Surveillance des changements induits par l’électroporation dans la génération de potentiel d’action dans les cellules HEK à pointes Tet-On génétiquement modifiées

L’électroporation augmente temporairement la perméabilité de la membrane cellulaire au moyen d’impulsions électriques à haute tension. Il existe plusieurs traitements cliniques basés sur l’électroporation qui ciblent les cellules musculaires et neuronales en plein développement. Il est donc crucial d’étudier comment l’électroporation affecte la capacité de ces cellules excitables à déclencher des potentiels d’action.

Les expériences in vitro sont très importantes pour comprendre les effets de l’électroporation sur les cellules excitables. Cependant, les myocytes et les neurones primaires ont un profil d’expression de canaux ioniques très complexe qui rend extrêmement difficile de démêler l’interaction entre l’excitation et l’électroporation. Nous avons développé un protocole pour surveiller les changements induits par l’électroporation dans la génération de potentiel d’action à l’aide de cellules HEK à dopage tet-on.

Ces cellules expriment un complément minimum de canaux sodiques et potassiques qui les rendent excitables. Par conséquent, cette cellule a simplifié les expériences et l’analyse théorique des résultats obtenus. En utilisant notre protocole, nous avons constaté qu’une électroporation très légère peut déjà affecter considérablement l’acceptabilité des cellules.

Ces résultats ouvriront la voie à l’élaboration de modèles théoriques de l’électroporation et de l’acceptabilité cellulaire, ce qui aidera la communauté à améliorer les thérapies basées sur l’électroporation qui émergent rapidement dans le cœur, le cerveau et les muscles squelettiques. Pour commencer, pipetez un millilitre de PBS dans un puits des lames de la chambre en verre à deux puits. Ajoutez 10 microlitres de solution stérile de poly-L-lysine d’un milligramme par millilitre et mélangez bien à l’aide d’une pipette.

Incuber pendant 1,5 heure à température ambiante dans des conditions stériles dans une hotte à flux laminaire, puis retirer le PBS avec de la poly-L-lysine sans autre lavage. Pour ensemencer les cellules, préparez une dilution de une à 10 de la solution mère de doxycycline dans un milieu de culture dans un tube de 1,5 millilitre. Maintenant, retirez le milieu de culture de la fiole T-25.

Trypsinisez les cellules avec 2,5 millilitres de solution de trypsine EDTA dans un incubateur de dioxyde de carbone à 37 degrés Celsius pendant deux minutes. Ajoutez 2,5 millilitres de milieu de culture frais et pipetez doucement les cellules pour les détacher de la surface. Calculer le volume de la suspension cellulaire trypsinisée nécessaire à l’établissement de la culture.

Soustrayez le volume de suspension cellulaire précédemment calculé de 1 470 microlitres pour calculer le volume du milieu de culture. Pour préparer des échantillons avec des cellules S HEK excitables, pipetez le volume calculé du milieu de culture et de la suspension cellulaire trypsinisée dans un puits. Ajouter 30 microlitres de dilution de doxycycline.

Mélangez bien à l’aide d’une pipette douce juste avant de placer les chambres dans l’incubateur de dioxyde de carbone. Pour la préparation d’échantillons avec des cellules NS HEK non excitables, pipetez le volume calculé de milieu de culture dans un puits et ajoutez 90 % du volume calculé de suspension cellulaire pour les cellules S HEK sans doxycycline. Incuber les chambres dans un incubateur à 5 % de dioxyde de carbone à 37 degrés Celsius pendant deux à trois jours avant l’expérience.

Avant l’expérience, pipetez trois microlitres de solution mère de colorant potentiométrique dans un tube de 1,5 millilitre. Laissez le tube ouvert à température ambiante dans une hotte à flux laminaire pendant environ 15 minutes pour permettre à l’éthanol de s’évaporer et au colorant potentiométrique de sécher, puis ajoutez 997 microlitres de milieu de culture froid à quatre degrés Celsius dans le tube pour dissoudre le colorant à une concentration finale de 12 micromolaires. Ensuite, retirez le milieu de culture du puits.

Ajoutez un millilitre de solution de colorant potentiométrique aux cellules. Réfrigérez les cellules à quatre degrés Celsius et incuberez-les pendant 20 minutes. Ensuite, retirez la solution de colorant potentiométrique et conservez-la dans un tube pour une réutilisation ultérieure pour un maximum de six expériences séquentielles en une journée.

Lavez doucement les cellules trois fois avec une solution de tyrode. Après le dernier lavage, pipetez un millilitre de solution de tyrode à faible teneur en potassium dans le puits. Pour commencer, préparez les cellules HEK pour l’électroporation, puis configurez la synchronisation de la délivrance d’impulsions avec l’acquisition d’images à l’aide d’un signal TTL du système de microscope qui déclenche le générateur d’impulsions.

Au fond de la chambre, placez deux électrodes parallèles en fil de platine-iridium d’un diamètre de 0,8 millimètre et d’une distance de cinq millimètres entre les bords intérieurs. Fixez la chambre sous le microscope, puis connectez les électrodes au générateur d’impulsions. À l’aide d’une sonde de tension et de courant, connectez la sortie du générateur d’impulsions à un oscilloscope pour permettre la vérification de la bonne distribution d’impulsions pendant l’expérience.

Concentrez les cellules sur le champ clair et imagez les cellules situées au milieu entre les électrodes. Acquérez 80 images en mode time-lapse à une vitesse d’au moins 25 images par seconde. Illuminez les cellules avec une longueur d’onde d’excitation de 635 nanomètres, réglez le temps d’exposition sur 10 millisecondes et détectez l’émission à environ 700 nanomètres.

Après l’acquisition, attendez deux minutes. Ajustez la tension sur l’interface du générateur d’impulsions à 63 volts. Enregistrez un time-lapse de la même manière toutes les deux minutes.

Lors de ces acquisitions, appliquez une seule impulsion de 100 microsecondes au moment de l’acquisition de la 10e image. Acquérez des images avec des tensions d’impulsion de 63, 75, 88, 100, 125, 150, 175 et 200 volts. Estimez le champ électrique auquel les cellules sont exposées en tant que rapport tension/distance électrode appliqué.

Pour l’analyse des données, exportez les enregistrements time-lapse au format TIFF, puis placez tous les enregistrements time-lapse des tensions appliquées à partir d’une expérience individuelle dans un seul dossier. Renommez chaque enregistrement time-lapse afin que MATLAB puisse reconnaître le champ électrique. Pour l’acquisition au début de l’expérience, où aucune impulsion n’est appliquée, renommez-la en utilisant l’expression 000Vcm.

Ensuite, ouvrez l’application téléchargée à partir de GitHub. Cliquez sur Sélectionner le dossier de données pour choisir le dossier contenant les enregistrements en accéléré d’une expérience. Pour sélectionner les pixels, utilisez deux curseurs pour déterminer le seuil bas pour une image claire des membranes et le seuil haut pour éliminer les débris de l’analyse.

Maintenant, cliquez sur Analyser les données. Dans l’onglet « Analyse », un tableau avec les paramètres extraits apparaît. Sur le côté droit du tableau, des graphiques de fluorescence relative dans le temps pour chaque champ électrique utilisé seront affichés.

Sélectionnez les graphiques d’un champ électrique donné dans le menu déroulant situé sur le côté gauche au-dessus du tableau. Examinez tous les graphiques et effectuez une correction manuelle en cas de détection de faux pics. sélectionnez Effacer les pics AUTO » en bas de l’onglet Analyse » pour effacer les pics détectés automatiquement.

Cliquez sur le graphique pour déterminer manuellement un nouveau point de pointe. Si nécessaire, sélectionnez Réexécuter la détection de pic AUTO » en bas de l’onglet Analyse » pour effectuer à nouveau la détection automatique de pic. Les paramètres extraits seront maintenant ajustés au nouveau pic.

Ensuite, sélectionnez Exporter les données » en bas à droite de l’onglet Analyse » pour exporter les données dans le même dossier qu’un fichier dotmap, un fichier tableur et des images PNG pour chaque champ électrique utilisé. Des impulsions électriques de 126 volts par centimètre ont déclenché de multiples pics de fluorescence dans les cellules excitables, comme le montrent les oscillations distinctes dans le changement de fluorescence au fil du temps. Avec l’augmentation de l’intensité du champ électrique, la réponse a changé et a montré une dépolarisation soutenue à 400 volts par centimètre.

Les cellules non excitables n’ont montré aucun pic significatif en réponse aux intensités de champ électrique les plus faibles, indiquant l’absence d’excitation. À des intensités de champ électrique plus élevées, les cellules non excitables présentaient également une dépolarisation soutenue, indiquant une électroporation. Le nombre maximum de pics dans les cellules excitables a été observé à 150 volts par centimètre, avec une tendance à la baisse du nombre de pics à mesure que la tension augmentait au-delà de ce point.