Name: Caractérisation complète de la minéralisation tissulaire dans un modèle ex vivo (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-27T14:35:00.000+00:00
Duration: 7 min 29 s
Description: Découvrez la caractérisation complète de la minéralisation tissulaire pour la régénération osseuse en utilisant un modèle ex vivo. Cette approche multimodale combine micro-CT, nanoindentation et spectroscopie Raman pour évaluer la formation osseuse.

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<meta charset="utf8"></head><body>Analyse multimodale de la formation osseuse à l’aide de modèles d’explants

<ol><li>Feroz, S., Cathro, P., Ivanovski, S., Muhammad, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomimetic+bone+grafts+and+substitutes%3A+A+review+of+recent+advancements+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Eng+Adv%22%5BJournal%5D)">Biomimetic bone grafts and substitutes: A review of recent advancements and applications.</a> Biomed Eng Adv. 6, 100107(2023).</li>
<li>Tsuji, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BMP2+activity%2C+although+dispensable+for+bone+formation%2C+is+required+for+the+initiation+of+fracture+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">BMP2 activity, although dispensable for bone formation, is required for the initiation of fracture healing.</a> Nat Genet. 38 (12), 1424-1429 (2006).</li>
<li>Hadjidakis, D. J., Androulakis, I. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Boneremodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+N+Y+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Boneremodeling.</a> Ann N Y Acad Sci. 1092, 385-396 (2006).</li>
<li>Boivin, G., Meunier, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+degree+of+mineralization+of+bone+tissue+measured+by+computerized+quantitative+contact+microradiography%5BTitle%5D)+AND+%22Calcified+Tiss+Int%22%5BJournal%5D)">The degree of mineralization of bone tissue measured by computerized quantitative contact microradiography.</a> Calcified Tiss Int. 70 (6), 503-511 (2002).</li>
<li>Boivin, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+remodeling+on+the+mineralization+of+bone+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoporo+Int%22%5BJournal%5D)">Influence of remodeling on the mineralization of bone tissue.</a> Osteoporo Int. 20 (6), 1023-1026 (2009).</li>
<li>Zanghellini, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multimodal+analysis+and+comparison+of+stoichiometric+and+structural+characteristics+of+parosteal+and+conventional+osteosarcoma+with+massive+sclerosis+in+human+bone%5BTitle%5D)+AND+%22J+Str+Biol%22%5BJournal%5D)">Multimodal analysis and comparison of stoichiometric and structural characteristics of parosteal and conventional osteosarcoma with massive sclerosis in human bone.</a> J Str Biol. 216 (3), 108106(2024).</li>
<li>Trento, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((formation+around+two+titanium+implant+surfaces+placed+in+bone+defects+with+and+without+a+bone+substitute+material%3A+A+histological%2C+histomorphometric%2C+and+micro-computed+tomography+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Implant+Dent+Relat+Res%22%5BJournal%5D)">formation around two titanium implant surfaces placed in bone defects with and without a bone substitute material: A histological, histomorphometric, and micro-computed tomography evaluation.</a> Clin Implant Dent Relat Res. 22 (2), 177-185 (2020).</li>
<li>Palmquist, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multiscale+analytical+approach+to+evaluate+osseointegration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mater+Sci+Mater+Med%22%5BJournal%5D)">A multiscale analytical approach to evaluate osseointegration.</a> J Mater Sci Mater Med. 29 (5), 60(2018).</li>
<li>Budán, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+radiomics+evaluation+of+bone+formation+utilizing+multimodal+%28SPECT%2FX-ray+CT%29+in+vivo+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Novel radiomics evaluation of bone formation utilizing multimodal (SPECT/X-ray CT) in vivo imaging.</a> PLoS ONE. 13 (9), e0204423(2018).</li>
<li>Hulsart-Billström, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+surprisingly+poor+correlation+between+in+vitro+and+in+vivo+testing+of+biomaterials+for+bone+regeneration%3A+results+of+a+multicentre+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Cells+Mater%22%5BJournal%5D)">A surprisingly poor correlation between in vitro and in vivo testing of biomaterials for bone regeneration: results of a multicentre analysis.</a> Eur Cells Mater. 31, 312-322 (2016).</li>
<li>Cramer, E. E. A., Ito, K., Hofmann, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+bone+models+and+their+potential+in+preclinical+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Osteoporo+Rep%22%5BJournal%5D)">Ex vivo bone models and their potential in preclinical evaluation.</a> Curr Osteoporo Rep. 19 (1), 75-87 (2021).</li>
<li>Chan, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+trabecular+bone+explant+model+of+osteocyte-osteoblast+co-culture+for+bone+mechanobiology%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">A trabecular bone explant model of osteocyte-osteoblast co-culture for bone mechanobiology.</a> Cell Mol Bioeng. 2 (3), 405-415 (2009).</li>
<li>Doke, S. K., Dhawale, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternatives+to+animal+testing%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Saudi+Pharma+J%22%5BJournal%5D)">Alternatives to animal testing: A review.</a> Saudi Pharma J. 23 (3), 223-229 (2015).</li>
<li>Moussi, H., et al. New formulation of injectable and degradable calcium phosphate/silanized hyaluronic acid composite foam: Investigation in a rabbit model of long bone defect. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMoussi%2C+H+%22SSRN%22">SSRN</a>. , (2024).</li>
<li>Paré, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardized+and+axially+vascularized+calcium+phosphate-based+implants+for+segmental+mandibular+defects%3A+A+promising+proof+of+concept%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">Standardized and axially vascularized calcium phosphate-based implants for segmental mandibular defects: A promising proof of concept.</a> Acta Biomater. 154, 626-640 (2022).</li>
<li>Roschger, P., Fratzl, P., Eschberger, J., Klaushofer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+quantitative+backscattered+electron+imaging+for+the+measurement+of+mineral+density+distribution+in+human+bone+biopsies%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Validation of quantitative backscattered electron imaging for the measurement of mineral density distribution in human bone biopsies.</a> Bone. 23 (4), 319-326 (1998).</li>
<li>Roschger, P., Plenk, H., Klaushofer, K., Eschberger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+scanning+electron+microscopy+approach+to+the+quantification+of+bone+mineral+distribution%3A+backscattered+electron+image+grey-levels+correlated+to+calcium+K+alpha-line+intensities%5BTitle%5D)+AND+%22Scanning+Micro%22%5BJournal%5D)">A new scanning electron microscopy approach to the quantification of bone mineral distribution: backscattered electron image grey-levels correlated to calcium K alpha-line intensities.</a> Scanning Micro. 9 (1), 75-86 (1995).</li>
<li>Porter, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quick+and+inexpensive+paraffin-embedding+method+for+dynamic+bone+formation+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Quick and inexpensive paraffin-embedding method for dynamic bone formation analyses.</a> Sci Rep. 7, 42505(2017).</li>
<li>Goldschlager, T., Abdelkader, A., Kerr, J., Boundy, I., Jenkin, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Undecalcified+bone+preparation+for+histology%2C+histomorphometry+and+fluorochrome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Undecalcified bone preparation for histology, histomorphometry and fluorochrome analysis.</a> J Vis Exp. (35), e1707(2010).</li>
<li>Kazanci, M., Roschger, P., Paschalis, E. P., Klaushofer, K., Fratzl, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+osteonal+tissues+by+Raman+spectral+mapping%3A+Orientation-composition%5BTitle%5D)+AND+%22J+Str+Biol%22%5BJournal%5D)">Bone osteonal tissues by Raman spectral mapping: Orientation-composition.</a> J Str Biol. 156 (3), 489-496 (2006).</li>
<li>Unal, M., Ahmed, R., Mahadevan-Jansen, A., Nyman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compositional+assessment+of+bone+by+Raman+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">Compositional assessment of bone by Raman spectroscopy.</a> Analyst. 146 (24), 7464-7490 (2021).</li>
<li>Oliver, W. C., Pharr, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+technique+for+determining+hardness+and+elastic+modulus+using+load+and+displacement+sensing+indentation+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mater+Res%22%5BJournal%5D)">An improved technique for determining hardness and elastic modulus using load and displacement sensing indentation experiments.</a> J Mater Res. 7 (6), 1564-1583 (1992).</li>
<li>Proffen, B. L., McElfresh, M., Fleming, B. C., Murray, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+anatomical+study+of+the+human+knee+and+six+animal+species%5BTitle%5D)+AND+%22Knee%22%5BJournal%5D)">A comparative anatomical study of the human knee and six animal species.</a> Knee. 19 (4), 493-499 (2012).</li>
<li>Allen, M. J., Houlton, J. E. F., Adams, S. B., Rushton, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+surgical+anatomy+of+the+stifle+joint+in+Sheep%5BTitle%5D)+AND+%22Vet+Surg%22%5BJournal%5D)">The surgical anatomy of the stifle joint in Sheep.</a> Vet Surg. 27 (6), 596-605 (1998).</li>
<li>Kleuskens, M. W. A., van Donkelaar, C. C., Kock, L. M., Janssen, R. P. A., Ito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+ex+vivo+human+osteochondral+culture+model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Ortho+Res%22%5BJournal%5D)">An ex vivo human osteochondral culture model.</a> J Ortho Res. 39 (4), 871-879 (2021).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>0.20 filtres</td><td>VWR&nbsp ;</td><td>28145-501</td><td></td></tr><tr><td>Aiguille 18 G (1,2x40 mm)</td><td></td><td></td>Seringue 4665120 <td></td></tr><tr><td>3 mL</td><td>HENKE-JECT</td><td>8300005762</td><td></td></tr><tr><td>37 % d’acide chlorhydrique&nbsp ;</td><td>VWR&nbsp ;</td><td>1.00317.1000&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Acide acétique (glacial)</td><td>Sigma&nbsp ;</td><td>A6283&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Acétone&nbsp ;</td><td>VWR&nbsp ;</td><td>20063-365&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Bleu Alcian 8GX</td><td>VWR&nbsp ;</td><td></td><td></td>361186</tr><tr><td>Hydroxyde d’ammonium</td><td>VWR&nbsp ;</td><td></td><td></td>318612</tr><tr><td>Phosphate tricalcique apatitique</td><td>Centre de Génie Biomédical et de Santé (Mines Saint Etienne, France)</td><td>TV26U&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Azophloxine</td><td>Sigma&nbsp ;</td><td></td><td></td>210633</tr><tr><td>peroxyde de benzoyle</td><td>Sigma&nbsp ;</td><td>8.01641.0250</td><td></td></tr><tr><td>BMP2</td><td>Medtronic&nbsp ;</td><td>InductOs 1.5 mg/mL</td><td></td></tr><tr><td>Brillant crocéine&nbsp ;</td><td>Aldrich&nbsp ;</td><td></td><td></td>2107507</tr><tr><td>CTVox&nbsp ;</td><td>Bruker-DataViewer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp ;</td>Lame <td></td> diamantée <td>Skyscan</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Struers</td><td>MOD13</td><td></td></tr><tr><td>Scie diamantée</td><td>Struers</td><td>Accutom-50</td><td></td></tr><tr><td>DiaPro Mol B3 solution diamantée</td><td>Struers</td><td>40600379</td><td></td></tr><tr><td>DiaPro Nap B1 solution diamantée</td><td>Struers</td><td>40600373</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate de sodium dibasique (Na2HPO4)</td><td>Sigma&nbsp ;</td><td></td><td></td>102404598</tr><tr><td>Phtalate de dibutyle</td><td>Chimie-Plus Laboratoires</td><td>28656</td><td></td></tr><tr><td>DragonFly software&nbsp ;</td><td>SRO</td><td>2022.1.0.1231.&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) à haute teneur en glucose, GlutaMAX(TM), pyruvate</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>31966-021</td><td></td></tr><tr><td>Eosine Y- Surgipath&nbsp ;</td><td>Sigma&nbsp ;</td><td></td><td></td>1002830105</tr><tr><td>Érythrosine B</td><td>Sigma&nbsp ;</td><td></td><td></td>102141057</tr><tr><td>Éthanol absolu</td><td>VWR&nbsp ;</td><td></td><td></td>20820362</tr><tr><td>Eukitt ;</td><td>Dutscher</td><td>6.00.01.0003.06.01.01</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 50 mL</td><td>Sarstedt</td><td>62.547.254</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure ferrique hexahydraté (FeCl3, 6H2O)&nbsp ;</td><td>Merck&nbsp ;</td><td>1.03943.0250</td><td></td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin (FBS)&nbsp ;</td><td>Eurobio</td><td>CVFSVF00</td><td></td></tr><tr><td>Acide fuchsine</td><td>Merck&nbsp ;</td><td>1.05231.0025&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Solution saline équilibrée de Hank (HBSS)</td><td>Biosera</td><td>MS01NG100J</td><td></td></tr><tr><td>Hematoxylin</td><td>Sigma&nbsp ;</td><td>86.118.9&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Presse isostatique</td><td>Nova Suisse</td><td>Pmax 1500 bars</td><td></td></tr><tr><td>Granulométrie par diffraction laser</td><td>&nbsp ; Malvern</td><td>Mastersizer 3000</td><td></td></tr><tr><td>Vert clair</td><td>Prolabo&nbsp ;</td><td></td><td></td>28947135</tr><tr><td>Carbonate de lithium</td><td>Sigma&nbsp ;</td><td>A13149&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>MD-Mol Chiffon de polissage</td><td>Struers</td><td>40500077</td><td></td></tr><tr><td>Méthylcyclohexane</td><td>VWR&nbsp ;</td><td>8.06147.1000&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Méthylcyclohexane&nbsp ;</td><td>VWR&nbsp ;</td><td>8.06147.1000&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Méthylcyclohexane&nbsp ;</td><td>VWR&nbsp ;</td><td>8.06147.1000&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Méthacrylate de méthyle</td><td>Sigma&nbsp ;</td><td>8.00590.2500</td><td></td></tr><tr><td>Micro-CT, micro-scanner&nbsp ;</td><td>Bruker</td><td>Skyscan 1272</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate de sodium monobasique (NAH2PO4)</td><td>Sigma&nbsp ;</td><td>71496</td><td></td></tr><tr><td>Mortier</td><td>Fritsch&nbsp ;</td><td>Pulvérisette 6</td><td></td></tr><tr><td>N,N, Diméthylaniline</td><td>Sigma&nbsp ;</td><td>803060</td><td></td></tr><tr><td>Station de nanoindentation</td><td>Anton Paar</td><td>NHT2</td><td></td></tr><tr><td>ND-Nap Chiffon de polissage</td><td>Struers</td><td>40500080</td><td></td></tr><tr><td>OATS Kit de transfert d’autogreffe ostéochondrale, 4,75 mm</td><td>Arthrex</td><td>AR-1981-04S</td><td></td></tr><tr><td>OATS Kit de transfert d’autogreffe ostéochondrale, 8 mm</td><td>Arthrex</td><td>AR-1981-08S</td><td></td></tr><tr><td>Orange G</td><td>Ral</td><td>M15</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde (PFA)</td><td>Sigma&nbsp ;</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Moules d’enrobage jetables Peel-a-way</td><td>Polysciences, Inc</td><td>18646C-1</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline/Streptomycine (P/S)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Saline tamponnée au phosphate (PBS)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Acide phosphomolybdique&nbsp ;</td><td>Sigma&nbsp ;</td><td>221856-100 g</td><td></td></tr><tr><td>Acide phosphotungstique</td><td>Aldrich&nbsp ;</td><td>12863-5&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Polisseuse</td><td>Sturers</td><td>Dap V</td><td></td></tr><tr><td>Poupinel</td><td>MEMMERT</td><td>TV26U&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Microspectromètre Raman</td><td>Renishaw</td><td>InVia Qontor</td><td></td></tr><tr><td>Safran du G&acirc ; tinais&nbsp ;</td><td>Labonord&nbsp ;</td><td></td><td></td>11507737</tr><tr><td>Microscope électronique à balayage</td><td>Carl Zeiss</td><td>Evo LS 10</td><td></td></tr><tr><td>SEM</td><td>Zeiss</td><td>Carl Zeiss Evo LS10</td><td></td></tr><tr><td>Feuilles SiC/Papiers abrasifs</td><td>Struers</td><td>40400008 (#320), 40400011 (#1000), 40400122 (#2000), 40400182 (#4000)</td><td></td></tr><tr><td>Peinture argentique</td><td>Microscopie électronique sciences</td><td>12686-15</td><td></td></tr><tr><td>Embout standard avec coupelle de Faraday, normes carbone, aluminium et silicium</td><td>Micro-Analysis Consultants Ltd</td><td>8602</td><td></td></tr><tr><td>T25 flacon</td><td>Corning</td><td>430639</td><td></td></tr><tr><td>Xylene</td><td>VWR&nbsp ;</td><td>28975.325</td><td></td></tr><tr><td>Xylidine Ponceau</td><td>Aldrich&nbsp ;</td><td>19.976-1&nbsp ;</td><td></td></tr></tbody></table>

caractérisation complète de la minéralisation tissulaire dans un modèle ex vivo

Comprehensive Characterization of Tissue Mineralization in an Ex Vivo Model

Une image micro-CT de l’explant est présentée à la figure 2. La segmentation manuelle ne permet pas de séparer de manière optimale l’os du ciment, présent dans le canal central, à l’aide du seuillage global. Pour améliorer la reconnaissance de l’os trabéculaire et du ciment, nous proposons d’utiliser l’apprentissage profond. L’apprentissage profond est puissant pour reconnaître les caractéristiques des biomatériaux et contribue à améliorer la séparation entre l’os et le ciment, ce qui permet une meilleure évaluation des interactions ciment-os. Ceci est de la plus haute importance afin de quantifier avec précision la quantité d’os formée à l’interface avec le ciment et de ne pas incorporer de faux pixels dans ce calcul.
Cependant, il ne suffit pas de quantifier l’os à l’interface pour caractériser l’os nouvellement formé. Une étude plus approfondie de la qualité de la matrice osseuse et de la composition cellulaire est nécessaire pour mieux comprendre la résistance du nouvel os et les mécanismes cellulaires qui ont conduit à la formation de cette nouvelle matrice. La matrice osseuse peut être caractérisée à l’aide de deux approches complémentaires : la qBEI et la microspectroscopie Raman. Un exemple d’image qBEI est présenté à la figure 3. Avec qBEI, chaque pixel encodé en niveaux de gris est transformé en une concentration de calcium. C’est une condition préalable pour évaluer la distribution de la teneur en calcium dans l’os trabéculaire et pour comprendre (i) le degré de minéralisation de l’os nouvellement formé à l’interface avec le ciment et (ii) si la présence de ciment perturbe la minéralisation osseuse trabéculaire. L’avantage du qBEI est sa capacité à acquérir une image haute résolution en très peu de temps, contrairement à la microspectroscopie Raman qui nécessite un temps d’acquisition plus long. Les paramètres qBEI tels que lamoyenne Ca, lepic Ca et lalargeur Ca peuvent ensuite être dérivés de la distribution du calcium et utilisés pour comparer la réponse entre deux ciments ou biomatériaux.
D’autre part, qBEI ne fournit aucune information sur la qualité de la phase organique de la matrice osseuse à l’interface avec le biomatériau. Des informations supplémentaires concernant les propriétés des matériaux de la phase organique proviennent de la microspectroscopie Raman. La microspectroscopie Raman est réalisée sur le même échantillon que celui utilisé pour qBEI après un meulage et un polissage rapides de surface afin d’éliminer la couche de carbone conductrice. En microspectroscopie Raman, les spectres sont acquis à chaque emplacement de pixel. Des exemples de spectres Raman bruts non traités et traités sont fournis à la figure 4. Chaque spectre contient des informations sur la composition du pixel analysé et comprend des pics liés à la résine d’enrobage, dans ce cas, le pMMA, la phase minérale, les pics v1PO4 et v1CO3, et la phase organique, les pics Pro, Hyp, CML, Amide III, PG, CH2, Pen. et Amide I. Dans l’exemple de la figure 4, le spectre non traité montre la contribution de la résine de revêtement à ~812 cm-1 et une ligne de base incurvée non nulle due à la fluorescence, bien qu’un laser rouge proche infrarouge soit utilisé. Le traitement du spectre est une condition préalable pour assurer un calcul précis des différents paramètres Raman, en particulier l’élimination de la fluorescence de fond. Lors de l’acquisition des données, l’utilisateur doit s’assurer à la fois d’un positionnement précis et d’éviter la saturation du détecteur pour confirmer la présence du pic v1PO4 situé à ~960 cm-1. Après le post-traitement, les rapports d’intensité de crête sont calculés en fonction de l’emplacement du mode vibratoire caractéristique.
Cependant, on peut se demander si les changements dans la composition des matériaux ont entraîné des changements dans la réponse biomécanique. Pour recueillir des informations sur la biomécanique de l’os nouvellement formé, nous effectuons systématiquement des études de nanoindentation sur le même échantillon que celui utilisé pour la microspectroscopie Raman. Les informations de mécanique tissulaire sont obtenues à partir des courbes de nanoindentation représentées par des courbes de charge en fonction de la profondeur (Figure 5). Il convient de noter que la profondeur ne revient pas à zéro à la fin de l’essai, ce qui représente la déformation plastique et les dommages permanents créés sur le matériau. Le taux de fluage par indentation est dérivé de la courbe de profondeur en fonction du temps.
Enfin, la coloration histologique est utilisée pour évaluer la réponse tissulaire au biomatériau au niveau cellulaire (Figure 6). Les colorations histologiques proposées permettent de déterminer la présence de tissu ostéoïde, mais aussi l’identification de cellules (macrophages, cellules géantes multinucléées, ostéoclastes, ostéoblastes) et la présence éventuelle d’une capsule fibreuse à l’interface avec le biomatériau. Ceci est très important pour comprendre la biocompatibilité d’un biomatériau, mais aussi la persistance d’un nouvel os lorsque le biomatériau est dégradé.
Dans l’ensemble, l’approche multi-méthodes permet une étude approfondie de la formation osseuse, de la qualité de l’os nouvellement formé et de la composition cellulaire. Lorsqu’elles sont effectuées dans l’ordre séquentiel proposé, toutes les investigations peuvent être effectuées sur le même échantillon, ce qui réduit les coûts et le temps de traitement.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67235/67235fig01.jpg"> Figure 1 : Résumé graphique. Un résumé des étapes du protocole est fourni ici. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67235/67235fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67235/67235fig02.jpg"> Figure 2 : Analyses Micro-CT et deep learning. (A) Reconstruction 3D d’images Micro-CT. (B) Segmentation osseuse et ciment : comparaison entre la segmentation manuelle et l’apprentissage profond. Barre d’échelle = 5 cm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67235/67235fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67235/67235fig03.jpg"> Figure 3 : Imagerie électronique quantitative rétrodiffusée pour déterminer la teneur en calcium. (A) L’image rétrodiffusée composée de niveaux de gris obtenue en microscopie électronique à balayage (MEB) est convertie par le logiciel d’analyse d’images en (B) une carte calcique montrant les points chauds de l’échantillon d’os. (C) La distribution de la teneur en calcium en fonction de la surface osseuse est tracée, et les trois principaux paramètres qBEI, Camean, Capeak et Cawidth, sont calculés. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67235/67235fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67235/67235fig04.jpg"> Figure 4 : Exemple de spectres Raman. (A) Spectre Raman brut non traité obtenu dans la gamme spectrale 800 - 1800 cm-1. Le fond de fluorescence est clairement visible car les spectres ne partent pas de 0. L’apport de résine (pMMA) est clairement visible à ~812 cm-1. (B) Spectre traité. La position des différents modes vibratoires d’intérêt est indiquée sur le spectre. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67235/67235fig04large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67235/67235fig05.jpg"> Figure 5 : Étude des propriétés mécaniques des tissus par nanoindentation. (A) Le dispositif de nanoindentation est composé d’une partie optique utilisée pour définir l’emplacement de la région d’intérêt à la surface du bloc d’échantillon, puis le bloc est traduit sous la partie d’indentation. (B) La charge en fonction du temps et la profondeur en fonction du temps sont tracées pendant l’essai d’indentation et sont utilisées pour générer la (C) en fonction de la courbe de profondeur. Dans cet exemple, la profondeur choisie a été fixée à 400 nm. La charge maximale (Lm), la profondeur à la fin de la charge (hl), la profondeur après la période de pause (hm), la pente du segment de déchargement (S) et la surface sous la phase de chargement-déchargement de l’essai (Wplast) sont dérivées de la courbe de charge en fonction de la profondeur et sont utilisées pour calculer les différents paramètres de nanoindentation. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67235/67235fig05large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67235/67235fig06.jpg"> Figure 6 : Analyse histologique d’explants ostéochondrales traités au ciment après 28 jours de culture. (A) La coloration Movat met en évidence la structure tissulaire, y compris l’os et le ciment comblant le défaut. (B) La coloration HES illustre l’intégration tissulaire et la réponse cellulaire autour du ciment. Barre d’échelle : 2,5 mm. (C) Grossissement de la zone mise en évidence en (B), qui détaille l’interface entre le ciment et les tissus environnants, où l’on peut observer des cellules envahissant le ciment. Barre d’échelle : 500 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67235/67235fig06large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>

Caractérisation complète de la minéralisation tissulaire dans un modèle ex vivo

The extensive characterization of tissue mineralization in the context of bone regeneration represents a significant challenge, given the numerous ...

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Visualisation de volume non destructifs peuvent être atteints que par des techniques tomographiques, dont le plus efficace est la tomographie aux rayons X micro ordinateur (TAO).

High Resolution Imaging 3D des Ex-Vivo Échantillons biologiques par Micro CT

Les modèles animaux sont fréquemment utilisés pour étudier la métastase du cancer de l'os. Dans ce protocole, nous allons décrire deux méthodes courantes de inoculation de la tumeur pour les études de métastases osseuses et décrire brièvement quelques-unes des analyses utilisés pour surveiller et quantifier ces modèles.

Modèles de métastases osseuses

Dans cette vidéo, nous décrivons une méthode de détection des dépôts de calcium sécrétés par les ostéoblastes à l’aide d’un colorant anionique, le rouge d’alizarine S. Les ostéoblastes cultivés sont d’abord colorés, puis le colorant est récupéré pour la quantification colorimétrique des dépôts de calcium ou du degré de minéralisation des ostéoblastes.

Dosage de minéralisation in vitro : méthode colorimétrique pour quantifier les dépôts de calcium ostéoblastique sur un substitut de greffe osseuse par coloration et extraction au rouge d’alizarine

Dans ce manuscrit, nous présentons une plateforme de cryohistologie semi-automatisée à haut débit pour produire des images composites alignées de plusieurs mesures de réponse à partir de plusieurs séries d’imagerie fluorescente sur des coupes congelées de tissus minéralisés.

À haut débit, multi-images Cryohistology de minéralisés Tissues

Nous présentons un protocole pour comparer l’état de minéraux dans les vésicules, sortis deux lignées de cellules d’os humains : hFOB 1.19 et Saos-2. Leurs profils de minéralisation ont été analysés par l’alizarine rouge-S (AR-S), de coloration, ultraviolette visualisation de lumière (UV), imagerie de microscopie électronique (met) de transmission et microanalyse à rayons x dispersive en énergie (EDX).

Analyse des minéraux produits par hFOB 1.19 et Saos-2 cellules à l’aide de microscopie électronique à Transmission avec Energy Dispersive x-ray Microanalysis

Les maladies cardiovasculaires sont la principale cause de décès dans le monde. La calcification vasculaire contribue considérablement au fardeau de la morbidité et de la mortalité cardiovasculaires. Ce protocole décrit une méthode simple pour quantifier la précipitation du calcium médiée par les cellules musculaires lisses vasculaires in vitro par imagerie fluorescente.

Une méthode biologique semi-automatisée et reproductible pour quantifier le dépôt de calcium in vitro

Ici, nous décrivons un système microphysiologique standardisé facile à mettre en œuvre qui reflète la complexité de la structure in vivo de la moelle osseuse humaine, fournissant un modèle pertinent pour étudier finement un large éventail d’événements normaux et pathologiques.

Un modèle 3D de moelle osseuse humaine pour étudier la dynamique et les interactions entre les cellules résidentes dans des contextes physiologiques ou tuboraux

Cet article présente la méthodologie pour obtenir et évaluer la calcification vasculaire en isolant les aortes murines suivie de l’extraction des vésicules extracellulaires calcifiées pour observer le potentiel de minéralisation.

Analyse de la calcification vasculaire extracellulaire à médiation vésiculaire à l’aide de modèles in vitro et in vivo

Ce protocole présente une méthode économique et efficace pour l’évaluation quantitative de la microarchitecture osseuse dans un modèle murin d’ostéoporose en combinant la coloration à l’hématoxyline-éosine (HE) et les techniques de micro-tomodensitométrie (Micro-CT).

Évaluation de la microarchitecture de l’os trabéculaire dans un modèle murin d’ostéoporose

Nous proposons un protocole pour évaluer la régénération osseuse à différents niveaux hiérarchiques. Cette approche multimodale permet une analyse structurelle sur différentes échelles de longueur, répondant efficacement aux défis de la préparation de l’échantillon. Il offre également un flux de travail fiable pour évaluer l’efficacité des biomatériaux dans la promotion de la régénération osseuse.

Approche multimodale pour évaluer la régénération osseuse et la performance de l’échafaudage

Ce protocole décrit la fabrication de constructions osseuses 3D utilisant des ostéocytes humains intégrés dans des hydrogels de gélatine méthacrylée (GelMA) complétés par une matrice extracellulaire décellularisée. La méthode est peu coûteuse, évolutive et compatible avec le matériel de laboratoire de base, offrant une plateforme translationnelle pour étudier les processus de maladies musculosquelettiques.

Une plateforme de culture osseuse 3D utilisant des ostéocytes humains et une matrice extracellulaire décellularisée pour modéliser les maladies musculosquelettiques

Découvrez la caractérisation complète de la minéralisation tissulaire pour la régénération osseuse en utilisant un modèle ex vivo. Cette approche multimodale combine micro-CT, nanoindentation et spectroscopie Raman pour évaluer la formation osseuse.

Caractérisation complète de la minéralisation tissulaire dans un modèle ex vivo

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