pour produire un exosome de rate de haute qualité. Contrairement aux rapports précédents, en utilisant l’homogénéisation tissulaire pour obtenir une suspension tissulaire, notre approche préserve l’intégrité membranaire des cellules dans les tissus. Cette technique pourrait être particulièrement utile pour étudier le rôle des exosomes dans les réponses immunitaires.
Compte tenu de la fonction critique de la rate dans le système immunitaire, des études futures pourraient adapter ce protocole aux tissus humains, permettant l’extraction d’exosomes cliniquement pertinents à des fins diagnostiques et thérapeutiques. Pour commencer, prérefroidissez les centrifugeuses à grande vitesse et à ultra-haute vitesse à quatre degrés Celsius et réglez la température de l’agitateur de bureau à 37 degrés Celsius. Préparez les boîtes de culture cellulaire d’un diamètre de 100 millimètres.
Ensuite, disposez des tubes à centrifuger stériles de 50 millilitres, de la glace et des crépines de cellules stériles d’un diamètre de 70 micromètres. Vaporisez de l’alcool à 75 % pour stériliser les ciseaux et les pinces et chauffez-les à haute température pour stériliser davantage. Ensuite, placez le tissu de la rate dans une boîte de Pétri stérile de 100 millimètres sur de la glace et lavez le sang de surface avec du PBS 1X froid.
Séchez soigneusement la rate avec de la gaze stérile avant de peser les tissus. Ensuite, à l’aide d’une pipette de transfert stérile, ajoutez un millilitre de PBS dans une crépine de cellules de 70 micromètres pour l’humidifier. Enfin, préparez 0,1 % de collagénase de type I dans 1X PBS avec un mélangeur vortex pour obtenir le tampon de digestion.
Pour commencer, préparez les réactifs et les outils stériles pour le traitement des tissus. À l’aide de ciseaux, coupez le tissu de la rate en petits morceaux uniformes dans une boîte de culture sur de la glace et transférez-les dans un tube à centrifuger de 50 millilitres à l’aide d’une pipette de transfert stérile. Ensuite, ajoutez le tampon de digestion dans le tube en fonction du poids du tissu de la rate et secouez le tube à un angle de 45 degrés sur un agitateur horizontal réglé à 37 degrés Celsius.
Arrêtez la digestion lorsque les morceaux de tissu se sont dispersés et que la plupart des morceaux ont perdu leur forme. Transférez le mélange digéré à travers une passoire à cellules de 70 micromètres à température ambiante pour éliminer les débris tissulaires fibreux et plus gros. Recueillir le filtrat dans un nouveau tube à centrifuger de 50 millilitres.
Centrifuger le filtrat à 500 G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Ensuite, transférez le surnageant dans un nouveau tube et répétez l’étape de centrifugation à des vitesses appropriées. Après l’ultracentrifugation, jetez le surnageant et lavez la pastille avec du PBS.
Ultracentrifugeuse à nouveau à 120 000 G pendant deux heures à quatre degrés Celsius pour isoler les exosomes. Enfin, dissolvez les exosomes isolés dans 200 microlitres de PBS stérile par rate et stockez-les dans un tube à centrifuger de deux millilitres à moins 80 degrés Celsius. Les images de microscopie électronique à transmission ont révélé la présence de vésicules en forme de coupe avec une bicouche lipidique, caractéristique des exosomes.
La taille des exosomes variait de 30 à 150 nanomètres, avec une concentration maximale de 60 nanomètres, comme le montre le graphique de distribution de taille. L’analyse par transfert Western a confirmé la présence de marqueurs exosomaux, TSG101 et CD9, tandis que GM130 et le témoin négatif n’ont pas été détectés.
Aperçu
Cette étude présente un protocole pratique pour isoler les exosomes des tissus de rate de souris, ce qui est crucial pour comprendre leur rôle dans les maladies cardiovasculaires. La méthode combine la digestion par la collagénase de type I avec l'ultracentrifugation, assurant un rendement élevé en exosomes de haute qualité tout en préservant l'intégrité de la membrane cellulaire.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Biologie cellulaire
- Recherche cardiovasculaire
Contexte
- Les exosomes dérivés des tissus reflètent la spécificité des tissus et le microenvironnement.
- Les exosomes dérivés de la rate jouent un rôle dans les réponses immunitaires.
- Comprendre la fonction des exosomes est vital pour la recherche sur les maladies cardiovasculaires.
- Les méthodes antérieures peuvent compromettre l'intégrité des membranes.
Objectif de l'étude
- Développer un protocole reproductible pour isoler les exosomes dérivés de la rate.
- Faciliter l'analyse d'identification et les études fonctionnelles ultérieures.
- Améliorer la compréhension des rôles des exosomes dans les maladies cardiovasculaires.
Méthodes utilisées
- Digestion du tissu de rate à l'aide de collagénase de type I.
- Filtration par ultracentrifugation différentielle.
- Isolation d'exosomes de haute qualité.
- Préservation de l'intégrité de la membrane cellulaire pendant le processus.
Résultats principaux
- Isolation réussie des exosomes dérivés de la rate.
- Exosomes de haute qualité adaptés à une analyse ultérieure.
- La méthode démontre une meilleure préservation de l'intégrité des membranes.
- Applications potentielles dans l'étude des réponses immunitaires.
Conclusions
- Le protocole développé est efficace pour isoler les exosomes de la rate de souris.
- Cette technique peut améliorer la recherche sur les fonctions des exosomes dans les maladies cardiovasculaires.
- Les études futures peuvent s'appuyer sur cette méthode pour diverses applications en immunologie.
Questions fréquemment posées
Executive Industry Relevance
Reliable isolation and characterization of spleen-derived exosomes enables mechanistic de-risking and target validation in immune and cardiovascular disease research. This protocol supports predictive confidence by preserving exosome integrity and ensuring reproducibility across discovery and translational workflows. The method positions tissue-specific exosome analysis as a reusable capability for biomarker and functional studies in biopharma R&D portfolios.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of exosome-mediated signaling pathways in disease-relevant immune tissues.
- Supports biological de-risking by providing tissue-specific extracellular vesicle profiles.
- Facilitates functional target validation through reproducible exosome isolation and marker confirmation.
Screening & Assay Development
- Prepares validated exosome samples for downstream quantitative and qualitative assays.
- Standardizes exosome isolation for reproducible biomarker and mechanistic screening.
- Enables scalable workflows for comparative analysis of exosome populations across conditions.
Translational & Preclinical Research
- Aligns exosome characterization with disease-relevant immune and cardiovascular models.
- Supports translational biomarker discovery by reflecting tissue microenvironment and specificity.
- Provides continuity from early discovery to preclinical validation of exosome-based hypotheses.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling robust exosome isolation for hypothesis testing, biomarker identification, and mechanistic studies.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on exosome-mediated intercellular communication and immune modulation.
- Screening: Delivers reproducible, marker-validated exosome preparations for assay development and compound evaluation.
- Analytics: Provides quantitative size distribution and marker expression data for comparative analytics.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical research by enabling tissue-specific exosome studies relevant to disease models.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized, scalable protocol adaptable to other tissue types and research programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in exosome research.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible, and scalable exosome isolation workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by enabling robust biomarker and mechanistic studies.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of exosome-based discovery programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in tissue processing, ultracentrifugation, and exosome analytics.
- Needs access to high-speed and ultra-high-speed centrifuges, electron microscopy, and western blot infrastructure.
- Demands cross-team standardization of tissue handling and analytical protocols.
- Adaptation to other tissues may require optimization of digestion and isolation parameters.
- Yield and purity depend on tissue quality and precise execution of protocol steps.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
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Introduction
1:42
Preparation of Equipment and Reagents for Spleen Tissue-Derived Exosome Isolation for Functional Analysis
3:00
Efficient Isolation of Exosomes from Mouse Spleen Using Collagenase Digestion for Biomarker Studies
4:50
Representative Results
