Visualisation de pièges extracellulaires de neutrophiles dans les veinules mésentériques après une lésion d’ischémie-reperfusion mésentérique par microscopie intravitale

Le rôle de gènes particuliers dans l’apparition et le développement de la thrombose, dans ce cas, nous étudions l’expression endothéliale de PAR1 sur les lésions d’ischémie-reperfusion. Nous essayons de déterminer l’effet de l’endothélium sur la réponse, à la fois après l’ischémie et pendant la reperfusion. Un aspect très important qui n’a pas été étudié jusqu’à présent est de déterminer le rôle des commensaux intestinaux dans les lésions d’ischémie-reperfusion mésentérique.

Pour étudier cette question, notre groupe a combiné la microscopie intravitale avec un modèle de lésion d’ischémie-reperfusion mésentérique, et nous l’avons combiné avec des modèles de souris sans germes. L’application de modèles de thrombose à des souris transgéniques en combinaison avec la microscopie intravitale, de telles technologies permettent l’observation in vivo des comportements cellulaires au début de la maladie. Réaliser des modèles expérimentaux sur un organisme vivant est toujours un défi, car l’expérience est influencée par de nombreux facteurs, notamment le sexe, l’âge, le traitement d’anesthésie, les modifications de la réglementation sur le bien-être animal, etc.

De plus, la recherche sur la thrombose a commencé au siècle dernier. De nombreux facteurs contributifs restent encore non résolus. Mon groupe étudie le rôle du microbiote intestinal sur la thrombose, l’athérosclérose, la fonction plaquettaire et la vascularisation.

Pour commencer, placez la souris anesthésiée et rasée dans un décubitus dorsal sur un coussin chauffant. Connectez la souris au système d’oxygène via un cône nasal. Fixez les membres de la souris au coussin chauffant avec du ruban chirurgical.

Pour l’implantation du cathéter dans la veine jugulaire, faites une incision transversale sur la trachée. Retirez la peau qui recouvre le cou et isolez la veine jugulaire droite. Ensuite, à l’aide d’un fil de soie de cinq centimètres, fermez l’extrémité distale de la veine et fixez-la avec une pince chirurgicale.

Placez trois fils de soie à environ deux centimètres sous la veine, un près de l’extrémité distale et deux près de l’extrémité proximale de la veine jugulaire. Faites un nœud chirurgical, mais ne fermez pas le vaisseau. Remplissez un cathéter en polyéthylène avec du chlorure de sodium à 0,9 %.

Retirez les bulles d’air et branchez-le dans une seringue d’un millilitre. Utilisez des ciseaux pour percer un trou entre le deuxième et le troisième nœud et implantez le cathéter dans la veine jugulaire. Aspirez la seringue pour vous assurer qu’il y a du sang dans le cathéter.

Attachez le fil de soie pour fixer le cathéter dans la veine. Ensuite, utilisez un ruban adhésif médical pour fixer la seringue. Remplissez des seringues d’un millilitre d’orange acridine à une concentration finale de 0,5 milligramme par millilitre et d’un colorant d’acide nucléique à une concentration de cinq micromolaires.

Injecter 50 microlitres de SYTOX Orange pour les pièges extracellulaires neutrophiles, ou TNE. Désinfectez la peau abdominale de la souris avec une alternance de gommages à base d’iode et d’alcool. Ensuite, à l’aide d’un scalpel, effectuez une laparotomie de trois à cinq centimètres le long de l’alba linéaire.

Positionnez doucement l’intestin hors de la cavité abdominale à l’aide de deux cotons-tiges humidifiés dans une solution saline et identifiez un endroit avec une couverture de graisse minimale. Placez les petites branches de l’intestin sur une pâte noire pour réduire le signal de fond. Injectez 50 microlitres d’orange acridine à travers le cathéter de la veine jugulaire pour visualiser les leucocytes colorés.

Acquérir la vidéo de l’intestin avant la reperfusion de l’ischémie. Préparez une compresse imbibée de chlorure de sodium et placez-y l’intestin. Occlure l’artère mésentérique supérieure à l’aide d’une petite pince vasculaire.

Repoussez doucement l’intestin dans la cavité abdominale à l’aide de cotons-tiges imbibés de solution saline. Utilisez une suture 7-0 pour fermer la paroi abdominale et éviter la perte d’humidité et de température. Au bout d’une heure, retirez la suture.

Après la période ischémique, appliquez quelques gouttes de solution saline sur la zone tondue. Ensuite, retirez délicatement les clips microvasculaires à l’aide d’un applicateur de clip. À l’aide d’embouts en coton imbibés d’une solution saline, repositionnez doucement l’intestin hors de la cavité abdominale et positionnez les petites branches de la veine sur une pâte noire.

Injectez 50 microlitres d’orange acridine et capturez la vidéo post-ischémique de la veine. Allumez le microscope à fluorescence à grande vitesse et à grand champ équipé d’un condenseur longue distance, d’un monochromateur, d’un objectif à immersion dans l’eau 10 fois et d’une caméra à dispositif à couplage de charge. Réglez le temps d’exposition à 30 millisecondes et sélectionnez le canal 5B avec les filtres Alexa Fluor 488 et Rhodamine Red installés pour visualiser les leucocytes et les TNE.

Quantifiez le recrutement cellulaire dans une région d’intérêt de 0,06 millimètre carré. Ensuite, quantifiez les leucocytes adhérents en comptant les cellules qui sont restées stationnaires ou attachées à la muqueuse endothéliale pendant une période d’observation de 20 secondes. Identifier les TNE marquées à l’aide de colorants fluorescents à base de leucocytes et d’acides nucléiques.

L’adhésion leucocytaire à l’endothélium mésentérique ischémique a augmenté dans les groupes EC de type sauvage et F2r delta après une lésion d’ischémie-reperfusion, avec une adhérence notablement plus faible observée dans le groupe EC delta F2r, ce qui implique un rôle de PAR1 endothélial dans le recrutement des leucocytes. Après une lésion d’ischémie-reperfusion, des TNE n’ont été observées que dans le groupe de type sauvage exprimant des niveaux normaux de PAR1 sur les cellules endothéliales, indiquant un rôle régulateur de PAR1 dans la NETose.