Optimisation de la préparation de l’antigène pour le dosage de l’inhibition de l’hémagglutination de la sérologie du virus de la maladie de Newcastle

Notre recherche se concentre sur l’optimisation de la préparation de l’antigène pour les tests d’inhibition de l’hémagglutination. Pour améliorer la précision de la détection des anticorps NDV, nous proposons une méthode de préparation rapide et précise de la solution d’antigène 4-HAU. Le dosage HI reste la méthode la plus courante pour la détection des anticorps NDV.

Cependant, de nouvelles technologies, y compris les systèmes automatisés de manipulation des liquides, les plateformes sérologiques à haut débit et les outils d’imagerie avancés, peuvent également être intégrées au test HI. Ils permettent une analyse plus rapide et plus précise, en particulier lors de la manipulation de lots de grande taille. Nous avons établi une méthode efficace pour une détection plus précise des titres d’AH de la solution mère d’antigène, combinée à une méthode rigoureuse de contre-titrage et à un processus d’ajustement bien défini.

Cette approche fournit une méthode précise et minimise les tâches de calcul, augmentant l’efficacité et la fiabilité des tests, et contribuant à améliorer la surveillance et le contrôle des maladies dans les populations de volailles. La suspension de globules rouges de poulet et la lecture visuelle des résultats de HA HI contribuent toujours à la variabilité. Notre laboratoire se concentrera sur la normalisation de la suspension des globules rouges et l’exploration de la vision par ordinateur ou d’autres méthodes pour numériser les résultats du test HA HI, réduisant ainsi la subjectivité et améliorant la cohérence.

Pour commencer, ajoutez trois millilitres de solution Alserver dans un tube à centrifuger conique stérile de 15 millilitres. Prélevez un millilitre de sang dans la veine de l’aile de chacun des trois poulets non immunisés. Ensuite, transférez immédiatement le sang collecté dans le tube anticoagulant et mélangez doucement le contenu par inversion.

Remplissez le tube avec du PBS stérile pour porter le volume total à 12 millilitres. Mélangez doucement la solution pour assurer une répartition uniforme des composants. Ensuite, placez le tube dans une centrifugeuse équipée d’un rotor horizontal et centrifugez à 500 G pendant 10 minutes.

Après la centrifugation, retirez soigneusement le surnageant et la couche de globules blancs du tube. À l’aide d’une pipette, inversez la pipette d’un millilitre de pastille de globules rouges dans 99 millilitres de solution stérile de PBS pour préparer une suspension à 1 % de globules rouges. Pour reconstituer l’antigène lyophilisé, ajoutez deux millilitres de PBS stérile dans l’ampoule qui le contient.

Secouez doucement l’ampoule pour dissoudre complètement le contenu et laissez-la reposer pendant deux à trois minutes pour minimiser la formation de bulles. Aliquote a reconstitué la solution dans des tubes à centrifuger de 1,5 millilitre et l’a conservée dans un congélateur réglé à moins 20 degrés Celsius jusqu’à utilisation. Pour commencer, distribuez respectivement 40, 80, 120 et 160 microlitres de PBS dans quatre puits adjacents d’une plaque de microtitration jetable à fond en V de 96 puits.

Ajoutez 20 microlitres de l’antigène reconstitué dans chaque puits et pipetez 10 fois de haut en bas pour créer une dilution. Ensuite, étiquetez clairement une nouvelle plaque de microtitration pour les étapes suivantes et distribuez 25 microlitres de PBS dans chaque puits en rangées un à cinq. À l’aide d’une pipette multicanaux, placez 25 microlitres de solutions d’antigène diluées dans les premiers puits des rangées un à cinq.

Pipetez le contenu de haut en bas au moins cinq fois pour assurer une distribution uniforme. Ensuite, transférez 25 microlitres du premier puits de chaque rangée au deuxième puits, en mélangeant soigneusement. Jetez 25 microlitres de la solution finale après la 11ème colonne.

Ensuite, ajoutez respectivement 25 microlitres de PBS et 1 % de suspension de globules rouges de poulet dans chaque puits, en commençant par les puits contenant la plus faible concentration d’antigène. Placez la plaque de microtitration sur l’agitateur de microplaques pour bien mélanger. Laissez la plaque intacte sur la paillasse à température ambiante pendant environ 30 minutes pour permettre aux globules rouges de la 12e colonne de se déposer complètement.

Calculer le facteur de dilution pour la préparation de la solution d’antigène 4-HAU à l’aide de la formule illustrée ici. Déterminez le volume total de la solution 4-HAU nécessaire et les volumes requis de la solution mère d’antigène et du PBS à l’aide de la formule donnée. À l’aide d’une pipette, transférez le volume calculé de PBS dans un récipient.

Ajouter le volume correspondant de solution mère d’antigène et bien mélanger pour préparer la solution d’antigène 4-HAU. Ensuite, distribuez 25, 50, 75, 100, 125 et 150 microlitres de PBS dans six puits adjacents d’une plaque de microtitration. Ajoutez 25 microlitres de la solution d’antigène 4-HAU dans chaque puits et pipetez 10 fois de haut en bas pour assurer une dilution correcte.

À l’aide d’une pipette multicanaux, transférez 25 microlitres de chaque solution d’antigène diluée de la rangée initiale dans les puits d’une autre rangée. Ensuite, ajoutez 25 microlitres de PBS dans chaque puits, suivis de 25 microlitres d’une suspension de poulet RBC à 1 % dans chaque puits. Placez la plaque sur un agitateur de microplaques pendant environ 20 secondes pour bien mélanger le contenu.

Observez attentivement les modèles d’hémagglutination dans les puits et notez les résultats.