Modélisation du glycocalyx endothélial post-pneumonectomie dans une puce fluidique 3D - une approche de fabrication d’un système d’organe sur puce vasculaire

Le laboratoire Mensah se concentre sur la recherche vasculaire et développe de nouvelles techniques pour étudier le glycocalyx endothélial et son rôle dans les maladies vasculaires. Les développements récents comprennent la création de modèles in vitro plus avancés pour la recherche sur les glycocalyx et la recherche de stratégies thérapeutiques pour cibler la santé et la réparation des glycocalyx endothéliales dans les maladies. Les défis expérimentaux comprennent des modèles in vitro incomplets, qui ne parviennent pas à reproduire avec précision le glycocalyx sain, ainsi que des techniques de quantification et de mesure difficiles.

Notre contribution actuelle au domaine a élargi la compréhension actuelle du glycocalyx endothélial, en particulier dans son rôle dans les métastases cancéreuses, la régénération du glycocalyx endommagé et les interactions avec les récepteurs de surface vasculaire. Notre méthode présente une méthode peu coûteuse et efficace pour créer des systèmes vasculaires d’organe sur puce qui expriment un glycocalyx endothélial plus développé et biomimétique par rapport aux techniques conventionnelles. Pour commencer, pesez 10 parties de base en élastomère de silicone dans un tube à centrifuger de 50 millilitres.

Versez une partie d’agent de durcissement dans le tube contenant la base en élastomère de silicone jusqu’à un volume final de 30 millilitres. Mélangez soigneusement pour obtenir une solution uniforme. Versez maintenant la solution bien mélangée dans les moules, puis placez les moules dans une chambre à vide pour dégazer le PDMS pendant 30 à 60 minutes ou jusqu’à ce qu’il ne reste plus de bulles.

Retirez le PDMS dégazé de la chambre à vide et laissez-le durcir à température ambiante pendant 48 heures. Extrayez le PDMS durci du moule PLA. Placez ensuite deux morceaux de ruban adhésif double face dans chaque plaque de culture cellulaire.

Placez ensuite chaque moitié vasculaire PDMS sur le ruban dans sa propre boîte de culture cellulaire. Placez plusieurs gouttes de 30 microlitres de fibronectine le long de la vascularisation PDMS à l’aide d’une micropipette. Inclinez le PDMS selon vos besoins et utilisez une pointe de pipette pour recouvrir uniformément la surface.

Après une incubation de 30 minutes, aspirez la solution de fibronectine du PDMS. Laissez ensuite les pièces sécher à l’air libre à l’intérieur de l’armoire. Placez des bouchons imprimés en 3D à chaque extrémité des moitiés vasculaires PDMS pour éviter les fuites de suspension cellulaire, en utilisant deux bouchons par pièce.

À l’aide d’une micropipette, semez 300 microlitres de suspension de cellules HLMVEC dans chaque morceau de PDMS et incuberez. Remettez ensuite les moitiés dans l’armoire et retirez les quatre bouchons. Ajouter un milieu de culture HLMVEC pour immerger les moitiés vasculaires du PDMS et incuber à nouveau pendant six à 10 heures.

Aspirez maintenant le milieu HLMVEC de la boîte de Pétri contenant les moitiés vasculaires. Placez chaque moitié PDMS dans les blocs de polycarbonate, en assurant un bon alignement. Appliquez du mastic silicone aux extrémités du système vasculaire PDMS.

Insérez un tube d’un pouce de long dans les deux extrémités de la pièce PDMS inférieure. Retournez ensuite le bloc acrylique supérieur contenant la moitié supérieure du PDMS sur le bloc acrylique inférieur. Boulonnez les blocs d’acrylique ensemble, en vous assurant que le bloc fileté est en bas.

Bouchez les extrémités libres du tube à l’aide de bouchons imprimés en 3D. Retirez un bouchon et injectez doucement 500 microlitres de milieu de culture HLMVEC dans le système vasculaire à l’aide d’une micropipette. Inclinez-le pour éliminer les bulles d’air, puis remplacez la prise.

Apportez la puce assemblée et les composants stériles dans l’enceinte de biosécurité. Connectez tous les tubes et assemblez le système d’écoulement, en vous assurant que le tube d’entrée se connecte au fond du réservoir de la seringue pour faciliter l’écoulement par gravité. Maintenant, amorcez doucement le système d’écoulement avec le fluide HLMVEC.

Utilisez une pipette sérologique de 50 millilitres. Injectez 30 millilitres de fluide dans le haut du réservoir de la seringue et actionnez la pompe péristaltique à basse vitesse pour remplir le tube. Lavez chaque moitié vasculaire PDMS dans du PBS pendant cinq minutes, en ajoutant suffisamment de solution pour immerger complètement la section vasculaire.

La simulation de fluide a montré une contrainte de cisaillement significativement élevée aux bifurcations des vaisseaux dans le modèle de pneumonectomie par rapport au modèle de contrôle. La microscopie à fond clair a confirmé une fixation uniforme des cellules HLMVEC dans des conditions statiques et d’écoulement à 93,1 millilitres par minute après 24 heures. L’imagerie par fluorescence de la bifurcation de l’entrée a montré des couches cellulaires intactes et bien réparties dans les modèles de contrôle et de pneumonectomie.

L’imagerie immédiatement après la deuxième bifurcation a révélé une perte de cellules substantielle dans les modèles de contrôle et de pneumonectomie. Les cellules sont restées adhérentes et ont montré une coloration constante dans la région en aval de la deuxième bifurcation dans les deux modèles. Des noyaux uniformes colorés au DAPI dans les modèles vasculaires ont indiqué que la confluence était maintenue malgré l’exposition au flux.

Un premier essai sur un modèle de contrôle a entraîné une distribution inégale des cellules en raison des bulles d’air introduites lors de l’amorçage du système.