Name: Optimisation de la préparation de l’antigène pour le dosage de l’inhibition de l’hémagglutination de la sérologie du virus de la maladie de Newcastle (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-01-24T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 4 s
Description: Découvrez une méthode optimisée de préparation d'antigène 4-HAU pour le dosage d'inhibition d'hémagglutination du virus de Newcastle. Cette approche améliore la précision de détection des anticorps et renforce la surveillance sanitaire aviaire.

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L’approbation du protocole a été accordée par le comité institutionnel local de soin et d’utilisation des animaux. Toutes les procédures impliquant des antigènes viraux vivants et des échantillons de sérum clinique ont été effectuées dans un laboratoire de biosécurité de niveau 2, conformément aux protocoles de sécurité établis.
1. Préparation de la suspension de globules rouges de poulet 1 %
<ol>
	<li>Ajouter 3 mL de la solution d’Alserver (anticoagulant) dans un tube à centrifuger conique stérile de 15 mL.</li>
	<li>Prélever 1 mL de sang dans la veine de l’aile de chacun des trois poulets non immunisés (sans anticorps contre le NDV). Transférez immédiatement le sang dans le tube contenant l’anticoagulant et mélangez délicatement.</li>
	<li>Remplissez le tube avec une solution saline stérile 1x tamponnée au phosphate (PBS, pH 7,2-7,4) jusqu’à un volume total de 12 mL, et mélangez délicatement. Centrifugeuse à 500 × g pendant 10 min à l’aide d’un rotor horizontal.</li>
	<li>Retirez avec précaution le surnageant et la couche de globules blancs. Répétez les étapes 1.3 et 1.4 2 fois pour obtenir la pastille de globule rouge.</li>
	<li>Pipeter 1 mL de globules rouges dans 99 mL de PBS stérile, pour préparer une suspension de globules rouges à 1 %. REMARQUE : Le volume requis de la suspension de globules rouges de poulet à 1 % est estimé à 3 mL/plaque (25 μL/puits x 96 puits x 1,25 = 3,0 mL ; où 1,25 tient compte du gaspillage de pipetage pour assurer un volume suffisant).</li>
</ol>
2. Reconstitution de l’antigène ou du sérum lyophilisé
<ol>
	<li>Ajouter 2 mL de PBS stérile dans l’ampoule contenant l’antigène ou le sérum lyophilisé. Secouez doucement l’ampoule et laissez-la reposer pendant 2-3 minutes pour minimiser les bulles et assurer une dissolution complète. REMARQUE : Suivez les instructions spécifiques du fabricant, car différents types de matériaux lyophilisés n’ont pas été comparés dans cette étude.</li>
	<li>Aliquote la solution reconstituée dans des tubes à centrifuger de 1,5 mL et congeler à -20 °C jusqu’à utilisation. REMARQUE : Redéterminez le titre d’HA chaque fois que l’antigène est décongelé et utilisé, ou lorsqu’une nouvelle suspension de globules rouges est préparée.</li>
</ol>
3. Titrage AH des antigènes
<ol>
	<li>Distribuez respectivement 40, 80, 120 et 160 μL de PBS dans quatre puits adjacents d’une plaque de microtitration jetable à fond en V de 96 puits, puis ajoutez 20 μL d’antigène dans chaque puits et mélangez en pipetant 10 fois vers le haut et vers le bas pour obtenir des dilutions de 1:3, 1:5, 1:7 et 1:9, respectivement. Un schéma de l’opération de dilution est présenté à la figure 1.</li>
</ol>
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67256/67256fig1.jpg"> 
Figure 1 : Schéma de principe illustrant la procédure de dilution de la solution d’antigène dans le dosage de l’hémagglutination. La solution d’antigène est diluée dans du PBS dans des rapports de 1:3, 1:5, 1:7 et 1:9, respectivement. Le PBS dans les puits ou les tubes à centrifuger est représenté en bleu, tandis que les antigènes sont représentés en vert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67256/67256fig1large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<ol start="2">
	<li>Étiquetez une nouvelle plaque de microtitration. Ajouter 25 μL de PBS dans chaque puits des rangées 1 à 5.</li>
	<li>Placez 25 μL de solutions d’antigène diluées dans les premiers puits des rangées 1 à 5 à l’aide d’une pipette multicanaux, et mélangez en pipetant de haut en bas au moins 5 fois.</li>
	<li>Transférez 25 μL du premier puits de chaque rangée au deuxième puits, en mélangeant soigneusement. Continuez le transfert d’un puits à l’autre, jusqu’à la 11e colonne, pour créer des dilutions en série doubles (1:2 à 1:2048). Jeter 25 μL après la 11e colonne.</li>
	<li>Ajouter 25 μL de PBS dans chaque puits, en commençant par les puits contenant la plus faible concentration d’antigène.</li>
	<li>Ajouter 25 μL de suspension de globules rouges de poulet à 1 % dans chaque puits, en commençant encore une fois par les puits contenant la plus faible concentration d’antigène.</li>
	<li>Agitez la plaque sur un agitateur de microplaques pendant ~20 s pour bien mélanger.</li>
	<li>Laissez-le tranquillement sur la paillasse à température ambiante (20-25 °C) pendant ~30 min jusqu’à ce que le RBC de la 12e colonne se soit complètement stabilisé. Pour la disposition des plaques, reportez-vous à la figure 2.</li>
</ol>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67256/67256fig2.jpg"> 
Figure 2 : Schéma d’une microplaque utilisée dans le dosage de l’hémagglutination. La première colonne des rangées 1 à 5 contient des dilutions initiales non diluées et diverses dilutions de la solution d’antigène, suivies d’une dilution en série en deux fois de gauche à droite jusqu’à la colonne 11. Le contrôle PBS est placé dans la dernière colonne. Le gradient de l’obscurité à la lumière indique une diminution de la concentration d’antigène. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67256/67256fig2large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<ol start="9">
	<li>Lisez et enregistrez les résultats. L’HA est déterminé en inclinant la plaque de 90° pendant ~25 s et en observant la présence ou l’absence d’écoulement en forme de larme des globules rouges. La dilution la plus élevée montrant une hémagglutination complète (pas de coulée), représente 1 unité HA. Les puits de la 12e colonne servent de contrôles globaux (négatifs).</li>
	<li>Calculer le titre d’AH de chaque rang à l’aide du tableau 1, dont le maximum est utilisé pour la préparation de la solution d’antigène 4-HAU. Par exemple, si a, b, c, d et e sont respectivement égaux à 9, 8, 7, 6, 6, alors 3 x 28 = 768 est la valeur maximale et est le titre HA du stock d’antigènes.</li>
</ol>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antigènes</td>
			<td>Colonne de dilution la plus élevée de l’AH complet</td>
			<td>Titre HA du stock non dilué</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stock non dilué</td>
			<td>un</td>
			<td>2a</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dilution 3 fois</td>
			<td>b</td>
			<td>3 x 2b</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dilution 5 fois</td>
			<td>c</td>
			<td>5 x 2c</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dilution 7 fois</td>
			<td>d</td>
			<td>7 x 2d</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dilution 9 fois</td>
			<td>e</td>
			<td>9 x 2e</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tableau 1 : Résultats de l’analyse de l’AH et calcul du titre d’AH de la solution mère.
4. Préparation de la solution de l’antigène 4-HAU
<ol>
	<li>Calculer le facteur de dilution pour la préparation de la solution de l’antigène 4-HAU : <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/67256/67256eq3.jpg">. Déterminez le volume total de 4-HAU nécessaire : V = 3 ml x Nombre de microplaques. Ensuite, calculez les volumes requis de solution mère d’antigène : <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/67256/67256eq5.jpg">, et PBS : Vp = V - Va. REMARQUE : Les volumes sont mesurés en millilitres. Estimer à 3 mL par plaque de microtitration de la 4-HAU (25 μL/puits x 96 puits x 1,25 = 3 mL).</li>
	<li>Pipeter le volume calculé de PBS dans un récipient, puis ajouter le volume correspondant de solution mère d’antigène et bien mélanger pour obtenir la solution d’antigène 4-HAU. REMARQUE : La solution d’antigène 4-HAU doit être utilisée dès que possible.</li>
</ol>
5. Titrage inverse de la solution d’antigène 4-HAU
<ol>
	<li>Distribuer 25, 50, 75, 100, 125 et 150 μL de PBS dans six puits adjacents d’une plaque de microtitration, puis ajouter 25 μL de la solution d’antigène 4-HAU dans chaque puits et mélanger en pipetant de haut en bas 10x. REMARQUE : Diluez la solution d’antigène 4-HAU avec du PBS à des dilutions de 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6 et 1:7. Un schéma de l’opération de dilution est présenté à la figure 3.</li>
</ol>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67256/67256fig3.jpg"> 
Figure 3 : Schéma de principe de la procédure de dilution de la solution de 4 unités d’hémagglutination en contre-titrage. La solution de travail 4-HAU est diluée avec du PBS dans des rapports de 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6 et 1:7. Le PBS est représenté en bleu et les antigènes en vert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67256/67256fig3large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<ol start="2">
	<li>Transférez 25 μL de chaque solution d’antigène diluée dans les puits d’une autre rangée à l’aide d’une pipette multicanaux. Ajouter 25 μL de PBS à un témoin supplémentaire ainsi qu’à un témoin négatif.</li>
	<li>Ajouter 25 μL de PBS dans chaque puits, puis ajouter 25 μL de globules rouges de poulet à 1 % dans chaque puits.</li>
	<li>Agitez la plaque sur un agitateur de microplaques pendant ~20 s pour mélanger.</li>
	<li>Laissez-le tranquille sur la paillasse à température ambiante (20-25 °C) pendant ~30 min jusqu’à ce que les globules rouges du témoin négatif soient complètement installés.</li>
	<li>Lisez et enregistrez les résultats. REMARQUE : Le puits de contrôle négatif ne doit montrer aucun HA. Idéalement, la dilution 1:4 est exactement la dilution la plus élevée avec de l’AH complet. Si le titre de la solution de 4-HAU est supérieur à 4, la dilution la plus élevée peut être de 1:5, 1:6 ou 1:7 ; s’il est inférieur, il peut être de 1:2 ou de 1:3. Une présentation schématique du contre-titrage et des résultats représentatifs est présentée à la figure 4.</li>
</ol>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67256/67256fig4.jpg"> 
Figure 4 : Schéma des puits pour le contre-titrage et le résultat représentatif. La solution de travail diluée de 4-HAU est transférée dans un nouveau rang, avec l’ajout d’un témoin PBS supplémentaire. Le gradient du vert foncé au vert clair indique une concentration d’antigène élevée à faible. Les résultats représentatifs démontrent que la dilution 1:4 est la dilution la plus élevée montrant une hémagglutination complète. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67256/67256fig4large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<ol start="7">
	<li>Ajustez ou reformulez la solution d’antigène 4-HAU si nécessaire. REMARQUE : Si le volume de la solution d’antigène 4-HAU utilisée pour le contre-titrage est de ≤1 % du volume total (le volume de la solution d’antigène 4-HAU ≥ 15 mL), reportez-vous au tableau 2 pour des ajustements spécifiques. Par exemple, si la dilution la plus élevée avec de l’AH complet est de 1:2, le titre de la solution d’antigène 4-HAU est maintenant de 2, et un volume égal d’antigène doit être ajouté comme dans la préparation précédente de la solution d’antigène 4-HAU. À l’inverse, si la dilution la plus élevée de l’AH complet est de 1:6, le titre est maintenant de 6 et la moitié du volume de PBS doit être reconstituée. Si le volume utilisé pour le contre-titrage dépasse 1 % du total (le volume de la solution d’antigène 4-HAU &lt; 15 mL), reformuler la solution d’antigène 4-HAU en utilisant le facteur de dilution corrigé. Voir le tableau 3 pour les corrections spécifiques. Par exemple, si la dilution la plus élevée de l’AH complet est de 1:2, le titre de la solution de l’antigène 4-HAU est maintenant de 2 et le facteur de dilution doit être ajusté à 1/2 de l’original. Inversement, si la dilution la plus élevée de l’AH complet est de 1:6, le titre de la solution de l’antigène 4-HAU est maintenant de 6 et le facteur de dilution est ajusté à 3/2 de l’original.</li>
</ol>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Titre HA du titrage inverse</td>
			<td>Réapprovisionnement en antigène ou PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1:2</td>
			<td>Va</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1:3</td>
			<td>Va/3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1:5</td>
			<td>Vp/4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1:6</td>
			<td>V/2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1:7</td>
			<td>3V/4</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tableau 2 : Tableau de référence pour l’ajustement de la concentration de 4-HAU en fonction des résultats de contre-titrage. Va et Vp représentent respectivement les volumes d’antigène et de PBS utilisés dans la formulation de la solution d’antigène 4-HAU.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Titre HA du titrage inverse</td>
			<td>Correction du facteur de dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1:2</td>
			<td>J/2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1:3</td>
			<td>3D/4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1:5</td>
			<td>5J/4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1:6</td>
			<td>3D/2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1:7</td>
			<td>7J/4</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tableau 3 : Tableau de référence de la correction du facteur de dilution pour la repréparation de l’antigène 4-HAU. D représente le facteur de dilution précédemment utilisé dans la préparation de l’antigène 4-HAU.
6. Préparation du sérum
<ol>
	<li>Prélever ~1 mL de sang sur les ailes de poulet sans utiliser d’anticoagulant.</li>
	<li>Transférez le sang dans un tube à centrifuger de 1,5 mL et incubez à 37 °C pendant ~2 h. Centrifugez à 3 000 x g pendant 10 min et aspirez soigneusement le surnageant dans un nouveau tube.</li>
</ol>
7. Dosage HI
<ol>
	<li>Étiquetez les plaques de microtitration selon la disposition du test. Ajoutez 25 μL de PBS dans chaque puits des colonnes 1 à 11 et 50 μL dans les puits de la colonne 12 à l’aide d’une pipette multicanaux.</li>
	<li>Ajouter 25 μL de sérum dans le premier puits de chaque rangée, y compris les rangées de contrôle sérique positives et négatives. Mélangez soigneusement en pipetant de haut en bas au moins 5 fois.</li>
	<li>Transférez 25 μL du premier puits de chaque rangée au deuxième puits et mélangez soigneusement. Continuez à transférer et à mélanger du deuxième puits au troisième, et ainsi de suite, jusqu’à la 10ème colonne. Jeter 25 μL de liquide du puits dans la 10e colonne après avoir mélangé.</li>
	<li>Ajouter 25 μL d’antigène 4-HAU dans chaque puits des colonnes 1 à 11 dans le sens d’une concentration sérique faible à élevée.</li>
	<li>Agitez la plaque sur un agitateur de microplaques pendant ~20 s. Laissez-le tranquille sur la paillasse pendant ~30 min.</li>
	<li>Ajouter 25 μL de globules rouges de poulet à 1 % dans chaque puits dans le sens d’une concentration sérique faible à élevée.</li>
	<li>Agitez la plaque sur un agitateur de microplaques pendant ~20 s pour bien mélanger. Laissez-le tranquille sur la paillasse pendant ~30 min jusqu’à ce que les globules rouges des puits de contrôle PBS soient complètement installés.</li>
	<li>Lisez et enregistrez les résultats. REMARQUE : Le titre HI est la dilution sérique la plus élevée qui inhibe complètement l’hémagglutination de l’antigène 4-HAU. Un écoulement en forme de larme des globules rouges peut être observé dans la dernière colonne de chaque rangée, en inclinant la plaque de 90° pendant 25 s. L’AH complet (pas de coulée) peut être observé dans l’avant-dernier puits à partir de la fin de chaque rangée. Pour être valides, il faut que le titre d’IH du témoin sérique positif se situe à moins d’une dilution du titre d’IH connu ; le titre HI du témoin sérique négatif est ≤ 2 log2 ; et l’absence d’auto-HA du contrôle des GR. Pour un schéma de principe du flux de travail du test HA, voir la figure 5.</li>
</ol>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67256/67256fig5.jpg"> 
Figure 5 : Schéma de principe du flux de travail du dosage de l’hémagglutination. Le PBS est représenté en bleu, le sérum en jaune, la solution de l’antigène 4-HAU en vert et la suspension de globules rouges de poulet à 1 % en rouge. Les flèches indiquent l’ordre de distribution du liquide. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67256/67256fig5large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>

<meta charset="utf8"></head><body>Préparation rationalisée de l’antigène 4-HAU pour une détection précise des anticorps NDV

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<li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+HN+protein+of+Newcastle+disease+virus+induces+cell+apoptosis+through+the+induction+of+lysosomal+membrane+permeabilization%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">The HN protein of Newcastle disease virus induces cell apoptosis through the induction of lysosomal membrane permeabilization.</a> PLoS Pathog. 20 (2), e1011981(2024).</li>
<li>Miller, P. J., Decanini, E. L., Afonso, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Newcastle+disease%3A+evolution+of+genotypes+and+the+related+diagnostic+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Genet+Evol%22%5BJournal%5D)">Newcastle disease: evolution of genotypes and the related diagnostic challenges.</a> Infect Genet Evol. 10 (1), 26-35 (2010).</li>
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</ol>

La méthode optimisée proposée dans cet article présente une approche permettant de préparer avec précision la solution de l’antigène 4-HAU. Bien que les lignes directrices de l’OIE et de l’UE suggèrent des dilutions initiales pour le titrage de l’HA, elles ne fournissent pas de détails précis sur les taux de dilution à utiliser ni ne proposent de méthodologies spécifiques11,12. De plus, bien que la FAO et l’OIE recommandent le contretitrage comme moyen d’améliorer la précision de la ...

<table><tbody><tr><td>&nbsp ; Tube à centrifuger stérile (15 mL)&nbsp ;</td><td>Labshark</td><td>130201030</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse de table à basse vitesse refroidie à l’air&nbsp ;</td><td>Titan</td><td>LDC-5</td><td></td></tr><tr><td>Alserve’s Solution</td><td>Sangon Biotech</td><td>E607058</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse</td><td>DLAB</td><td>9032002121</td><td></td></tr><tr><td>Pipette Pasteur jetable</td><td>Titan</td><td>SWXG-004</td><td></td></tr><tr><td>Seringue stérile jetable (1 mL)</td><td>Beyotime</td><td>FS801-30PCS</td><td></td></tr><tr><td>Plaque de microtitration jetable à fond en V (96 puits)</td><td>Labshark</td><td></td><td></td>130207001</tr><tr><td>Agitateur de microplaques</td><td>Jiangsu Xinkang Medical Equipment Co., Ltd</td><td>XK96-3</td><td></td></tr><tr><td>NDV HI Négatif Sérum</td><td>Qingdao Regen Centre</td><td></td><td></td>de développement de diagnostics</tr><tr><td>NDV HI Positif Sera</td><td>Qingdao Regen Centre de développement</td><td></td><td></td>de diagnostics</tr><tr><td>NDV HI Antigène</td><td>Qingdao Regen Centre</td><td></td><td></td>de développement de diagnostics</tr><tr><td>PBS Solution (1x)&nbsp ;</td><td>Adamas Life</td><td>C8020</td><td></td></tr><tr><td>Tube à centrifuger stérile (1,5 mL)</td><td>Labshark</td><td>130201012</td><td></td></tr></tbody></table>

optimisation de la préparation de l’antigène pour le dosage de l’inhibition de l’hémagglutination de la sérologie du virus de la maladie de newcastle

Optimization of Antigen Preparation for Hemagglutination Inhibition Assay of Newcastle Disease Virus Serology

Validation du titre de la solution d’antigène 4-HAU formulée à l’aide de la méthode optimisée L’étude a utilisé diverses dilutions de la solution mère d’antigène pour déterminer avec précision le titre d’HA, facilitant ainsi le calcul du facteur de dilution pour la préparation de la solution d’antigène 4-HAU. Les résultats révèlent que la méthode optimisée est à la fois efficace et précise, réduisant le nombre de procédures répétitives de contre-titrage et d’ajustement. Dans le premier scénario, un ti...

Optimisation de la préparation de l’antigène pour le dosage de l’inhibition de l’hémagglutination de la sérologie du virus de la maladie de Newcastle

Accurate assessment of Newcastle disease virus (NDV) antibody titers is crucial for effective poultry disease control and surveillance. This article ...

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Research

Recherche

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie et infection

La vidéo présente un test d’inhibition de l’hémagglutination pour détecter les anticorps sériques dirigés contre des antigènes spécifiques. La confirmation de l’inhibition de l’hémagglutination dans le puits d’essai et de l’hémagglutination dans le puits témoin est obtenue par des motifs visuels distincts. Ce test joue un rôle crucial dans l’évaluation de la réponse immunitaire, l’efficacité des vaccins et l’étude des infections virales en virologie et en immunologie.

Le test d’inhibition de l’hémagglutination pour détecter les anticorps sériques dirigés contre un antigène cible

Cette vidéo montre des tests de microneutralisation pour mesurer les anticorps neutralisants à l’aide de cellules rénales canines de Madin-Darby surexprimant l’acide sialique lié à l’α2,6 dans le sérum humain. Ce test est souvent utilisé pour la sérologie humaine de la...

Un test de microneutralisation pour mesurer les titres d’anticorps neutralisants dans le sérum humain

Cette vidéo présente un test mesurant les titres d’anticorps inhibiteurs de la neuraminidase grippale (NA) dans un échantillon de sérum. Un échantillon de sérum contenant des anticorps contre NA est ajouté à une plaque de micropuits recouverte de fétuine. Lors de l’ajout du virus, les anticorps empêchent le NA viral de fendre le fœtuin et d’exposer sa fraction galactose. Une lectine conjuguée à la peroxydase est ensuite ajoutée, qui se lie au galactose exposé. Le titre d’anticorps inhibiteurs...

Un test pour mesurer les titres d’anticorps d’inhibition de la neuraminidase de la grippe

Virus de la maladie de Newcastle (NDV) a été largement étudiée au cours des dernières années afin de développer de nouveaux vecteurs pour la vaccination et le traitement, entre autres. Ces études ont été possibles grâce à des techniques de sauvetage virus recombinant à partir d'ADNc, comme celles que nous décrivons ici.

Sauvetage de virus de la maladie de Newcastle recombinant à partir d&#39;ADNc

Ici, nous présentons un protocole pour générer un type bivalent adénovirus 5 (Ad5) vecteur preuve-de-principe Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6 en utilisant la stratégie Antigène capside-Incorporation. Ce vecteur a été démontrée à exposer remise en forme qualitative, la capacité d'échapper sérums Ad5 positif in vitro, et l'antigénicité ainsi que l'immunogénicité des antigènes incorporés.

Utilisant la stratégie capside-Incorporation Antigen pour le développement d&#39;approches adénovirus sérotype 5 Vectored vaccins

Nous décrivons le dosage des lectines enzymatiques (ELLA) pour mesurer les titres d’anticorps inhibiteurs de la neuraminidase de la grippe (NA) dans les sérums. Le test utilise l’agglutinine d’arachide pour quantifier les résidus de galactose qui deviennent accessibles lorsque NA élimine l’acide sialique des plaques à 96 puits enrobées de fétuine.

Mesure de la grippe neuraminidase Inhibition Titres d&#39;anticorps par-enzymatique lectine Assay

Cette étude décrit un   à base d'imagerie-dosage micro-neutralisation pour analyser les relations antigéniques entre les virus. Le protocole utilise un scanner à plat et comporte quatre étapes, dont le titrage, titrage quantification, la neutralisation et la neutralisation quantification. Le test fonctionne bien avec un courant circulant de la grippe A (H1N1) pdm09, A (H3N2), et les virus B.

L&#39;optimisation d&#39;un micro-neutralisation quantitative de dosage

Les protocoles présentés décrivent comment effectuer un test d’inhibition hémagglutination afin de quantifier les titres d’anticorps spécifiques à la grippe d’échantillons de sérum des destinataires de vaccin contre la grippe. Le premier dosage détermine la concentration optimale d’antigène viral par hémagglutination. Le deuxième essai quantifie les titres d’anticorps spécifiques à la grippe par l’inhibition de l’hémagglutination.

Un test d’Inhibition (HI) hémagglutination optimisé pour quantifier les titres d’anticorps spécifiques à la grippe

Nous fournissons ici une procédure détaillée pour la production, la purification et la quantification du virus recombinant à haut titre de la maladie de Newcastle. Ce protocole donne systématiquement &gt; 6 × 109 unités formant de la plaque / mL, fournissant des quantités de virus appropriées pour les études animales in vivo . Des tests de contrôle de la qualité supplémentaires pour assurer la sécurité in vivo sont décrits.

Production du virus recombinant de la maladie de Newcastle à haut titre à partir du liquide allantoïque

Nous décrivons une méthode pour traiter et d'un écran moustiques récoltés sur le terrain pour une diversité des virus par un test de culture de cellules Vero. En employant cette technique, nous avons détecté 9 virus différents de 4 familles taxonomiques dans les moustiques collectés dans le Connecticut.

La détection de virus infectieux à partir terrain recueillies par les moustiques Assay culture cellulaire Vero

Découvrez une méthode optimisée de préparation d'antigène 4-HAU pour le dosage d'inhibition d'hémagglutination du virus de Newcastle. Cette approche améliore la précision de détection des anticorps et renforce la surveillance sanitaire aviaire.

Optimisation de la préparation de l’antigène pour le dosage de l’inhibition de l’hémagglutination de la sérologie du virus de la maladie de Newcastle (Vidéo) | JoVE Journal

Optimisation de la préparation de l’antigène pour le dosage de l’inhibition de l’hémagglutination de la sérologie du virus de la maladie de Newcastle

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