Un protocole pour les cultures d’explants de gliomes diffus de bas grade avec mutation IDH1

Dans notre laboratoire, nous nous concentrons sur le type rare de tumeurs cérébrales appelées gliomes diffus de bas grade. Ces gliomes touchent souvent les jeunes adultes et sont caractérisés par une mutation du gène appelé IDH-1. Les principales avancées dans le domaine des gliomes sont, premièrement, l’utilisation de modèles 3D, comme les tumoroïdes ou les organoïdes, deuxièmement, l’utilisation de l’imagerie directement dans le cerveau de souris transplantées avec des gliomes, et troisièmement, l’utilisation d’ARN transcriptomique et unicellulaire spécial.

Le principal défi auquel nous sommes confrontés lorsque nous travaillons sur les gliomes mutants IDH-1 est la faible prolifération de ces cellules et leur difficulté à être maintenues en culture, et donc nous avons dérivé et défini un protocole pour maintenir les cellules en vie, et pour certaines d’entre elles, nous avons pu dériver une lignée cellulaire, Mais pas pour tous les patients. En étudiant les cellules mutantes IDH-1 in vitro, mais aussi in vivo, nous avons découvert que ces cellules sont assez plastiques, et qu’elles peuvent adopter le destin de deux cellules, soit de type astrocytaire, soit ovale, et nous avons également constaté que le nudge joue un rôle majeur dans cette plasticité. Avec ce nouveau protocole d’explantation, nous avons pu maintenir les cellules mutantes IDH-1 in vitro pendant des semaines, mais plus encore, pendant des mois, et nous avons montré qu’il existe différents types de cellules tumorales, comme nous l’avons constaté chez les patients.

Nous avons également découvert qu’il existe des cellules de l’environnement tumoral, comme les cellules microgliales, qui permettent d’étudier l’interaction entre les cellules tumorales et leur environnement, de sorte que ces modèles offrent une représentation plus précise de la diversité biologique trouvée dans les tumeurs. Pour commencer, préparez l’espace de travail et disposez tous les outils stérilisés. Transférez la résection tumorale sur de la glace pour préserver la viabilité des tissus pour la culture.

Examinez la résection tumorale pour déterminer la taille et l’hétérogénéité. Sélectionnez des parties affichant une couleur grise avec une texture molle ou gélatineuse, car ces zones sont riches en cellules tumorales. Transférez les échantillons tumoraux sélectionnés dans un microtube de 1,5 millilitre ou un cryoflacon et ajoutez un millilitre de milieu.

À l’aide de ciseaux stériles, coupez les échantillons en petits morceaux d’un à deux millimètres cubes. Ensuite, à l’aide de ciseaux stériles, coupez l’extrémité d’une pointe de pipette de 1 000 microlitres pour créer une large ouverture d’environ trois à quatre millimètres de diamètre. Pipeter 100 à 200 microlitres de fragments de tissu haché avec une pointe coupée dans les puits d’une plaque.

Réhomogénéisez doucement la suspension pour assurer une répartition uniforme, car les petits fragments ont tendance à se déposer rapidement. Placez l’assiette dans un incubateur réglé à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone et 100 % d’humidité. Remplacez le média quotidiennement si l’activité métabolique de la tumeur provoque un jaunissement rapide ou si la densité des fragments l’exige.

Pour commencer, obtenez la suspension de tissu tumoral haché. Pour la préparation du milieu de congélation, ajoutez deux millilitres de DMSO à huit millilitres de milieu de culture cellulaire. Combinez un volume de suspension tumorale hachée avec un volume égal de fluide de congélation préparé à 20 % de DMSO.

Pipetez soigneusement le mélange de haut en bas pour assurer un mélange complet. Transférez rapidement les cryoflacons dans un récipient cryogénique pour faciliter la réduction progressive de la température, puis incubez pendant la nuit à moins 80 degrés Celsius avant de passer à l’azote liquide pour un stockage à long terme. Pour la décongélation, retirez les cryoflacons de l’azote liquide et placez-les immédiatement dans un bain-marie à 37 degrés Celsius.

Réchauffez-les jusqu’à ce qu’environ 80 % des cellules soient décongelées. Pour retirer le DMSO, transférez rapidement la suspension dans un tube à centrifuger de 15 millilitres contenant cinq millilitres de PBS 1X préchauffé et centrifugez le tube à 300 G pendant cinq minutes. Retirer le surnageant et répéter le lavage PBS, suivi d’une centrifugation.

Aspirez le surnageant, en veillant à ce que la pastille ne soit pas dérangée. Remettez la pastille en suspension dans une quantité appropriée de milieu et transférez-la dans une plaque PDL Laminin 24 puits pré-enduite. Incuber l’assiette à 37 degrés Celsius.

Des cellules présentant des morphologies allongées, bipolaires ou multipolaires ont été observées en croissance à partir d’explants tumoraux fixés à la surface du puits après une durée de culture minimale de quatre semaines. Les cellules dérivées de tumeurs ont présenté une morphologie comparable entre les tumeurs fraîches et cryo-préservées dans trois cas, comme le montrent les apparences allongées et bipolaires formant des réseaux complexes. La migration radiale de la cellule dérivée de la tumeur le long de la fibre a été clairement observée.

Les cultures d’explants infructueuses ont montré des fragments non adhérents et de nombreuses cellules gitères, caractérisées par une autofluorescence et une teneur en lipides.