Quantification microscopique en temps réel et à haut débit de la libération de pièges extracellulaires de neutrophiles humains et évaluation de la pharmacologie des antagonistes

Nous avons développé une méthode de microscopie en temps réel pour la quantification des pièges extracellulaires neutrophiles ou TNE. Ces TNE jouent un rôle important dans la défense immunitaire innée. Cependant, il est devenu clair que l’accumulation de TNE dans les tissus contribue à la physiopathologie de plusieurs maladies inflammatoires et auto-immunes.

En raison des implications pathologiques des TNE, l’intérêt pour le développement des antagonistes de la NETosis a augmenté. Pour étudier l’inhibition de NETosis, nous avons développé une méthode de microscopie en temps réel pour la quantification de la libération de TNE humaines, ce qui nous a permis d’étudier NETosis et son inhibition à haut débit. Les neutrophiles sont des cellules sensibles et peuvent modifier leur réactivité aux stimuli pendant le processus de purification en raison de stress mécaniques, microbiens et autres.

Par conséquent, il est important de valider le protocole d’isolement des neutrophiles afin de minimiser l’activation des neutrophiles. Cette technique permet donc d’étudier la libération de TNE chez des individus sains et malades. De plus, il nous permet d’étudier la cinétique de formation des TNE induite par différents stimuli physiologiques.

Grâce à cette technique de microscopie à haut débit, nous avons pu démontrer que l’antagoniste de NETosis CIT-013, un anticorps monoclonal ciblant les histones citrullinées 2A et 4, était capable d’inhiber efficacement la libération de TNE avec une nanomolaire IC 50 ou 4,6. Cela démontre que ce test est adapté pour tester les antagonistes de NETosis. Après avoir prélevé le sang périphérique du volontaire en bonne santé dans un tube d’héparine de lithium, transférez le sang dans un tube frais de 50 millilitres.

Rincez le tube d’héparine de lithium avec du DPBS et transférez-le dans le même tube de 50 millilitres, en veillant à ce que le rapport sang/DPBS soit de 1:1. Après le mélange, ajoutez du sang dilué sur la solution de gradient de densité. Centrifugez le sang à 400 G pendant 40 minutes avec une accélération et une pause minimales.

Jetez la couche supérieure de plasma à l’aide d’une pipette de 10 millilitres. Ensuite, à l’aide d’une pipette pasteur en plastique, on peut jeter les cellules mononucléées du sang périphérique et la solution à gradient de densité. Agitez doucement la couche contenant l’érythrocyte et le neutrophile avant de la remettre en suspension dans 15 millilitres de DPBS.

Ajouter 25 millilitres de solution de dextran à 6 % et de chlorure de sodium à 0,9 % et mélanger en inversant le tube. Après 25 minutes d’incubation, transférez la couche supérieure de neutrophiles dans un tube frais de 50 millilitres avec une pipette de 10 millilitres et centrifugez à 500 G pendant 10 minutes. Décantez le tube pour jeter le surnageant et remettez la pastille en suspension dans 10 millilitres de tampon de lyse de chlorure d’ammonium.

Ajoutez 40 millilitres du même tampon de lyse et incubez à température ambiante tout en inversant continuellement le tube jusqu’à ce que la solution devienne translucide. Centrifugez le tube à 350 G pendant 10 minutes. Après avoir retiré le surnageant, lentement et goutte à goutte, ajoutez cinq millilitres de milieu de culture, 10 % sur la pastille de neutrophiles sans mettre les neutrophiles en suspension.

Agitez doucement le tube jusqu’à ce que la plupart des érythrocytes présents sur la pastille de neutrophiles soient remis en suspension dans le milieu de culture. Après avoir retiré le surnageant, remettez en suspension la pastille de neutrophiles dans 10 millilitres de milieu de culture, 10 %Une fois complètement remis en suspension, ajoutez jusqu’à 50 millilitres de milieu de culture 10 % et centrifugez le mélange avant de remettre en suspension la pastille dans 10 millilitres de piège extracellulaire à neutrophiles ou de tampon de test NET. Pour commencer, ajoutez une solution de poly-L-lysine à 0,001 % dans chaque puits de la plaque de 96 puits et incubez pendant une heure à 37 degrés Celsius.

Lavez les puits trois fois avec 200 microlitres de DPBS et séchez-les à l’air. Ensuite, mettez à nouveau en suspension le nombre requis de neutrophiles dans le piège extracellulaire à neutrophiles ou le tampon de test NET. Transférez quatre fois le colorant d’ADN concentré dans le tampon de test NET dans chaque puits.

Ajouter aux puits correspondants des stimuli NETosis concentrés quatre fois concentrés dans le tampon d’essai NET. Ensuite, ajoutez des antagonistes de NETosis quatre fois concentrés dans le tampon de test NET et la suspension de neutrophiles dans les puits correspondants. Centrifugez la plaque à 100 G pendant deux minutes.

Ensuite, insérez la plaque dans le système d’analyse par microscopie à cellules vivantes placé dans un incubateur à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone. Après avoir placé la plaque d’imagerie à 96 puits contenant une suspension de neutrophiles dans un système d’analyse de microscopie à cellules vivantes, ouvrez le logiciel du système. Cliquez sur planifier pour acquérir et cliquez sur le bouton plus pour lancer.

Ensuite, sélectionnez Analyser selon un calendrier et cliquez sur Suivant. Pour créer un nouveau navire à partir de zéro, sélectionnez nouveau dans la section Créer un navire et cliquez sur Suivant. Dans la section Type de numérisation, sélectionnez Standard, puis cliquez sur Suivant.

Sélectionnez les paramètres de numérisation cellule par cellule, aucun. Canaux d’image, contraste de phase en vert. Temps d’acquisition, 100 millisecondes et objectif 20x.

Cliquez ensuite sur Suivant. Dans la section Sélection du navire, sélectionnez le type de navire approprié à balayer et cliquez sur Suivant. Spécifiez l’emplacement du récipient dans le tiroir et cliquez sur Suivant.

Dans la section Modèle de balayage, sélectionnez les puits à numériser et le nombre d’images par forfait. Cliquez sur Suivant. Dans la section Carnet de notes du navire, fournissez des informations sur le navire.

Entrez le nom de la plaque et cliquez sur Suivant. Dans la section Configuration de l’analyse, sélectionnez différer l’analyse jusqu’à une date ultérieure et cliquez sur Suivant. Dans la section Calendrier d’analyse, sélectionnez Créer un nouveau programme avec des analyses à intervalles de, puis sélectionnez une heure dans la section Ajouter des analyses à la planification.

Sélectionnez Arrêter l’analyse cinq heures après la première analyse. Cliquez sur Suivant, puis sur Ajouter pour planifier lorsque les informations d’analyse sont correctes. Après avoir acquis des images de contraste de phase et d’immunofluorescence de neutrophiles, lancez le logiciel d’analyse de microscopie à cellules vivantes.

Dans la vue, sélectionnez l’expérience de microscopie à cellules vivantes à analyser. Sélectionnez Créer une nouvelle définition d’analyse et cliquez sur Suivant. Ensuite, sélectionnez l’analyseur de base dans la section Type d’analyse et cliquez sur Suivant.

Dans la section Canal d’image, sélectionnez vert, désélectionnez la phase, puis cliquez sur Suivant. Ouvrez la fenêtre des calques d’image, sélectionnez vert et désélectionnez la phase. Désactivez la mise à l’échelle automatique dans la section verte et réglez manuellement min et max.

Ouvrez ensuite la fenêtre des temps de balayage des navires et sélectionnez les images représentant les puits de contrôle positif avec des TNE. Ouvrez la fenêtre des paramètres de définition d’analyse et écrivez des NET pour le nom de l’objet. Pour la segmentation, sélectionnez Adaptatif.

Pour la GCU de seuil, sélectionnez entre trois et cinq, puis réglez la division Edge On entre moins 10 et zéro. Ensuite, pour le nettoyage, sélectionnez Remplissage de trou à 100 micromètres carrés et ajustez la taille à moins un pixel. Dans Filtres, sélectionnez une zone supérieure à 200 micromètres carrés, une intensité moyenne inférieure à 24,6 et une intensité intégrée supérieure à 7 000.

Cliquez ensuite sur Aperçu actuel ou Aperçu tout pour appliquer les paramètres. Survolez les différentes structures NET et ajustez les paramètres d’analyse pour affiner les NET faux positifs et faux négatifs. Lorsque les paramètres de l’analyse NET sont corrects, cliquez sur Suivant.

Sélectionnez les points temporels et les puits à analyser dans la section Temps de balayage et puits et cliquez sur Suivant. Insérez le nom de la définition dans la section Enregistrer et appliquer la définition de l’analyse, puis cliquez sur Suivant. Cliquez sur Terminer lorsque les informations d’analyse sont vérifiées et correctes.

Ouvrez l’analyse de l’expérience en cliquant sur l’analyse dans le récipient qui vous intéresse. Ensuite, ouvrez la fenêtre des métriques du graphique. Ensuite, cliquez sur le bouton plus pour créer une métrique.

Lorsque vous présentez des données sous forme de pourcentage de confluence NET, sélectionnez Zone dans la section Métrique et sélectionnez Confluence dans la section Valeur. Lorsque vous présentez des données en pourcentage de neutrophiles en phase terminale, sélectionnez Nombre d’objets dans la section Métrique et Par image dans la section Valeur. Après avoir configuré les paramètres de métrique, dans la section Métriques définies par l’utilisateur, sélectionnez Confluence de zone NETs ou Nombre d’objets NETs Per Image.

Sélectionnez tous les points temporels et puits requis pour l’analyse dans les sections Sélectionner les balayages et Sélectionner le puits respectivement. Enfin, cliquez sur Exporter les données. La stimulation ionophore calcique a induit une NETosis plus rapide que la PMA, ce qui a entraîné une proportion plus élevée de neutrophiles libérant des TNE.

Les TNE induites par les ionophores calciques étaient plus diffuses au-delà de la membrane plasmique des neutrophiles, tandis que les TNE induites par les PMA restaient plus proches de la membrane plasmique des neutrophiles. Une tendance vers des niveaux élevés de TNE a été observée lorsque les neutrophiles étaient activés avec des complexes immuns enrobés, du FMLP et des cristaux d’urate monosodique. La libération de TNE en réponse à un 23187 a été complètement inhibée par CIT-013 à une concentration inhibitrice demi-maximale de 4,6 nanomolaires.