Name: Quantification microscopique en temps réel et à haut débit de la libération de pièges extracellulaires de neutrophiles humains et évaluation de la pharmacologie des antagonistes (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-18T14:20:00.000+00:00
Duration: 11 min 32 s
Description: Découvrez une méthode de microscopie en temps réel pour quantifier la libération de pièges extracellulaires de neutrophiles humains. Cette technique à haut débit permet d'évaluer la pharmacologie des antagonistes de la NETose et d'étudier les mécanismes de défense immunitaire innée.

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<meta charset="utf8"></head><body>Microscopie en temps réel pour l’étude de la cinétique de NETosis et le dépistage des inhibiteurs

<ol><li>Brinkmann, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps+kill+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps kill bacteria.</a> Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).</li>
<li>De Bont, C., Pruijn, G. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Citrulline+is+not+a+major+determinant+of+autoantibody+reactivity+to+neutrophil+extracellular+traps%5BTitle%5D)+AND+%22Philos+Trans+R+Soc+Lond+B+Biol+Sci%22%5BJournal%5D)">Citrulline is not a major determinant of autoantibody reactivity to neutrophil extracellular traps.</a> Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 378 (1890), 20220249(2023).</li>
<li>Urban, C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps+contain+calprotectin%2C+a+cytosolic+protein+complex+involved+in+host+defense+against+Candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps contain calprotectin, a cytosolic protein complex involved in host defense against Candida albicans.</a> PLoS Pathog. 5 (10), e1000639(2009).</li>
<li>Hoppenbrouwers, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+induction+of+NETosis%3A+Comprehensive+live+imaging+comparison+and+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">In vitro induction of NETosis: Comprehensive live imaging comparison and systematic review.</a> PLoS One. 12 (5), e0176472(2017).</li>
<li>Kenny, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+stimuli+engage+different+neutrophil+extracellular+trap+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22ELife%22%5BJournal%5D)">Diverse stimuli engage different neutrophil extracellular trap pathways.</a> ELife. 6, e24437(2017).</li>
<li>Parker, H., Dragunow, M., Hampton, M. B., Kettle, A. J., Winterbourn, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirements+for+NADPH+oxidase+and+myeloperoxidase+in+neutrophil+extracellular+trap+formation+differ+depending+on+the+stimulus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leukoc+Biol%22%5BJournal%5D)">Requirements for NADPH oxidase and myeloperoxidase in neutrophil extracellular trap formation differ depending on the stimulus.</a> J Leukoc Biol. 92 (4), 841-849 (2012).</li>
<li>Neeli, I., Radic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opposition+between+PKC+isoforms+regulates+histone+deimination+and+neutrophil+extracellular+chromatin+release%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Opposition between PKC isoforms regulates histone deimination and neutrophil extracellular chromatin release.</a> Front Immunol. 4, 38(2013).</li>
<li>Bosmann, M., Ward, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-based+therapies+for+acute+lung+injury%3A+targeting+neutrophil+extracellular+traps%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin+Ther+Targets%22%5BJournal%5D)">Protein-based therapies for acute lung injury: targeting neutrophil extracellular traps.</a> Expert Opin Ther Targets. 18 (6), 703-714 (2014).</li>
<li>Papayannopoulos, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps+in+immunity+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps in immunity and disease.</a> Nat Rev Immunol. 18 (2), 134-147 (2018).</li>
<li>Shiratori-Aso, S., Nakazawa, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+involvement+of+NETs+in+ANCA-associated+vasculitis%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">The involvement of NETs in ANCA-associated vasculitis.</a> Front Immunol. 14, 1261151(2023).</li>
<li>Byrd, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps%2C+B+cells%2C+and+type+I+interferons+contribute+to+immune+dysregulation+in+hidradenitis+suppurativa%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps, B cells, and type I interferons contribute to immune dysregulation in hidradenitis suppurativa.</a> Sci Transl Med. 11 (508), eaav5908(2019).</li>
<li>Kimball, A. S., Obi, A. T., Diaz, J. A., Henke, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+emerging+role+of+NETs+in+venous+thrombosis+and+immunothrombosis%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">The emerging role of NETs in venous thrombosis and immunothrombosis.</a> Front Immunol. 7, 236(2016).</li>
<li>O'Neil, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+trap-associated+carbamylation+and+histones+trigger+osteoclast+formation+in+rheumatoid+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Rheum+Dis%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular trap-associated carbamylation and histones trigger osteoclast formation in rheumatoid arthritis.</a> Ann Rheum Dis. 82 (5), 630-638 (2023).</li>
<li>Li, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+peptidylarginine+deiminase+4+%28PAD4%29+inhibitor+BMS-P5+blocks+formation+of+neutrophil+extracellular+traps+and+delays+progression+of+multiple+myeloma%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer+Ther%22%5BJournal%5D)">A novel peptidylarginine deiminase 4 (PAD4) inhibitor BMS-P5 blocks formation of neutrophil extracellular traps and delays progression of multiple myeloma.</a> Mol Cancer Ther. 19 (7), 1530-1538 (2020).</li>
<li>Chirivi, R. G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-citrullinated+protein+antibodies+as+novel+therapeutic+drugs+in+rheumatoid+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Cell+Immunol%22%5BJournal%5D)">Anti-citrullinated protein antibodies as novel therapeutic drugs in rheumatoid arthritis.</a> J Clin Cell Immunol. S6, 006(2013).</li>
<li>Van der Linden, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-citrullinated+histone+monoclonal+antibody+CIT-013%2C+a+dual+action+therapeutic+for+neutrophil+extracellular+trap-associated+autoimmune+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22MAbs%22%5BJournal%5D)">Anti-citrullinated histone monoclonal antibody CIT-013, a dual action therapeutic for neutrophil extracellular trap-associated autoimmune diseases.</a> MAbs. 15 (1), 2281763(2023).</li>
<li>Chirivi, R. G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+ACPA+inhibits+NET+formation%3A+a+potential+therapy+for+neutrophil-mediated+inflammatory+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Immunol%22%5BJournal%5D)">Therapeutic ACPA inhibits NET formation: a potential therapy for neutrophil-mediated inflammatory diseases.</a> Cell Mol Immunol. 18 (6), 1528-1544 (2021).</li>
<li>Van der Linden, M., Westerlaken, G. H. A., Van Der Vlist, M., Van Montfrans, J., Meyaard, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+signalling+and+kinetics+of+neutrophil+extracellular+trap+release+revealed+by+quantitative+live+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Differential signalling and kinetics of neutrophil extracellular trap release revealed by quantitative live imaging.</a> Sci Rep. 7 (1), 6529(2017).</li>
<li>Hoffmann, J. H. O., Schaekel, K., Gaiser, M. R., Enk, A. H., Hadaschik, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interindividual+variation+of+NETosis+in+healthy+donors%3A+introduction+and+application+of+a+refined+method+for+extracellular+trap+quantification%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Interindividual variation of NETosis in healthy donors: introduction and application of a refined method for extracellular trap quantification.</a> Exp Dermatol. 25 (11), 895-900 (2016).</li>
<li>Silva, L. M., Moutsopoulos, N., Bugge, T. H., Doyle, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+and+quantification+of+neutrophil+extracellular+trap+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc%22%5BJournal%5D)">Live imaging and quantification of neutrophil extracellular trap formation.</a> Curr Protoc. 1 (7), e157(2021).</li>
<li>De Bont, C. M., Koopman, W. J. H., Boelens, W. C., Pruijn, G. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulus-dependent+chromatin+dynamics%2C+citrullination%2C+calcium+signalling+and+ROS+production+during+NET+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta+Mol+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Stimulus-dependent chromatin dynamics, citrullination, calcium signalling and ROS production during NET formation.</a> Biochim Biophys Acta Mol Cell Res. 1865 (11 Pt A), 1621-1629 (2018).</li>
<li>Gajendran, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alleviation+of+arthritis+through+prevention+of+neutrophil+extracellular+traps+by+an+orally+available+inhibitor+of+protein+arginine+deiminase+4%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Alleviation of arthritis through prevention of neutrophil extracellular traps by an orally available inhibitor of protein arginine deiminase 4.</a> Sci Rep. 13 (1), 3189(2023).</li>
<li>Biron, B. M., Chung, C. -S., O'Brien, X. M., Chen, Y., Reichner, J. S., Ayala, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cl-Amidine+prevents+histone+3+citrullination+and+neutrophil+extracellular+trap+formation%2C+and+improves+survival+in+a+murine+sepsis+model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Innate+Immun%22%5BJournal%5D)">Cl-Amidine prevents histone 3 citrullination and neutrophil extracellular trap formation, and improves survival in a murine sepsis model.</a> J Innate Immun. 9 (1), 22-32 (2017).</li>
<li>Perdomo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+activation+and+NETosis+are+the+major+drivers+of+thrombosis+in+heparin-induced+thrombocytopenia%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Neutrophil activation and NETosis are the major drivers of thrombosis in heparin-induced thrombocytopenia.</a> Nat Commun. 10 (1), 1322(2019).</li>
<li>Lood, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps+enriched+in+oxidized+mitochondrial+DNA+are+interferogenic+and+contribute+to+lupus-like+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps enriched in oxidized mitochondrial DNA are interferogenic and contribute to lupus-like disease.</a> Nat Med. 22 (2), 146-153 (2016).</li>
<li>Kraaij, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+for+high-throughput+detection+and+quantification+of+neutrophil+extracellular+traps+reveals+ROS-independent+NET+release+with+immune+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Autoimmun+Rev%22%5BJournal%5D)">A novel method for high-throughput detection and quantification of neutrophil extracellular traps reveals ROS-independent NET release with immune complexes.</a> Autoimmun Rev. 15 (6), 577-584 (2016).</li>
<li>De Buhr, N., Von Köckritz-Blickwede, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+neutrophil+extracellular+traps+become+visible%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Res%22%5BJournal%5D)">How neutrophil extracellular traps become visible.</a> J Immunol Res. 2016, 1-13 (2016).</li>
<li>Brinkmann, V., Laube, B., Abu Abed, U., Goosmann, C., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps%3A+How+to+generate+and+visualize+them%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps: How to generate and visualize them.</a> J Vis Exp. (36), e1724(2010).</li>
<li>Zhao, W., Fogg, D. K., Kaplan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+image-based+quantitative+method+for+the+characterization+of+NETosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">A novel image-based quantitative method for the characterization of NETosis.</a> J Immunol Methods. 423, 104-110 (2015).</li>
<li>Gavillet, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+assay+for+direct+quantification+of+neutrophil+extracellular+traps+in+blood+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hematol%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric assay for direct quantification of neutrophil extracellular traps in blood samples.</a> Am J Hematol. 90 (12), 1155-1158 (2015).</li>
<li>Sil, P., Yoo, D., Floyd, M., Gingerich, A., Rada, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+throughput+measurement+of+extracellular+DNA+release+and+quantitative+NET+formation+in+human+neutrophils+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">High throughput measurement of extracellular DNA release and quantitative NET formation in human neutrophils in vitro.</a> J Vis Exp. (112), e52779(2016).</li>
<li>Gupta, S., Chan, D. W., Zaal, K. J., Kaplan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+real-time+imaging+technique+to+quantify+NETosis+and+distinguish+mechanisms+of+cell+death+in+human+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">A high-throughput real-time imaging technique to quantify NETosis and distinguish mechanisms of cell death in human neutrophils.</a> J Immunol. 200 (2), 869-879 (2018).</li>
<li>D'Cruz, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pseudokinase+MLKL+activates+PAD4-dependent+NET+formation+in+necroptotic+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Signal%22%5BJournal%5D)">The pseudokinase MLKL activates PAD4-dependent NET formation in necroptotic neutrophils.</a> Sci Signal. 11 (546), eaao1716(2018).</li>
<li>Nash, G., Abbitt, K., Tate, K., Jetha, K., Egginton, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+the+mechanical+and+adhesive+behaviour+of+human+neutrophils+on+cooling+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">Changes in the mechanical and adhesive behaviour of human neutrophils on cooling in vitro.</a> Pflugers Arch. 442 (5), 762-770 (2001).</li>
<li>Hundhammer, T., Gruber, M., Wittmann, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paralytic+impact+of+centrifugation+on+human+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedicines%22%5BJournal%5D)">Paralytic impact of centrifugation on human neutrophils.</a> Biomedicines. 10 (11), 2896(2022).</li>
<li>Krémer, V., Godon, O., Bruhns, P., Jönsson, F., De Chaisemartin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+methods+determine+human+neutrophil+responses+after+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Isolation methods determine human neutrophil responses after stimulation.</a> Front Immunol. 14, 1301183(2023).</li>
<li>Freitas, M., Porto, G., Lima, J. L. F. C., Fernandes, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+activation+of+human+neutrophils+in+vitro.+The+importance+of+the+anticoagulant+used+during+blood+collection%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Biochem%22%5BJournal%5D)">Isolation and activation of human neutrophils in vitro. The importance of the anticoagulant used during blood collection.</a> Clin Biochem. 41 (7-8), 570-575 (2008).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>A-23187 Acide libre (calcimycine)</td><td>Thermo Fisher</td><td>A1493</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure d’ammonium (NH4Cl)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9434</td><td></td></tr><tr><td>Lysozyme anti-œuf de poule (anticorps de contrôle ; cIgG)</td><td>CrownBio</td><td>C0001</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps anti-CD45 humain de souris conjugué APC-Cy7 (clone 2D1)</td><td>Biolegend</td><td>368515</td><td>Utilisation à 1 &micro ; g/mL concentration finale</td></tr><tr><td>Système BD FACSCantoTM II + logiciel FACSDiva (version 8.0.1)&nbsp ;</td><td>BD</td><td>n/a</td><td>Système de cytométrie en flux</td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine (BSA) Fraction V</td><td>Roche</td><td>10735108001</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2 (1 M)</td><td>VWR</td><td>E506</td><td></td></tr><tr><td>Cristaux de maladie de disposition au pyrophosphate de calcium (CPPD)</td><td>InvivoGen</td><td>lrl-cppd</td><td></td></tr><tr><td>Cellomètre Auto T4 Compteur de cellules à champ clair + logiciel d’analyse (version 3.3.9.5)</td><td>Nexcelom Bioscience</td><td>n/a</td><td>Compteur de cellules en champ clair</td></tr><tr><td>CIT-013</td><td>Citryll B.V.</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Plaque Costar noire 96 puits, fond transparent&nbsp ;</td><td>Corning</td><td>3603</td><td>Plaque 96 puits #1</td></tr><tr><td>Dextran T500</td><td>Pharmacosmos</td><td>551005009006</td><td></td></tr><tr><td>DPBS (1x)</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin (FBS)</td><td>Serena</td><td>S-FBS-SA-015</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll&nbsp ;</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440-02</td><td>Solution de gradient de densité</td></tr><tr><td>Anticorps anti-CD66b humain de souris conjuguée FITC (clone G10F5)</td><td>eBioscience</td><td>17-0666-42</td><td>Utilisation à 1,5 & micro ; g/mL concentration finale</td></tr><tr><td>Colorant de viabilité fixable eFluor 506</td><td>eBioscience</td><td>65-0866-14</td><td></td></tr><tr><td>Logiciel d’analyse par cytométrie en flux</td><td>FLowJo</td><td>Version 10.8.0</td><td></td></tr><tr><td>fMLP</td><td>Sigma Aldrich</td><td>47729-10MG-F</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (1M)</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>Albumine sérique humaine (HSA)</td><td>VWR</td><td>31020</td><td></td></tr><tr><td>Humain TruStain FcX&nbsp ;</td><td>Biolegend</td><td>422302</td><td>Fc receptor block</td></tr><tr><td>IBIDI plaque à 96 puits, fond clair&nbsp ;</td><td>IBIDI</td><td>89626</td><td>Plaque 96 puits #2</td></tr><tr><td>IncuCyte SX3 + logiciel d’analyse (version 2022B Rev1)&nbsp ;</td><td>Satorius</td><td>n/a</td><td>Système d’analyse microscopique de cellules vivantes</td></tr><tr><td>Cristaux d’urate monosodique</td><td>InvivoGen</td><td>tlrl-msu</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps anti-histone H3 (citrulline R2 + R8 + R17) anticorps&nbsp ;</td><td>Cayman</td><td>17939</td><td>Clone 11D3 ; appelé #1</td></tr><tr><td>Souris anti-histone H4 (K8Ac + K12Ac + K16Ac) (Clone KM-2)</td><td>Anticorps absolus</td><td>Ab01681-2.0</td><td></td></tr><tr><td>Na2EDTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>NaCl (0,9 %)</td><td>B. Braun</td><td>25900</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline (5000 U/mL) - Streptomycine (5000 &micro ; g/mL)</td><td>Gibco</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps anti-CD16 humain de souris conjugué PerCP-Cy5.5 (clone 3G8)</td><td>Biolegend</td><td>302027</td><td>Utilisation à 0,33 &micro ; g/mL concentration finale</td></tr><tr><td>PMA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1585</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps anti-HSA polyclonal de lapin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A0433-2ml</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Lysine (0,01 %)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4832</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonate de potassium (KHCO3)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>237205</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps anti-histone H3 (citrulline R2 + R8 + R17)&nbsp ;</td><td>Abcam</td><td>ab281584</td><td>Multiclonal ; désigné comme #2</td></tr><tr><td>RPMI 1640 avec supplément GlutaMAXTM.</td><td>Gibco</td><td>61870-010</td><td>Milieu de culture contenant de la L-glutamine</td></tr><tr><td>RPMI 1640 sans rouge de phénol</td><td>Gibco</td><td>11835-030</td><td>Milieu de culture sans rouge de phénol</td></tr><tr><td>Azoture de sodium (NaN3)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>Stérile H2O</td><td>Gibco</td><td>15230204</td><td></td></tr><tr><td>Sytox Green Nucleid Acid Stain&nbsp ;</td><td>Thermo Fisher</td><td>S7020</td><td>Colorant ADN</td></tr><tr><td>Solution de bleu de trypan (0,4 %)</td><td>Gibco</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>Tubes sanguins Vacutainer Li-héparine (17 UI/mL)</td><td>BD</td><td>367526</td><td></td></tr></tbody></table>

quantification microscopique en temps réel et à haut débit de la libération de pièges extracellulaires de neutrophiles humains et évaluation de la pharmacologie des antagonistes

Real-Time, High-Throughput Microscopic Quantification of Human Neutrophil Extracellular Trap Release and Assessing the Pharmacology of Antagonists

La microscopie à haut débit en temps réel, associée à un colorant d’ADN imperméable, permet d’étudier la cinétique, les caractéristiques et les voies sous-jacentes de NETosis et permet d’évaluer les inhibiteurs potentiels de la libération de NET. Avec cette approche, les TNE ont été définies comme des structures positives pour le colorant d’ADN avec une surface significativement plus grande par rapport à la surface des neutrophiles sains (Figure 1A), indiquant que la chromatine a été expulsée dans l’environnement extracellulaire18. L’analyse basée sur la surface nous a permis de distinguer les TNE des neutrophiles activés dont l’intégrité de la membrane plasmique est compromise, montrant une coloration brillante de l’ADN intracellulaire (Figure 1A).
L’ionophore calcique (A23187) et le PMA sont couramment utilisés pour induire la NETosis in vitro. Bien qu’il s’agisse de stimuli non physiologiques, ils sont précieux car ils activent des voies distinctes de NETosis et assurent une induction cohérente de NETosis avec une faible variabilité entre les donneurs. A23187 déclenche un afflux de calcium, entraînant l’activation de PAD4 et la libération de TNE riches en histones citrullinées, tandis que la PMA active le complexe NADPH oxydase, entraînant la production d’espèces réactives de l’oxygène (ROS) et la libération ultérieure de TNE avec de faibles niveaux d’histones citrullinées 5,16,21. La vitesse et l’amplitude de la réponse NETosis dépendent de la concentration de chaque stimulus (Figure 1B,C), A23187 induisant une NETosis plus rapide, et PMA entraînant une proportion plus élevée de neutrophiles libérant des TNE (Figure 1D-F). Les TNE résultant de la stimulation A23187 (figure 1D ; flèche rouge) se distinguaient des TNE induites par la PMA (figure 1D ; flèche jaune) en ce qu’elles étaient plus diffuses au-delà de la membrane plasmique des neutrophiles, tandis que les TNE induites par la PMA restaient plus adjacentes à la membrane plasmique des neutrophiles. De plus, la stimulation A23187 a donné des neutrophiles perméables non nettoyants à l’ADN positif (Figure 1D ; flèche bleue), qui n’ont pas expulsé leur ADN dans l’espace extracellulaire. La détection de neutrophiles à ADN non nettoyants perméables et positifs à un colorant était dépendante de la concentration de A23187 (figure 1G) et presque absente quelle que soit la concentration de PMA utilisée pour stimuler la NETosis (figures 1D, H). En plus d’utiliser les stimuli non physiologiques NETosis A23187 et PMA, ce test convient également à l’étude des déclencheurs de NETosis pertinents pour la maladie. À titre d’exemple, les neutrophiles activés par des complexes immunitaires solubles (sIC) ou des cristaux présents dans la maladie de disposition du pyrophosphate de calcium (CPPD) ont montré une augmentation significative de la libération de TNE par rapport à l’absence de stimulus. Une tendance à des taux élevés de TNE a été observée lorsque les neutrophiles étaient activés avec des complexes immuns enrobés (cIC), du fMLP et des cristaux d’urate monosodique (MSU) (figure 1I) ; Cependant, pour ces stimuli, nous avons observé une variation considérable d’un donneur à l’autre.
L’inhibition pharmacologique de la voie NETosis et des enzymes associées à la NETosis a montré que les thérapies ciblant la NETosis pourraient être des traitements efficaces pour les maladies où l’accumulation de TNE entraîne de manière significative la pathologie 14,17,22,23,24. Ce test NET de microscopie en temps réel est une approche simple, fiable et reproductible pour étudier les antagonistes de NETosis à haut débit. Pour illustrer cela, nous avons utilisé un anticorps monoclonal humanisé de première classe, CIT-013, qui cible les histones citrullinées H2A et H4 avec une grande affinité15,16. A23187 active la voie NETosis, ce qui permet aux TNE de contenir des histones citrullinées qui sont ensuite ciblées par CIT-013 pour remplir leur fonction inhibitrice de NETosis16. En effet, la libération de TNE en réponse à A23187 a été complètement inhibée par CIT-013 (Figure 2A et Vidéo supplémentaire 1), avec une CI50 de 4,6 nM (Figure 2B). La capacité inhibitrice de la NETose de CIT-013 est unique car d’autres anticorps commerciaux ciblant différentes histones (non-)citrullinées n’ont pas été en mesure d’inhiber la libération de TNE (Figure 2C).
Auparavant, nous avons montré qu’une molécule précurseur très similaire de CIT-013 (deux acides aminés différents mais liant des épitopes similaires avec une affinité égale) bloque NETosis en réponse à des stimuli physiologiques tels que les plaquettes activées, le liquide synovial de la goutte ainsi que le liquide synovial de la RA17. Ici, nous montrons que la libération de TNE induite par le sIC peut être inhibée par CIT-013 (Figure 2D). La pertinence thérapeutique de l’inhibition de la NETosis induite par ce stimulus est mise en évidence par le LED, la PR et d’autres maladies auto-immunes, où les auto-anticorps dans le sérum ou le liquide synovial soutiennent la formation de la CI, qui déclenche la NETosis25,26.
L’ensemble de ces données démontre que cette approche de microscopie à haut débit en temps réel est adaptée à l’étude de la cinétique et des caractéristiques de la libération de TNE et permet l’étude des inhibiteurs de la NETosis. Bien que cette méthode ait été optimisée pour l’utilisation de neutrophiles humains, avec des modifications, elle pourrait également convenir pour étudier les neutrophiles d’autres espèces. Les données générées par ce test sont la pierre angulaire de la raison d’être du CIT-013 en tant que traitement puissant et efficace pour les maladies induites par les TNE.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67258/67258fig01.jpg"> 
Figure 1 : Microscopie à haut débit en temps réel pour l’étude de la libération de TNE. Les neutrophiles isolés du sang de volontaires sains ont été stimulés avec A23187 ou PMA pour déclencher la voie NETosis. La libération de TNE a été visualisée par microscopie à haut débit en temps réel à l’aide d’un colorant d’ADN imperméable à la membrane plasmique et quantifiée en fonction de la surface avec le logiciel du système d’analyse de microscopie à cellules vivantes. (A) Analyse de la surface des neutrophiles sains non stimulés (gris), des TNE extracellulaires et des neutrophiles perméables non netsants avec coloration intracellulaire de l’ADN (vert). (B, C) Quantification de la libération de TNE au fil du temps par les neutrophiles stimulés par les concentrations indiquées A23187 ou PMA (n = 2). (D) Images représentatives du rejet de TNE en réponse à A23187 (flèches rouges) et PMA (flèches jaunes) à différents moments. Des exemples de neutrophiles perméables non réticulaires sont indiqués par des flèches bleues. (E) Quantification de la libération de TNE au fil du temps présentée en pourcentage de la confluence des TNE (n = 5). Les statistiques ont été effectuées sur t = 240 min. (F) Quantification de la libération de TNE au fil du temps présentée en pourcentage des neutrophiles nets (n = 2). (G, H) Quantification des neutrophiles non résilles perméables au fil du temps à partir de neutrophiles qui ont été stimulés avec les concentrations indiquées de A23187 ou de PMA (n = 2). (I) Quantification de la libération de TNE à t = 240 min induite par des complexes immuns solubles (sIC), des CI enrobés (cIC), des fMLP, des cristaux d’urate monosodique (MSU) et des cristaux présents dans la maladie de disposition du pyrophosphate de calcium (CPPD) (n = 8-28). Les résultats sont présentés sous forme de moyenne ±'erreur type de la moyenne. **P &lt; 0,01 et ****P &lt; 0,0001, ANOVA à mesures répétées à un facteur avec le test de comparaisons multiples de Dunnett (B), test de Kruskal-Wallis avec le test de comparaisons multiples de Dunn (I). Les panneaux A-F ont été modifiés avec l’autorisation de van der Linden et al.16. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67258/67258fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67258/67258fig02.jpg"> 
Figure 2 : CIT-013 inhibe la libération de NET. (A) Quantification de la libération de TNE induite par A23187 à t = 240 min en l’absence (pas d’Ab) ou la présence de CIT-013 ou d’anticorps de contrôle d’isotype (cIgG). (B) Inhibition dose-dépendante de la libération de TNE induite par A23187 avec CIT-013 à t = 240 min (n = 3). Les données ont été normalisées en cIgG (définie à 100 % de libération de TNE). (C) Quantification de la libération de TNE induite par A23187 à t = 240 min en présence de concentrations indiquées de CIT-013, d’anticorps anti-histone H4, d’anticorps anti-histone H3 #1 ou d’anticorps #2 contre l’histone H3 #2 (n = 6). (D) Quantification de la libération de TNE à t = 240 min induite par des complexes immuns solubles (CI) en présence de CIT-013 ou de cIgG. Les résultats sont présentés sous forme de moyenne ±'erreur type de la moyenne. P &lt; 0,0001, ANOVA unidirectionnelle à mesures répétées avec comparaisons multiples de Tukey (A) ou test de rang signé des paires appariées de Wilcoxon bilatérales (D). Les panneaux A, B et D ont été modifiés avec la permission de van der Linden et al.16. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67258/67258fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Plaque à 96 puits #1</td>
			<td>Plaque à 96 puits #2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volume 0,001 % solution de poly-L-lysine par puits</td>
			<td>50 μL</td>
			<td>100 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volume de suspension de neutrophiles par puits</td>
			<td>50 μL</td>
			<td>87,5 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nombre de neutrophiles par puits</td>
			<td>2 x 104 cellules</td>
			<td>3,5 x 104 cellules</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volume 4x colorant d’ADN concentré (= 80 nM) dans le tampon de test NET par puits</td>
			<td>50 μL</td>
			<td>87,5 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volume 4x stimuli NETosis concentrés dans le tampon d’essai NET par puits</td>
			<td>50 μL</td>
			<td>87,5 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volume 4x antagonistes concentrés de NETosis dans le tampon de test NET par puits</td>
			<td>50 μL</td>
			<td>87,5 μL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tableau 1 : Volumes et numéros de cellules optimisés pour différentes plaques d’imagerie à 96 puits.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Solution de travail de concentration (4x concentrée)</td>
			<td>Concentration finale</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ionophore de calcium (A23187)</td>
			<td>50 μM</td>
			<td>12,5 μM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L'</td>
			<td>16 nM</td>
			<td>4 nM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fMLP</td>
			<td>4 μM</td>
			<td>1 μM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cristaux d’urate monosodique (MSU)</td>
			<td>400 μg/mL</td>
			<td>100 μg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cristaux de maladie de disposition du pyrophosphate de calcium (CPPD)</td>
			<td>400 μg/mL</td>
			<td>100 μg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">Complexes immuns solubles (sIC)</td>
			<td colspan="2">1. Ajouter 5 μg/mL d’albumine sérique humaine (HSA) dans le DPBS à 282,5 μg/mL d’anticorps polyclonaux anti-HSA de lapin dans le DPBS.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">2. Incuber pendant au moins 90 min à 37 °C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">3. Homogénéiser par vortex et ajouter une solution de sIC de 50 μL dans les puits correspondants.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="10">Complexes immuns enrobés (cIC)</td>
			<td colspan="2">1. Ajouter 10 μg/mL de HSA dans le DPBS dans les puits correspondants de la plaque à 96 puits.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">2. Incuber toute la nuit à 4 °C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">3. Laver les puits 3 fois avec 200 μL 0,05 % Tween-20 dans DPBS (ci-après dénommé PBS/0,05 % Tween).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">4. Bloquer les puits avec 200 μL 1 % (p/v) d’albumine sérique bovine dans PBS/0,05 % Tween (ci-après appelé tampon de blocage).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">5. Incuber pendant 120 min à température ambiante et en agitant doucement (400 tr/min).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">6. Lavez les puits 3 fois avec 200 μL de PBS/0,05 % de préadolescent.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">7. Ajouter 50 μL d’anticorps polyclonaux de lapin anti-HSA dans le tampon de blocage dans les puits correspondants.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">8. Incuber pendant 60 min à température ambiante et en agitant doucement (400 tr/min).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">9. Lavez les puits 3 fois avec 200 μL de PBS/0,05 % de Tween.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">10. Enfin, lavez les puits 3 fois avec 200 μL DPBS. Les puits sont maintenant prêts pour l’étape 4.7 du protocole.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tableau 2 : Concentrations recommandées pour les stimuli NETosis.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Solution de travail de concentration (4x concentrée)</td>
			<td>Concentration finale</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anticorps anti-lysozyme d’œuf de poule (anticorps de contrôle ; cIgG)</td>
			<td>80 nM</td>
			<td>20 nM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CIT-013 (en anglais)</td>
			<td>80 nM</td>
			<td>20 nM</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tableau 3 : Concentrations recommandées pour l’antagoniste de NETosis.
Vidéo supplémentaire 1. Les neutrophiles ont été stimulés avec A23187 en présence de cIgG (à gauche) ou de CIT-013 (à droite), et la libération de TNE a été visualisée au fil du temps à l’aide du colorant d’ADN imperméable à la membrane plasmique. La libération de TNE est inhibée en présence de CIT-013. Le film est une superposition de colorant d’ADN (vert) et de contraste de phase. Cette vidéo a été obtenue avec la permission de van der Linden et al.16. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67258/20240726_Supplemental%20video%201.zip" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.</a>

Quantification microscopique en temps réel et à haut débit de la libération de pièges extracellulaires de neutrophiles humains et évaluation de la pharmacologie des antagonistes

Neutrophils play an important role in innate immune defense by using several strategies, including the release of neutrophil extracellular traps (NETs) in ...

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