Contrôle spatio-temporel de l’activité des protéines par la régulation allostérique optogénétique

Notre recherche globale se concentre sur le développement de méthodes optogénétiques qui permettent un contrôle spatio-temporel précis de l’activité des protéines par la lumière. Nous concevons des domaines régulables à la lumière appelés lightR pour la régulation allostérique, ce qui nous permet d’étudier l’impact de l’activité des protéines contrôlées spatio-temporellement sur la signalisation et les fonctions cellulaires, ce qui contribue à la modélisation préclinique des maladies et au développement de thérapies. L’optogénétique est confrontée à plusieurs défis, notamment l’obtention d’un contrôle précis et réversible de l’activité des protéines cibles et l’imitation précise de la cinétique de signalisation endogène.

Les principaux problèmes sont la prévention de l’activation indésirable, l’activation subcellulaire ciblée et la gestion de la phototoxicité pour préserver la viabilité cellulaire. De plus, le développement d’outils universellement compatibles et robustes est crucial pour améliorer la polyvalence et la reproductibilité des applications. Notre protocole d’ingénierie des outils lightR combine de manière unique plusieurs fonctionnalités avancées en un seul système, notamment la régulation allostérique, la sensibilité élevée, la résolution spatiale, le contrôle temporel serré et la spécificité précise de la signalisation.

Cette intégration permet d’accorder diverses protéines cibles, comblant ainsi les lacunes d’autres méthodes qui peuvent manquer d’une ou plusieurs de ces capacités critiques. Nous nous intéressons à la définition des processus clés de signalisation et de structure régulant la migration cellulaire. Notre objectif est d’utiliser notre technologie optogénétique pour disséquer les régulations de la migration et des interactions des cellules endothéliales.

Comprendre comment le remodelage de la matrice extracellulaire est médié par les cellules endothéliales, et déterminer comment la dérégulation de ces processus contribue au développement de la maladie. Pour l’analyse biochimique des kinases lightR, placez une fois 10 à la puissance de six cellules XE pour une boîte de culture cellulaire de 3,5 centimètres pour chaque groupe expérimental, incubez les cellules à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant 16 à 18 heures. Le lendemain, transfectez les cellules avec la construction d’ADN sélectionnée à l’aide d’un réactif de transfection approprié.

Couvrez le plat de papier d’aluminium et remettez-le dans l’incubateur. Après 16 à 18 heures de transfection, placez un système de lampe à panneau LED de 465 nanomètres à l’intérieur de l’incubateur de culture tissulaire. Placez un panneau en plexiglas perforé à 10 centimètres au-dessus de la lampe pour obtenir un éclairage de trois milliwatts par centimètre carré.

Utilisez un éclairage continu dans les cellules exprimant LightR-Src et D388 R-LightR-Src. Allumez et éteignez manuellement le panneau LED pour contrôler l’éclairage. À la fin des points temporels expérimentaux, récoltez les cellules sous une lumière rouge sûre, aspirez le milieu et lavez les cellules avec du PBS froid.

L’illumination globale des cellules lin XE avec LightR-Src modifié pendant 60 minutes montre une phosphorylation des substrats Src, de la paxilline endogène et des cellules p130Cas exprimant le mutant catalytique inactif D388 RLightR-Src ne montre aucune phosphorylation des substrats Src à l’illumination globale. Pour commencer, plaquez deux fois 10 à la puissance cinq cellules hela par boîte de culture tissulaire de 35 millimètres dans un milieu de culture cellulaire. Incuber les cellules pendant deux heures à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone.

Une fois que les cellules se sont attachées et ont atteint 60 à 70% de confluence, cotransfectez les cellules hella avec le mélange donné. Couvrez le plat avec du papier d’aluminium pour éviter l’allumage accidentel des cellules. Ensuite, incubez les cellules pendant 16 à 18 heures à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone.

Ensuite, placez des verres couverts d’un diamètre de 25 millimètres et d’une épaisseur de 0,17 millimètre dans une chambre à six puits. Enduisez trois lamelles de verre rondes avec cinq milligrammes par litre de fibronectine dans du PBS et incubez à 37 degrés Celsius pendant la nuit. Rincez ensuite les lamelles avec du PBS 16 à 18 heures après la transfection.

Collectez les cellules hela transfectées dans une lumière rouge sûre, puis jouez environ une fois 10 à la puissance de cinq cellules hela transfectées sur chaque couverture sous une lumière rouge sûre. Recouvrez la plaque de papier d’aluminium et incubez dans un milieu de culture cellulaire pendant deux heures à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone. Ensuite, réchauffez le support d’imagerie préparé et l’huile minérale à 37 degrés Celsius.

Ensuite, lavez deux fois les lamelles contenant les cellules avec du PBS. Après avoir coloré et lavé les cellules, placez soigneusement la gaine dans une chambre d’imagerie de cellules vivantes. Ajoutez un millilitre de support d’imagerie L15 dans la chambre.

Ajoutez un millilitre d’huile minérale préchauffée au support pour éviter l’évaporation pendant l’imagerie. Gardez la chambre à l’abri de la lumière à 37 degrés Celsius jusqu’au moment de prendre des images. Placez la chambre sur une platine de microscope préchauffée à 37 degrés Celsius.

Sélectionnez une seule cellule exprimant à la fois la cerise LightR-Src rapide et Src un IRFP. Sélectionnez des régions d’intérêt spécifiques dans la cellule à éclairer. Pour cette étude, choisissez une petite zone à la périphérie de la cellule sélectionnée.

Imagez la cellule sélectionnée toutes les minutes pendant 20 minutes à l’état basal avant l’éclairage. Continuez l’imagerie pendant 50 minutes tout en éclairant localement, puis 20 minutes après l’activation pour un total de 90 minutes. Après l’imagerie, enregistrez les films au format de fichier tif stack pour analyse.

L’illumination globale des cellules hela a conduit à la localisation des adhérences rapides de LightR-Src aux focales, qui ont été inversées une fois la lumière bleue éteinte. Cet éclairage a également provoqué une augmentation significative de la propagation des cellules, qui s’est arrêtée une fois la lumière bleue éteinte. Le mutant catalytique inactif D388 R-LightR-Src n’a montré aucune propagation cellulaire.

L’éclairage localisé des cellules hela exprimant rapidement LightR-Src a entraîné l’accumulation de la construction dans les adhérences focales, conduisant à des protubérances membranaires localisées avec un éclairage de 50 minutes. Aucun autre gain de surface n’a été observé dans l’obscurité de 20 minutes après l’illumination. Fast LightR-Src a progressivement disparu des adhérences focales dans la phase sombre.

Le centroïde cellulaire s’est déplacé vers la région éclairée. Suite à l’activation rapide de LightR-Src, indiquant un mouvement cellulaire dirigé.