Name: Visualisation de pièges extracellulaires de neutrophiles dans les veinules mésentériques après une lésion d’ischémie-reperfusion mésentérique par microscopie intravitale (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-27T14:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 5 s
Description: Découvrez la visualisation des pièges extracellulaires de neutrophiles dans les veinules mésentériques après une lésion d'ischémie-reperfusion par microscopie intravitale chez la souris.

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<meta charset="utf8"></head><body>Rôle endothélial de PAR1 dans l’adhésion des leucocytes et la formation de TNE lors d’une lésion I/R

<table><tbody><tr><td>Orange acridine</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp ;</td><td>&nbsp ; A-6014</td><td></td></tr><tr><td>Plaque à 96 puits Multiply PCR-Platten&nbsp ;</td><td>Sarstedt</td><td>721977202.00</td><td></td></tr><tr><td>Systèmes d’anesthésie pour rongeurs</td><td>GROPPLER medizintechnik</td><td>Uni Vet -Porta T-8</td><td></td></tr><tr><td>Aqua ad injectabilia IVM</td><td>B Braun Melsungen</td><td>53402101</td><td></td></tr><tr><td>pâte à</td> modeler <td>noire Staedtler</td><td></td><td>Pâte à modeler</td></tr><tr><td>CD146 Microbilles, souris</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-007</td><td></td></tr><tr><td>cellSens</td><td>Olympus Olympus</td><td>cellSense Dimension Desktop 2.3</td><td>logiciel</td></tr> appareil <tr><td>à couplage de charge</td><td>appareil photo Hamamatsu Photonics</td><td>ORCA-R2</td><td></td></tr><tr><td>appareil tampons en coton</td><td>B&ouml ; ttger</td><td>09-119-9100</td><td></td></tr><tr><td>Boîtier incurvé 125mm/5"</td><td>Indigo Instruments&nbsp ;</td><td>22466</td><td></td></tr><tr><td>Crème dépilatoire</td><td>Balea</td><td>sans objet</td><td></td></tr><tr><td>Dorbene Vet</td><td>zoetis</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dumont Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-35</td><td></td></tr><tr><td>Éthanol p.a. 99,5 %</td><td>Roth</td><td>5504.20</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux extra étroits &ndash ; Droit/Sharp-Sharp/10.5</td><td>FST</td><td>14088-10</td><td></td></tr><tr><td>Fentanyl</td><td>Janssen-Cilag GmBH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Forceps « Dumont #5 » (Inox, pointe 0.1mm, longueur 11 cm)</td><td>FST</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>GentleMACS C Tubes</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-236</td><td></td></tr><tr><td>Graphpadprism</td><td>Graphpad</td><td>Prism 10</td><td>software</td></tr><tr><td>isoflurane&nbsp ;</td><td>Piramal</td><td>4150097146757.00</td><td></td></tr><tr><td>iTaq UniversalSYBR Green Supermix 10x5ml</td><td>BioRad</td><td>1725125.00</td><td></td></tr><tr><td>Leukofix medical tape</td><td>BSNMedical</td><td>0213600</td><td></td></tr><tr><td>Kit de dissociation du foie, souris</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-105-807</td><td></td></tr><tr><td>LS-Colonnes de séparation MACS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>MACS Smart Strainer 100 et micro ; m</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-098-463</td><td></td></tr><tr><td>Microseal B Seal Seals</td><td>Biorad</td><td>MSB1001</td><td></td></tr><tr><td>Midazolam</td><td>hameln</td><td>5918501.00</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Braun</td><td>2350748</td><td></td></tr><tr><td>Porte-aiguille</td><td>FST</td><td>12001-13</td><td></td></tr><tr><td>Suture en soie tressée non résorbable, Taille : 7/0, 91 Mètres&nbsp ;</td><td>Fine Science Tools</td><td>18020-70</td><td></td></tr><tr><td>Olympus BX51WI microscope à fluorescence</td><td>Olympus</td><td></td><td>microscope</td></tr><tr><td>PCR pour bandelettes de tubes</td><td>Sarstedt</td><td>72985002.00</td><td></td></tr><tr><td>Couvercles de tubes PCR</td><td>Sarstedt</td><td>65989002.00</td><td></td></tr><tr><td>Cathéter en pliéthylène</td><td>Smith Medical Deutschland GmbH</td><td>800/100/100</td><td></td></tr><tr><td>Prolene (8648G), Polypropylène 6-0, Nahtmaterial&nbsp ;</td><td>Johnson & Johnson Medical GmbH&nbsp ;</td><td>8695H</td><td></td></tr><tr><td>Relia Prep RNA Miniprep Systems</td><td>Promega</td><td>Z6112</td><td></td></tr><tr><td>Kit de Tanscription Inversée (ADNc Haute Capacité)</td><td>Applied Biosystems</td><td>4368813.00</td><td></td></tr><tr><td>Balance pour école&nbsp ;</td><td>KERN & SOHN GmbH</td><td>EMB 500-1</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux à ressort - Coudés sur le côté</td><td>FST</td><td>15006-09</td><td></td></tr><tr><td>Stéréomicroscope</td><td>Leica</td><td>M50</td><td></td></tr><tr><td>Hémostats droits 135mm/5.5"</td><td>Indigo Instruments&nbsp ;</td><td>22468</td><td></td></tr><tr><td>Seringue 1 mL</td><td>Braun</td><td>9166017V</td><td></td></tr><tr><td>SYTOX Orange</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S11368</td><td></td></tr><tr><td>Régulateur de température TC-1000</td><td>FMI F&ouml ; hr Medical Instruments GmbH</td><td>non applicable</td><td></td></tr><tr><td>Pince à tissus - 1x2 dents</td><td>FST</td><td>18057-14</td><td></td></tr><tr><td>pince vasculaire</td><td>Fine Science Tools</td><td>18055-02</td><td></td></tr><tr><td>Vetiva mini</td><td>WAHL</td><td>1584-0480</td><td></td></tr></tbody></table>

visualisation de pièges extracellulaires de neutrophiles dans les veinules mésentériques après une lésion d’ischémie-reperfusion mésentérique par microscopie intravitale

Visualization of Neutrophil Extracellular Traps in Mesenteric Venules After Mesenteric Ischemia-Reperfusion Injury via Intravital Microscopy

Pour étudier les effets dépendants des cellules endothéliales sur le roulement et l’adhésion des leucocytes ainsi que sur la formation de NET, l’efficacité du déficit en F2r inductible par VE-Cadherin Cre a été initialement examinée dans les cellules endothéliales. Le tri magnétique des cellules a été utilisé pour isoler les cellules endothéliales hépatiques. Par la suite, l’ARN a été isolé, suivi d’une PCR quantitative en temps réel (qRT-PCR). Les souris F2rΔEC , chez lesquelles la recombinase Cre exprimée sous le contrôle du promoteur VE-Cadhérine est absente, ont montré des niveaux d’ARNm F2r (PAR1) significativement réduits (environ d’un tiers) par rapport aux témoins WT (Figure 1).
Après confirmation de la déficience dans la lignée de souris, une lésion mésentérique I/R a été réalisée pour examiner l’impact de PAR1 exprimé par les cellules endothéliales vasculaires sur le roulement et l’adhésion des leucocytes, visualisé par microscopie intravitale (Figure 2A,B). Après 1 h d’ischémie, la pince a été retirée et le récipient a été laissé reperfuser. Le roulement et l’adhérence des leucocytes ont été observés et enregistrés (colorés en vert, indiqués par des flèches blanches). Bien que les deux groupes aient montré une augmentation du nombre de leucocytes adhérents après une lésion I/R, le déficit en F2r endothélial (PAR1) a entraîné une diminution marquée mais non significative de l’adhésion des leucocytes à l’endothélium mésentérique activé par I/R, suggérant un rôle actif de l’activation endothéliale de PAR1 dans le recrutement des leucocytes dans les veinules mésentériques ischémiques (Figure 2C).
L’objectif suivant était d’examiner si l’expression endothéliale de PAR1 régule la formation de TNE induite par les lésions I/R. Par conséquent, les acides nucléiques extracellulaires ont été colorés avec un colorant imperméable aux cellules30, et les TNE générées ont été visualisées à l’aide de la microscopie intravitale (indiquée par des flèches noires) (Figure 2A, B). Après une lésion I/R, des TNE n’ont été observées que dans le groupe WT exprimant des niveaux normaux de PAR1 sur les cellules endothéliales, indiquant un rôle régulateur de PAR1 dans la NETosis (Figure 2C, D). Notamment, lorsque l’expression endothéliale de F2r a été supprimée, aucune TNE n’était présente dans les veinules mésentériques endommagées par l’I/R.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67264/67264fig01.jpg"> 
Figure 1 : Expression de l’ARNm F2r (PAR1). Expression des cellules endothéliales hépatiques F2r des souris WT (n = 6) et F2rΔEC (n = 9) par rapport au gène L32 housekeeping. Les données sont présentées sous forme de médiane avec un intervalle de confiance de 95 %. Le test de Mann-Whitney a été utilisé pour comparer deux groupes indépendants, *p &lt; 0,05. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67264/67264fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67264/67264fig02.jpg"> 
Figure 2 : Le PAR1 endothélial affecte l’adhésion des leucocytes et la formation de TNE dans les veinules mésentériques endommagées par l’I/R. Images représentatives de la microscopie intravitale de leucocytes adhérents colorés à l’orange acridine (flèches blanches) et de TNE colorées à l’orange Sytox (flèches noires) de souris WT et F2rΔEC avant (avant) et après (post) lésion I/R (A) 10x et (B) grossissement 20x. Barres d’échelle : A, 50 μm ; B, 20 μm. (C) Adhérence des leucocytes et (D) TNE par mm2 de souris WT (n = 7) et F2rΔEC (n = 4) avant (avant) et après (après) lésion I/R. Toutes les données ont été représentées sous forme de médiane avec un intervalle de confiance de 95 %. Des comparaisons statistiques ont été effectuées à l’aide du test ANOVA à deux facteurs, **p&lt; 0,01, et des tests de comparaison multiples de Sídák pour comparer les moyennes de différents génotypes à chaque point temporel (pré et post-ischémie). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67264/67264fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>

Visualisation de pièges extracellulaires de neutrophiles dans les veinules mésentériques après une lésion d’ischémie-reperfusion mésentérique par microscopie intravitale

Intestinal ischemia-reperfusion (I/R) injury is an acute condition characterized by tissue damage resulting from restricted blood flow to the mesenteric ...

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Neutrophiles pièges extracellulaires (NET) sont un important mécanisme immunitaire inné pour combattre les bactéries pathogènes, champignons et parasites. Nous décrivons ici les méthodes d'isoler granulocytes neutrophiles dans le sang humain et de les activer pour former NET. Nous présentons les techniques de préparation de visualiser NET en microscopie optique et électronique.

Neutrophiles pièges extracellulaires: Comment générer et de les visualiser

Nous décrivons un protocole de fond clair microscopie intravitale pour la mesure dynamique des interactions cellulaires des neutrophiles-endothélium lors du recrutement des neutrophiles en réponse à la source d'un facteur chimiotactique des neutrophiles in vivo. Neutrophiles ramper intraluminale, migration trans et le chimiotactisme dans les tissus de souris crémaster sont visualisés avec la photographie vidéo en temps-caduque et suivis avec ImageJ.

Suivi des rampants neutrophiles intraluminale, migration trans et le chimiotactisme dans les tissus par microscopie intravitale Vidéo

Cette vidéo montre l’induction et la visualisation de pièges extracellulaires de neutrophiles ou TNE dans des neutrophiles pré-marqués à l’aide de sérum de patient contenant des anticorps cytoplasmiques anti-neutrophiles. De plus, l’utilisation d’un colorant d’ADN imperméable et la microscopie à fluorescence permettent de visualiser les TNE.

Induction et visualisation de pièges extracellulaires de neutrophiles dans des neutrophiles pré-marqués

Nous rapportons ici une technique expérimentale de la microscopie de fluorescence intravitale de visualiser hétérotypiques plaquettes neutrophiles interactions sur l'endothélium activé lors de l'inflammation vasculaire et la formation de thrombus chez des souris vivantes. Cette technologie microscopique seront très utiles pour étudier le mécanisme moléculaire de la maladie vasculaire et de tester des agents pharmacologiques dans des conditions physiopathologiques.

Imagerie en temps réel des hétérotypique plaquettes neutrophiles interactions sur l&#39;endothélium activé lors de l&#39;inflammation vasculaire et la formation de thrombus chez des souris vivantes

Cette application simplifiée de la microscopie intravitale des veines du mésentère chez la souris peut être utilisée dans différents modèles d’inflammation pour observer les interactions leucocytes-endothéliales et plaquettes-leucocytes.

Interactions Microscopie intravitale des leucocytes endothéliaux et plaquettes-leucocytes dans mésentériques veines chez les souris

Nous détaillons un protocole pour surveiller le comportement des neutrophiles et des monocytes dans les veines mésentériques à l’état d’équilibre et dans des conditions inflammatoires en utilisant la microscopie confocale intravitale sur des souris anesthésiées.

Imagerie neutrophiles et des monocytes dans les veines mésentérique par Microscopie intravitale sur des souris anesthésiées en temps réel

Ce protocole décrit l'induction d'un modèle d'ischémie-reperfusion (IR) sur la peau de l'oreille de la souris utilisant un aimant de serrage. En utilisant un modèle d'imagerie intravitale sur mesure, nous étudions dans les réponses inflammatoires in vivo post-reperfusion. La raison derrière le développement de cette technique est d'étendre la compréhension de la façon dont les leucocytes réagissent aux blessures IR de la peau.

Induire ischémie-reperfusion chez la souris Ear Skin pour Intravitale multiphotonique Imaging des réponses immunitaires

Les monocytes sont des médiateurs importants d’arteriogenesis dans le contexte de la maladie artérielle périphérique. En utilisant une matrice de type membrane basale et la microscopie intravitale, ce protocole étudie monocyte autoguidage et axés sur la tumeur de l’angiogenèse après injection de monocytes dans le modèle murin de la ligature de l’artère fémorale.

Microscopie intravitale de Monocyte Homing et axés sur la tumeur de l’angiogenèse dans un modèle murin de la maladie artérielle périphérique

Les pièges extracellulaires de Neutrophile (NET) sont des structures tridimensionnelles produites par les granulocytes neutrophiles stimulés. Il est devenu clair ces dernières années que les ENe sont impliqués dans une grande variété de maladies. La détection des EAE dans les tissus peut avoir une pertinence diagnostique, de sorte que des protocoles normalisés pour l'étiquetage des composants NET sont nécessaires.

Immunofluorescence Étiquetage des pièges extracellulaires de l'homme et de la murine Neutrophil dans les tissus paraffins

Nous décrivons une méthode pour identifier les pièges extracellulaires neutrophiles (NET) dans le formaldéhyde-fixe et paraffin-intégré thrombi cardiogénique félin utilisant la récupération d’antigène induite par la chaleur et un protocole d’immunolabeling double.

Identification des pièges extracellulaires Neutrophil dans paraffin-Embedded Feline Arterial Thrombi à l’aide de la microscopie à l’immunofluorescence

Les pièges extracellulaires neutrophiles (TNE) sont associés à diverses maladies, et l’immunofluorescence est souvent utilisée pour leur visualisation. Cependant, il existe différents protocoles de coloration et, dans de nombreux cas, un seul type de tissu est examiné. Ici, nous établissons un protocole d’application générale pour la coloration des TNE dans les tissus de souris et d’humains.

Imagerie par immunofluorescence des pièges extracellulaires des neutrophiles dans les tissus humains et murins

Découvrez la visualisation des pièges extracellulaires de neutrophiles dans les veinules mésentériques après une lésion d'ischémie-reperfusion par microscopie intravitale chez la souris.

Visualisation de pièges extracellulaires de neutrophiles dans les veinules mésentériques après une lésion d’ischémie-reperfusion mésentérique par microscopie intravitale (Vidéo) | JoVE Journal

Visualisation de pièges extracellulaires de neutrophiles dans les veinules mésentériques après une lésion d’ischémie-reperfusion mésentérique par microscopie intravitale

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