Name: Isolement et caractérisation d’exosomes dérivés de tissus de rate de souris (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-20T14:10:00.000+00:00
Duration: 5 min 27 s
Description: Découvrez un protocole d'isolation d'exosomes à partir de tissus spléniques de souris utilisant la digestion par collagénase de type I et l'ultracentrifugation. Cette méthode préserve l'intégrité membranaire pour des études cardiovasculaires.

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Les échantillons ont été obtenus à partir de souris, avec l’approbation éthique accordée par le Comité d’éthique de l’Université de médecine du Guangdong. Des descriptions détaillées des matériaux, de l’équipement et des logiciels utilisés dans ce protocole sont fournies dans la Table des matériaux. Les détails de la préparation avant l’extraction sont illustrés à la figure 1, tandis que le processus d’extraction et d’enrichissement de Spleen-Exo est décrit à la figure 2.
1. Préparation
<ol>
	<li>Pré-refroidissez les centrifugeuses à grande vitesse et à ultra-haute vitesse à 4 °C et réglez la température d’un agitateur de bureau à 37 °C.</li>
	<li>Préparez des boîtes de culture cellulaire (<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/67234/67234eq01.jpg" style="margin: auto;">100 mm), des tubes à centrifuger stériles de 50 ml, de la glace et une passoire à cellules stériles (<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/67234/67234eq01.jpg" style="margin: auto;">70 μm) comme illustré aux figures 1A et B.</li>
	<li>Stérilisez les ciseaux et les pinces à l’aide d’un spray d’alcool à 75 %, suivi d’une stérilisation à haute température. Ces outils sont illustrés à la figure 1C.</li>
	<li>Placez le tissu de la rate dans une boîte de Pétri stérile <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/67234/67234eq01.jpg" style="margin: auto;">de 100 mm sur de la glace et lavez le sang de surface avec 1 solution saline stérile glacée tamponnée au phosphate (PBS). Séchez les tissus de la rate avec de la gaze stérile et pesez-les après séchage. REMARQUE : Si le tissu est congelé, décongelez-le dans un plat pendant 15 minutes sur de la glace avant de continuer.</li>
	<li>Hydratez la crépine cellulaire (<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/67234/67234eq01.jpg" style="margin: auto;">70 μm) en déposant 1 mL de PBS stérile dans la passoire à l’aide d’une pipette de transfert stérile.</li>
	<li>Préparez le tampon digestif (0,1 % de collagénase de type I) à l’aide de 1x PBS avec un mélangeur vortex. REMARQUE : Utiliser 10 ml de tampon digestif pour 100 mg de tissu de la rate. La concentration de collagénase a été choisie dans cette étude sur la base des instructions du produit. Pour d’autres types de tissus, les chercheurs peuvent avoir besoin d’ajuster ces paramètres en fonction de la densité et de la composition des tissus. Des expériences préliminaires avec des concentrations et des temps de digestion variables sont recommandées pour déterminer les conditions optimales pour chaque type de tissu.</li>
</ol>
2. Digestion des tissus
<ol>
	<li>Coupez le tissu en petits morceaux uniformes à l’aide de ciseaux dans une boîte de culture sur de la glace (figure 3A) et transférez-le dans un tube à centrifuger de 50 ml à l’aide d’une pipette de transfert stérile.</li>
	<li>Ajouter le tampon de digestion dans le tube en fonction du poids du tissu de la rate comme indiqué ci-dessus (figure 3B), puis agiter le tube avec un angle de 45° sur un agitateur horizontal à 37 °C. Surveillez la progression de la digestion et arrêtez la digestion lorsque les morceaux de tissu se sont dispersés et que la plupart ont perdu leur forme. Le temps de digestion doit varier entre les tissus. Dans les conditions expérimentales de cette étude, le temps de digestion est d’environ 30 min.</li>
	<li>Transférez le mélange digéré dans une passoire cellulaire (Ф70 μm) à température ambiante (RT) pour éliminer les débris tissulaires fibreux et plus gros. REMARQUE : Terminer la filtration immédiatement après la digestion.</li>
	<li>Recueillir le filtrat dans un tube à centrifuger neuf de 50 ml.</li>
</ol>
3. Isolement des exosomes par centrifugation différentielle
<ol>
	<li>Filtrats de centrifugation à 500 x g pendant 10 min à 4 °C. Une pastille contenant des cellules résiduelles, des débris cellulaires et des noyaux peut être observée après centrifugation, comme le montre la figure 3C.</li>
	<li>Transvasez le surnageant dans un nouveau tube et centrifugez-le à 3000 x g pendant 20 min à 4 °C. Une pastille contenant des corps apoptotiques et des microsomes peut être observée après centrifugation, comme le montre la figure 3D.</li>
	<li>Transvasez le surnageant dans un tube neuf et centrifugez-le à 10 000 x g pendant 30 min à 4 °C. Des pastilles contenant des microvésicules et une membrane plasmique peuvent être observées après centrifugation, comme le montre la figure 3E.</li>
	<li>Ultracentrifuger le surnageant résultant à 120 000 x g pendant 2 h à 4 °C. Une pastille peut être vue au fond du tube après centrifugation, comme le montre la figure 3F.</li>
	<li>Jetez le surnageant, lavez la pastille avec du PBS et ultracentrifugez-la à nouveau à 120 000 x g pendant 2 h à 4 °C pour obtenir des exosomes. Une pastille peut être vue au fond du tube après centrifugation, comme le montre la figure 3G.</li>
	<li>Dissoudre les exosomes isolés avec du PBS stérile (200 μL par rate) et stocker les exosomes isolés dans un tube à centrifuger neuf de 2 mL à -80 °C.</li>
</ol>
4. Caractérisation des exosomes par microscopie électronique à transmission (MET)
REMARQUE : La MET a été utilisée pour déterminer si l’Exo extrait présentait des caractéristiques vésiculaires. Les échantillons Exo identifiés par microscopie électronique doivent être des échantillons frais ou stockés brièvement à 4 °C pendant une courte période.
<ol>
	<li>Fixer les exosomes (2-6 μg/μL) avec du paraformaldéhyde de qualité microscopie électronique (EM) à 2 % à RT pendant 2 h.</li>
	<li>Déposer 10 μL de solution d’exosomes sur un treillis de cuivre, incuber à RT pendant 10 min, rincer à l’eau distillée stérile et éponger l’excès de liquide avec du papier absorbant.</li>
	<li>Teignez le treillis de cuivre avec de l’acétate d’uranyle à 2 % pendant 1 min, épongez l’excès de liquide avec du papier filtre et séchez-le sous une lampe à incandescence pendant 2 min.</li>
	<li>Observez l’échantillon préparé au microscope électronique à transmission à 80 kV.</li>
</ol>
5. Mesure de la distribution granulométrique et de la concentration en particules des exosomes
<ol>
	<li>Chargez les nanoparticules de polystyrène standard (250 nm) sur le cytomètre en nanoflux.</li>
	<li>Mesurez la concentration en protéines des échantillons d’Exo à l’aide d’un kit de dosage des protéines BCA. Diluez l’échantillon Exo avec du PBS selon les résultats du dosage des protéines BCA (diluez les exosomes à 1-10 ng/μL), puis chargez les échantillons Exo dans le nano-flux pour mesurer l’intensité de la diffusion latérale (SSI).</li>
	<li>Calculer la concentration d’Exo en fonction du rapport entre le SSI et la concentration de particules dans les nanoparticules de polystyrène standard. REMARQUE : Pour la mesure de la taille, une courbe standard est générée en chargeant des nanoparticules de silice standard avec des tailles de gradient (68 nm, 91 nm, 113 nm, 155 nm) dans le nanocytomètre en flux. Le chargement de l’échantillon Exo s’ensuit ainsi. La distribution granulométrique d’Exo a été calculée selon la polymérisation standard.</li>
</ol>
6. Confirmation par lyse et immunoblot des protéines d’exosomes
<ol>
	<li>Ajouter 100 μL de tampon de lyse par dosage par radio-immunoprécipitation (RIPA) à la pastille d’exosome pour l’analyse des protéines.</li>
	<li>Vortex vigoureusement, couvrir de parafilm, basculer pendant 20 min à RT, puis vortex à nouveau.</li>
	<li>Centrifuger brièvement à 1000 x g pendant 30 à 60 s pour recueillir l’échantillon, le transférer dans un nouveau tube de microcentrifugation de 1,5 mL et le stocker à -20 °C à -80 °C jusqu’à l’analyse.</li>
	<li>Pour l’immunoblot, mélanger les échantillons avec un tampon de charge 5x pour obtenir une concentration de 1x et se préparer à l’électrophorèse sur gel.</li>
	<li>Si l’on souhaite des contrôles d’homogénat de tissu entier, utilisez un tampon de lyse puissant avec un inhibiteur de protéase pour lyser le tissu, comme indiqué ci-dessus. Ensuite, centrifugez les échantillons à 10 000 x g pendant 10 min et jetez la matrice extracellulaire restante, les cellules entières ou les débris cellulaires intacts.</li>
	<li>Faire bouillir le tampon d’échantillon contenant des exosomes ou l’homogénat de tissu à 95 °C pendant 5 à 10 min. Chargez une quantité égale de protéines par voie dans un gel SDS-PAGE à 10 %. Charge égale de protéine de l’homogénat de tissu comme témoin.</li>
	<li>Procéder à l’électrophorèse sur gel sous une tension de 80 V pendant environ 2 h à l’aide du tampon d’électrophorèse classique. Effectuer une analyse par transfert Western pour confirmer l’expression de la protéine Exo dans les lysats purifiés et comparer l’abondance relative d’Exo en fractions.</li>
</ol>

<meta charset="utf8"></head><body>Techniques de perfectionnement pour l’isolement d’exosomes dérivés de la rate murine

<ol><li>Meldolesi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+and+Ectosomes+in+Intercellular+Communication%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Exosomes and Ectosomes in Intercellular Communication.</a> Curr Biol. 28 (8), R435-R444 (2018).</li>
<li>Costa-Silva, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+cancer+exosomes+initiate+pre-metastatic+niche+formation+in+the+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Pancreatic cancer exosomes initiate pre-metastatic niche formation in the liver.</a> Nat Cell Biol. 17 (6), 816-826 (2015).</li>
<li>Crescitelli, R., Lasser, C., Lotvall, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+extracellular+vesicle+subpopulations+from+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of extracellular vesicle subpopulations from tissues.</a> Nat Protoc. 16 (3), 1548-1580 (2021).</li>
<li>de Jong, B., Barros, E. R., Hoenderop, J. G. J., Rigalli, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+extracellular+vesicles+as+drug+delivery+systems+and+their+potential+in+precision+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Recent advances in extracellular vesicles as drug delivery systems and their potential in precision medicine.</a> Pharmaceutics. 12 (11), 1006(2020).</li>
<li>Crescitelli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subpopulations+of+extracellular+vesicles+from+human+metastatic+melanoma+tissue+identified+by+quantitative+proteomics+after+optimized+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Extracell+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Subpopulations of extracellular vesicles from human metastatic melanoma tissue identified by quantitative proteomics after optimized isolation.</a> J Extracell Vesicles. 9 (1), 1722433(2020).</li>
<li>Jensen, C., Teng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+it+time+to+start+transitioning+from+2D+to+3D+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Mol+Biosci%22%5BJournal%5D)">Is it time to start transitioning from 2D to 3D cell culture.</a> Front Mol Biosci. 7, 33(2020).</li>
<li>Leung, L. L., Riaz, M. K., Qu, X., Chan, J., Meehan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profiling+of+extracellular+vesicles+in+oral+cancer%2C+from+transcriptomics+to+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cancer+Biol%22%5BJournal%5D)">Profiling of extracellular vesicles in oral cancer, from transcriptomics to proteomics.</a> Semin Cancer Biol. 74, 3-23 (2021).</li>
<li>Shah, R., Patel, T., Freedman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+extracellular+vesicles+in+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Circulating extracellular vesicles in human disease.</a> N Engl J Med. 379 (10), 958-966 (2018).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+enrichment+method+for+small+extracellular+vesicles+derived+from+liver+cancer+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">An enrichment method for small extracellular vesicles derived from liver cancer tissue.</a> J Vis Exp. (192), e64499(2023).</li>
<li>Vella, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rigorous+method+to+enrich+for+exosomes+from+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Extracell+Vesicles%22%5BJournal%5D)">A rigorous method to enrich for exosomes from brain tissue.</a> J Extracell Vesicles. 6 (1), 1348885(2017).</li>
<li>Hoshino, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicle+and+particle+biomarkers+define+multiple+human+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicle and particle biomarkers define multiple human cancers.</a> Cell. 182 (4), 1044-1061.e18 (2020).</li>
<li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yiwei+decoction+promotes+apoptosis+of+gastric+cancer+cells+through+spleen-derived+exosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Yiwei decoction promotes apoptosis of gastric cancer cells through spleen-derived exosomes.</a> Front Pharmacol. 14, 1144955(2023).</li>
<li>Useckaite, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+profiling+of+paired+human+liver+homogenate+and+tissue-derived+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Proteomic profiling of paired human liver homogenate and tissue-derived extracellular vesicles.</a> Proteomics. 24 (11), e2300025(2023).</li>
<li>Hurwitz, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+method+for+enrichment+of+whole+brain-derived+extracellular+vesicles+reveals+insight+into+neurodegenerative+processes+in+a+mouse+model+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">An optimized method for enrichment of whole brain-derived extracellular vesicles reveals insight into neurodegenerative processes in a mouse model of Alzheimer's disease.</a> J Neurosci Methods. 307, 210-220 (2018).</li>
<li>Lai, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosome+processing+and+characterization+approaches+for+research+and+technology+development%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Sci+%28Weinh%29%22%5BJournal%5D)">Exosome processing and characterization approaches for research and technology development.</a> Adv Sci (Weinh). 9 (15), e2103222(2022).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosome%3A+A+review+of+its+classification%2C+isolation+techniques%2C+storage%2C+diagnostic+and+targeted+therapy+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Exosome: A review of its classification, isolation techniques, storage, diagnostic and targeted therapy applications.</a> Int J Nanomedicine. 15, 6917-6934 (2020).</li>
<li>Roh, Y. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+tissue-derived+exosomes+alleviate+particulate+matter-induced+inflammatory+response+and+skin+barrier+damage+in+atopic+dermatitis-like+triple-cell+model%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Adipose tissue-derived exosomes alleviate particulate matter-induced inflammatory response and skin barrier damage in atopic dermatitis-like triple-cell model.</a> PLoS One. 19 (1), e0292050(2024).</li>
<li>Gallart-Palau, X., Serra, A., Sze, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enrichment+of+extracellular+vesicles+from+tissues+of+the+central+nervous+system+by+PROSPR%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Neurodegener%22%5BJournal%5D)">Enrichment of extracellular vesicles from tissues of the central nervous system by PROSPR.</a> Mol Neurodegener. 11 (1), 41(2016).</li>
<li>Kurian, T. K., Banik, S., Gopal, D., Chakrabarti, S., Mazumder, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elucidating+methods+for+isolation+and+quantification+of+exosomes%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Elucidating methods for isolation and quantification of exosomes: A review.</a> Mol Biotechnol. 63 (4), 249-266 (2021).</li>
<li>Menu, E., Vanderkerken, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+in+multiple+myeloma%3A+from+bench+to+bedside%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Exosomes in multiple myeloma: from bench to bedside.</a> Blood. 140 (23), 2429-2442 (2022).</li>
<li>Shen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+lysate%2Ftissue+storage+at+-80+degrees+C+on+subsequently+extracted+EVs+of+epithelial+ovarian+cancer+tissue+origins%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">Effects of lysate/tissue storage at -80 degrees C on subsequently extracted EVs of epithelial ovarian cancer tissue origins.</a> iScience. 26 (4), 106521(2023).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>70 et micro ; m Cell Strainer</td><td>Biologix Group Co., Ltd.USA</td><td>15-1070</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps anti CD9</td><td>Cell Signaling Technology, Inc (CST), États-Unis</td><td>983275</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps anti GM130</td><td>Proteintech Group, Inc.China&nbsp ;</td><td>66662-1-lg</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps anti TSG101</td><td>Abcam Plc, Royaume-Uni</td><td>125011</td><td></td></tr><tr><td>Plat de culture cellulaire</td><td>Wuxi NEST Biotechnology Co., Ltd, Chine</td><td>704001</td><td></td></tr><tr><td>Tube à centrifuger</td><td>Wuxi NEST Biotechnology Co., Ltd, Chine</td><td>788211</td><td></td></tr><tr><td>Collagénase Type I</td><td>Sigma-Aldrich Corp., USA</td><td>C2674</td><td></td></tr><tr><td>Agitateur</td> <td>thermostatique de bureauShanghai bluepard instruments Co., Ltd., Chine</td><td>THZ-100</td><td></td></tr><tr><td>Tampon d’électrophorèse</td><td>Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd., Chine&nbsp ;</td><td>G2081-1L</td><td></td></tr><tr><td>Kit amélioré de dosage des protéines BCA</td><td>Shanghai Beyotime Biotechnology Co., Ltd., Chine&nbsp ;</td><td>P0010S</td><td></td></tr><tr><td>Flow NanoAnalyzer</td><td>NanoFCM Inc., Chine</td><td>N30E</td><td></td></tr><tr><td>Système d’imagerie par fluorescence/chimiluminescence&nbsp ;</td><td>Guangzhou Biolight Biotechnology Co., Ltd., Chine</td><td>GelView 6000Plus</td><td></td></tr><tr><td>HRP Chèvre anti-IgG de</td> souris <td>Proteintech Group, Inc.Chine&nbsp ;</td><td>15014</td><td></td></tr><tr><td>HRP Chèvre anti-Lapin IgG</td><td>Proteintech Group, Inc.Chine&nbsp ;</td><td>15015</td><td></td></tr><tr><td>lecteur de microplaques</td><td>Molecular Devices, USA</td><td>CMax Plus</td><td></td></tr><tr><td>Microscissors</td><td>Shanghai&nbsp ; Médical&nbsp ; Instruments (groupe)&nbsp ;Co., Ltd.,Chine</td><td>WA1010</td><td></td></tr><tr><td>Pince à épiler microscopique</td><td>Shanghai&nbsp ; Médical&nbsp ; Instruments (groupe)&nbsp ;Co., Ltd.,Chine</td><td>WA3010</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse Multifuge X1R Pro</td><td>Thermo Fisher Scientific, USA</td><td>75009750</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux ophtalmiques</td><td>Shanghai&nbsp ; Médical&nbsp ; Instruments (groupe)&nbsp ;Co., Ltd.,China</td><td>Y00030</td><td></td></tr><tr><td>Pince à épiler ophtalmique</td><td>Shanghai&nbsp ; Médical&nbsp ; Instruments (Groupe)&nbsp ;Co., Ltd., Chine&nbsp ;</td><td>JD1060</td><td></td></tr><tr><td>Optima XPN-100 Centrifugeuse d’ultrafiltration</td><td>Beckman Coulter, USA</td><td>A94469</td><td></td></tr><tr><td>solution saline tamponnée au phosphate (PBS)</td><td>Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd., Chine</td><td>P1003</td><td></td></tr><tr><td>Tampon de lyse RIPA (fort, sans inhibiteurs)</td><td>Shanghai Beyotime Biotechnology Co., Ltd., Chine&nbsp ;</td><td>P0013K</td><td></td></tr><tr><td>Règle</td><td>Deli&nbsp ; Fabrication&nbsp ; Société, Chine</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tampon de chargement d’échantillons SDS-PAGE, 5x</td><td>Shanghai Beyotime Biotechnology Co., Ltd., Chine&nbsp ;</td><td>P0015</td><td></td></tr><tr><td>Pipette de transfert</td><td>Biologix Group Co., Ltd.USA</td><td>30-0238A1</td><td></td></tr><tr><td>Microscope électronique à transmission</td><td>Hitachi, Japon</td><td>H-7650</td><td></td></tr><tr><td>Tube d’ultracentrifugation</td><td>Beckman Coulter, États-Unis</td><td>355618</td><td></td></tr><tr><td>Western Transfer Buffer&nbsp ;</td><td>Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd., Chine&nbsp ;</td><td>Référence G2028-1L</td><td></td></tr></tbody></table>

isolement et caractérisation d’exosomes dérivés de tissus de rate de souris

Isolation and Characterization of Exosomes Derived from Mouse Spleen Tissues

Isolement et purification d’exosomes dérivés de la rate Pour isoler les exosomes du tissu de la rate de souris, nous avons utilisé une combinaison de digestion de la collagénase et d’ultracentrifugation différentielle (Figure 2). Les premières étapes consistaient à prétraiter le tissu de la rate pour éliminer le sang de surface, suivi d’une digestion avec de la collagénase de type I. Ce traitement enzymatique a facilité la dégradation des composants de la matrice extracellulaire, libérant ainsi les exosomes tout en préservant leur intégrité. Après la digestion, une série d’étapes de centrifugation a été utilisée pour éliminer séquentiellement les débris cellulaires, les corps apoptotiques et les vésicules plus grandes, aboutissant à l’ultracentrifugation du surnageant à 120 000 x g pour granuler les exosomes. Les procédures d’isolement ultérieures ont permis d’obtenir des pastilles solubles dans le PBS enrichies en Exo dérivé de la rate, comme le montre la figure 3G.
Résultats de la GDT La morphologie des exosomes isolés a été examinée à l’aide de la microscopie électronique à transmission, une méthode de référence pour étudier la caractérisation des exosomes. La MET est couramment utilisée pour valider la présence d’exosomes, évaluer la qualité des exosomes et observer la morphologie des exosomes. Les images TEM (Figure 4A) ont révélé la présence de vésicules en forme de coupe, caractéristiques des exosomes. Ces vésicules présentaient une structure bicouche lipidique claire, confirmant l’isolement réussi des exosomes du tissu de la rate.
Distribution granulométrique de Spleen-Exo La distribution de taille et la concentration des exosomes ont été déterminées à l’aide d’un cytomètre en nano-flux. Les résultats (figure 4B) ont indiqué que le diamètre des exosomes isolés variait de 30 à 150 nm, avec une concentration maximale à environ 60 nm. Le diamètre des particules isolées était principalement de 50 à 80 nm, avec une concentration moyenne de particules de 4,6 x 109 particules/mL. Cette gamme de tailles est cohérente avec les caractéristiques des exosomes précédemment rapportées, ce qui valide davantage le protocole d’isolement.
Analyse par transfert Western Pour confirmer la présence de marqueurs exosomaux, nous avons effectué une analyse par western blot. Les marqueurs exosomaux TSG101 et CD9 ont été détectés dans les échantillons de Spleen-Exo, tandis que GM130, une protéine de la matrice de Golgi utilisée comme contrôle négatif, n’a pas été détectée (Figure 4C). En comparaison, la protéine de ces marqueurs était exprimée dans les tissus de la rate de souris (Spleen-T). Cela indique la grande pureté des exosomes isolés, car ils étaient dépourvus de contaminants cellulaires.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67234/67234fig01.jpg"> 
Figure 1 : Préparation de l’approvisionnement. (A) Des tubes à centrifuger de 50 ml, des boîtes de culture, de la glace et des outils chirurgicaux ont été placés dans une enceinte de biosécurité. (B) Une crépine à cellules stériles (<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/67234/67234eq01.jpg" style="margin: auto;">70 μm). (C) Outils chirurgicaux stérilisés. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67234/67234fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67234/67234fig02.jpg"> 
Figure 2 : Procédure d’isolement de Spleen-Exo. Préparez le tissu de la rate et coupez-le en petits morceaux dans du PBS glacé, suivi d’une digestion avec de la collagénase de type I et d’une centrifugation comme indiqué. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67234/67234fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67234/67234fig03.jpg"> 
Figure 3 : Images représentatives de l’isolement de Spleen-Exo. (A) Petits blocs de rate prêts pour la digestion ultérieure. (B) Blocs de tissu de la rate avec tampon de digestion. (C) Granulés après centrifugation de 500 x g. (D) Granulés après centrifugation de 3 000 x g. (E) Granulés après centrifugation de 10 000 x g. (F) Granulés après centrifugation de 120 000 x g. (G) Pastilles d’exosomes après centrifugation de 120 000 x g. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67234/67234fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67234/67234fig04.jpg"> 
Figure 4 : Identification de la rate-Exo. (A) Résultats de la MET montrant des particules isolées sous forme de vésicules membraneuses rondes ou ovales avec une morphologie en forme de coupe. Barre d’échelle = 200 nm et 50 nm, respectivement. (B) L’analyse de la distribution granulométrique par Flow Nano Analyzer a montré que le diamètre de Spleen-Exo variait principalement de 50 nm à 80 nm, avec une concentration moyenne de particules de 4,6 × 109 particules/mL. (C) Analyse par transfert Western montrant l’expression de protéines marqueurs spécifiques de l’exosome (TSG101 et CD9) dans Spleen-Exo, avec une expression négative de GM130. Ces marqueurs étaient détectables dans des échantillons de protéines extraits de rates de souris (groupe Spleen-T). Les images représentatives du western blot ont été montrées (n = 6 tissus). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67234/67234fig04large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>

Isolement et caractérisation d’exosomes dérivés de tissus de rate de souris

Exosomes (Exo) are lipid-bilayer structures secreted by various cells, including those of animals, plants, and prokaryotes. Previous studies have revealed ...

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Préparation des suspensions unicellulaires à partir de rate de souris avec le dissociateur gentleMACS

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