Name: Utilisation de Mycobacterium smegmatis comme bioindicateur des conditions de croissance limitées en zinc chez les mycobactéries (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-20T14:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 24 s
Description: Découvrez comment utiliser Mycobacterium smegmatis comme bioindicateur des conditions de croissance limitées en zinc chez les mycobactéries. Cette méthode standardisée permet d'étudier les réponses physiologiques et les interactions hôte-pathogène.

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Cette étude a été financée par le CAREER Award 1844854 de la National Science Foundation (NSF), le prix de l'innovation IA -937538 de l'American Lung Association et le NIAID R21 de l'Institut national de la santé (NIH) AI109293 à S.P. L'adresse actuelle d'Allexa D. Burger est le Pacific Biosciences Research Center, University of Hawai'i at Mānoa, Honolulu, Hawaii, États-Unis.

Assessing Bioindicator Phenotypes for Zinc Limitation in M. smegmatis

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<li>Middag, R., de Baar, H. J. W., Bruland, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+relationships+between+dissolved+zinc+and+major+nutrients+phosphate+and+silicate+along+the+GEOTRACES+GA02+transect+in+the+west+Atlantic+ocean%5BTitle%5D)+AND+%22Global+Biogeochem+Cycles%22%5BJournal%5D)">The relationships between dissolved zinc and major nutrients phosphate and silicate along the GEOTRACES GA02 transect in the west Atlantic ocean.</a> Global Biogeochem Cycles. 33 (1), 63-84 (2019).</li>
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<li>Panina, E. M., Mironov, A. A., Gelfand, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+genomics+of+bacterial+zinc+regulons%3A+Enhanced+ion+transport%2C+pathogenesis%2C+and+rearrangement+of+ribosomal+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Comparative genomics of bacterial zinc regulons: Enhanced ion transport, pathogenesis, and rearrangement of ribosomal proteins.</a> Proc Natl Acad Sci. 100 (17), 9912-9917 (2003).</li>
<li>Outten, C. E., O’Halloran, T. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Femtomolar+sensitivity+of+metalloregulatory+proteins+controlling+zinc+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Femtomolar sensitivity of metalloregulatory proteins controlling zinc homeostasis.</a> Science. 292 (5526), 2488-2492 (2001).</li>
<li>Merchant, S. S., Helmann, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elemental+economy%3A+microbial+strategies+for+optimizing+growth+in+the+face+of+nutrient+limitation%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Micro+Physiol%22%5BJournal%5D)">Elemental economy: microbial strategies for optimizing growth in the face of nutrient limitation.</a> Adv Micro Physiol. 60, 91-210 (2012).</li>
<li>Makarova, K. S., Ponomarev, V. A., Koonin, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+C+or+not+two+C%3A+recurrent+disruption+of+Zn-ribbons%2C+gene+duplication%2C+lineage-specific+gene+loss%2C+and+horizontal+gene+transfer+in+evolution+of+bacterial+ribosomal+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Genom+Biol%22%5BJournal%5D)">Two C or not two C: recurrent disruption of Zn-ribbons, gene duplication, lineage-specific gene loss, and horizontal gene transfer in evolution of bacterial ribosomal proteins.</a> Genom Biol. 2 (9), RESEARCH 0033(2001).</li>
<li>Yutin, N., Puigbò, P., Koonin, E. V., Wolf, Y. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phylogenomics+of+prokaryotic+ribosomal+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Phylogenomics of prokaryotic ribosomal proteins.</a> PLoS One. 7 (5), e36972(2012).</li>
<li>Prisic, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zinc+regulates+a+switch+between+primary+and+alternative+S18+ribosomal+proteins+in+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Zinc regulates a switch between primary and alternative S18 ribosomal proteins in Mycobacterium tuberculosis.</a> Mol Microbiol. 97 (2), 263-280 (2015).</li>
<li>Dow, A., Prisic, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+ribosomal+proteins+are+required+for+growth+and+morphogenesis+of+Mycobacterium+smegmatis+under+zinc+limiting+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Alternative ribosomal proteins are required for growth and morphogenesis of Mycobacterium smegmatis under zinc limiting conditions.</a> PLoS One. 13 (4), e0196300(2018).</li>
<li>Chen, Y. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+translation+by+alternative+bacterial+ribosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Selective translation by alternative bacterial ribosomes.</a> Proc Natl Acad Sci. 117 (32), 19487-19496 (2020).</li>
<li>Natori, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fail-safe+system+for+the+ribosome+under+zinc-limiting+conditions+in+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A fail-safe system for the ribosome under zinc-limiting conditions in Bacillus subtilis.</a> Mol Microbiol. 63 (1), 294-307 (2007).</li>
<li>Gabriel, S. E., Helmann, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contributions+of+Zur-controlled+ribosomal+proteins+to+growth+under+zinc+starvation+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Contributions of Zur-controlled ribosomal proteins to growth under zinc starvation conditions.</a> J Bacteriol. 191 (19), 6116-6122 (2009).</li>
<li>Wolf, Y. I., Rogozin, I. B., Kondrashov, A. S., Koonin, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+alignment%2C+evolution+of+prokaryotic+genome+organization%2C+and+prediction+of+gene+function+using+genomic+context%5BTitle%5D)+AND+%22Genom+Res%22%5BJournal%5D)">Genome alignment, evolution of prokaryotic genome organization, and prediction of gene function using genomic context.</a> Genom Res. 11 (3), 356-372 (2001).</li>
<li>Akanuma, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+ribosomal+protein+S14+demonstrated+by+the+reconstruction+of+chimeric+ribosomes+in+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Evolution of ribosomal protein S14 demonstrated by the reconstruction of chimeric ribosomes in Bacillus subtilis.</a> J Bacteriol. 203 (10), e00599(2021).</li>
<li>Owen, G. A., Pascoe, B., Kallifidas, D., Paget, M. S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zinc-responsive+regulation+of+alternative+ribosomal+protein+genes+in+Streptomyces+coelicolor+involves+Zur+and+%CF%83R%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Zinc-responsive regulation of alternative ribosomal protein genes in Streptomyces coelicolor involves Zur and σR.</a> J Bacteriol. 189 (11), 4078-4086 (2007).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zinc+depletion+induces+ribosome+hibernation+in+mycobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Zinc depletion induces ribosome hibernation in mycobacteria.</a> Proc Natl Acad Sci. 115 (32), 8191-8196 (2018).</li>
<li>Li, Y., Corro, J. H., Palmer, C. D., Ojha, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progression+from+remodeling+to+hibernation+of+ribosomes+in+zinc-starved+mycobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Progression from remodeling to hibernation of ribosomes in zinc-starved mycobacteria.</a> Proc Natl Acad Sci. 117 (32), 19528-19537 (2020).</li>
<li>Graham, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Severe+zinc+depletion+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Severe zinc depletion of Escherichia coli.</a> J Biol Chem. 284 (27), 18377-18389 (2009).</li>
<li>Greening, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiology%2C+biochemistry%2C+and+applications+of+F420-+and+Fo-dependent+redox+reactions%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Mol+Biol+Rev%22%5BJournal%5D)">Physiology, biochemistry, and applications of F420- and Fo-dependent redox reactions.</a> Microbiol Mol Biol Rev. 80 (2), 451-493 (2016).</li>
<li>Gurumurthy, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+F+420+-dependent+anti-oxidant+mechanism+protects+Mycobacterium+tuberculosis+against+oxidative+stress+and+bactericidal+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A novel F 420 -dependent anti-oxidant mechanism protects Mycobacterium tuberculosis against oxidative stress and bactericidal agents.</a> Mol Microbiol. 87 (4), 744-755 (2013).</li>
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</ol>

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts.

Une contribution majeure au manque de connaissances sur les fondements mécanistes des ribosomes Alt est la difficulté d’obtenir des conditions limitant le Zn2+ in vitro. La contamination à l’état de tracesZn 2+ en laboratoire est courante ; il est donc difficile d’obtenir des conditions de croissance reproductibles limitées en Zn2+. La contamination par le Zn2+ peut provenir de plusieurs sources, bien que la source la plus importante et la plus courante de contamination et de variabilité soit l’eau ultrapure utilisée pour rincer le matériel de laboratoire et fabriquer des milieux. Les systèmes d’eau ultrapure doivent être correctement entretenus et doivent être rincés pendant 1 minute avant de rincer le matériel de laboratoire ou d’utiliser de l’eau pour les fluides. Les flacons qui ne sont pas bien lavés ou rincés avec de l’eau ultrapure peuvent provoquer une contamination par le Zn2+ , ce qui se manifestera par l’augmentation de la densité cellulaire dans certains flacons, mais pas dans d’autres du même lot de ZLM. Des flacons neufs peuvent être utilisés pour évaluer si la source de contamination au Zn2+ provient de flacons ou de milieux réutilisés. La contamination par le Zn2+ dans le ZLM doit être corrigée par un rinçage accru des articles utilisés pour la fabrication des milieux et d’un ensemble désigné de matériaux pour la préparation du ZLM. Si aucune de ces mesures ne permet d’obtenir les phénotypes de bioindicateurs attendus, le [Zn2+] dans l’eau ultrapure et le ZLM doit être quantifié pour exclure la possibilité que la source d’eau soit contaminée par du Zn2+. Comme indiqué précédemment, le [Zn2+] du ZLM est de 115 ± 37 nM23, et des concentrations inférieures à 70 nM et supérieures à 150 nM ont généralement conduit à des phénotypes appauvris en Zn2+ et contaminés en Zn2+, respectivement. Cependant, une bonne préparation du milieu n’est qu’un facteur parmi d’autres qui influe sur le résultat, et une quantité insuffisante ou excessive de Zn2+ peut se produire en raison d’une préparation inadéquate de l’inoculum et/ou d’une culturation, c’est-à-dire d’une mauvaise décantation du milieu rempli de Zn2+ pendant les étapes de lavage. Toutes les cultures de M. smegmatis incluses ici ont été préparées de la même manière - les résultats de croissance contaminés en Zn2+ (ZLM-C) et appauvris en Zn2+ (ZLM-D) sont inclus pour mettre en évidence la variabilité qui peut se produire entre différents lots de milieux utilisant le même système d’eau ultrapure, même lorsque les expériences sont faites correctement.
Pour s’assurer que la culture de cellules dans ZLM produit des phénotypes de bioindicateurs limitants de Zn2+ reproductibles, il est important d’étiqueter de manière unique les flacons, de toujours les utiliser pour la même condition (c’est-à-dire avec ZLM ou ZRM), de suivre les flacons sur plusieurs utilisations et de jeter les flacons qui sont en fin de cycle de vie, ou qui continuent de produire des phénotypes de bioindicateurs contaminés par le Zn2+ avec ZLM. Une bonne préparation de l’inoculum est très importante pour obtenir une croissance limitant le Zn2+, car le transfert de Zn2+ provenant de cellules de semences mal lavées est une source courante de contamination par le Zn2+ qui peut être difficile à analyser à partir de ZLM contaminé par le Zn2+. Les cultures de M. smegmatis doivent être analysées et récoltées après 72 h de croissance dans les ZLM (et les ZRM cultivées en parallèle). La morphogenèse et les phénotypes des bioindicateurs sont prononcés de 48 à 72 h ; par conséquent, l’évaluation ou la récolte trop tôt (ou trop tard) des cultures pour la limitation de Zn2+ peut ne pas produire le phénotype complet du bioindicateur. Les cultures qui sont appauvries en Zn2+ présenteront des longueurs cellulaires similaires à celles qui sont contaminées par le Zn2+ ; ainsi, la fluorescence F420 et OD600 doivent être utilisées pour différencier les deux. De même, les cultures contaminées par le Zn2+ ne se développent pas toujours mieux que les bactéries limitées en Zn2+, mais la fluorescence du F420 et la longueur cellulaire du type sauvage et du mutant ΔaltRP devraient révéler si la condition limitée en Zn2+ est atteinte.
Il en va de même pour M. tuberculosis, car la perte du phénotype bio-indicateur F420 dans les cultures limitées en Zn2+ est prononcée entre 8 et 10 jours de croissance dans le ZLM. Bien que M. tuberculosis ne présente pas un fort phénotype de bio-indicateur limité en Zn2+ comme M. smegmatis, la méthode de croissance présentée ici a été utilisée pour associer la perte du phénotype du bio-indicateur F420 à la croissance limitée en Zn2+ à l’aide d’essais fonctionnels et de transcriptomique dans les souches virulentes et atténuées de M. tuberculosis (réf23et données non publiées). Par conséquent, suivre la fluorescence deF420 est un moyen accessible de surveiller et de vérifier les conditions biologiques limitantes de Zn2+ chez M. tuberculosis. Il est important de noter que le mécanisme conduisant à la réduction de la fluorescence deF420 dans des conditions de limitation de Zn2+ n’est pas résolu, tout comme la distinction selon que la fluorescence réduite est due à une diminution de l’abondance du pool de coenzymes dans son ensemble ou à un changement de son état redox puisque seule la forme oxydée émet une fluorescence29.
Comme démontré ici, la préparation des milieux limitant le Zn2+ est nuancée, et de nombreux facteurs peuvent influencer la concentration efficace des ions Zn2+ dans le milieu, même en suivant le même protocole et en utilisant les mêmes réactifs. Les traces de Zn2+ dans ZLM permettent une croissance et une expression suffisantes du phénotype limitant le Zn2+. Cette diminution progressive de Zn2+ pour atteindre la limitation est similaire au modèle Wayne de l’hypoxie dans lequel l’oxygène est progressivement consommé par des bactéries cultivées dans un ballon fermé30. Étant donné que l’hypoxie et les phénotypes limités à Zn2+ dépendent de la croissance bactérienne, s’il n’y a pas assez d’oxygène, ou dans ce modèle, de Zn2+, dans l’inoculum ou le milieu, les bactéries cesseront de croître avant de pouvoir subir le programme morphogénique approprié. Par conséquent, alors que la contamination en Zn2+ est un problème plus évident lorsque l’on souhaite atteindre la limitation de Zn2+ , l’épuisement en Zn2+ pourrait également présenter un problème en raison du retard de croissance et du déclencheur dépendant du Zn2+ manqué pendant la croissance active. De plus, l’utilisation de lecteurs de plaques monochromateurs ou à filtre avec des modes de lecture par le haut ou par le bas pour l’intensité de fluorescence affecte légèrement le pourcentage F375/420 calculé. Par conséquent, les valeurs de chaque laboratoire peuvent ne pas être directement comparables à celles présentées ici, mais elles doivent être similaires et suivre les mêmes tendances. Ainsi, les méthodes et les procédures de fabrication de ZLM qui produit une croissance limitant le Zn2+ devraient être optimisées pour chaque laboratoire et système d’eau ultrapure, et les phénotypes de bioindicateurs présentés ici devraient être utilisés comme norme pour définir les conditions limitant le Zn2+.
En raison de la difficulté de normaliser et de reproduire les conditions de croissance limitées par le Zn2+, une approche accessible pour contourner la contamination par le Zn2+ consiste à ajouter un agent chélateur à un milieu préparé sans ajout de Zn2+. Cependant, cette approche confond la véritable réponse biologique à la limitation de Zn2+, créant souvent un environnement affamé de Zn2+ et d’autres micronutriments. Il a été démontré que même les agents chélateurs spécifiques du Zn2+ régulent à la hausse la réponse à la carence en fer, en plus de la réponse transcriptionnelle dépendante du Zn2+ chez M. tuberculosis23. De plus, l’utilisation d’agents chélateurs nécessite un titrage et un timing minutieux pour éviter un environnement gravement affamé en Zn2+ qui ne reflète pas la réponse biologique lors du passage de conditions riches en Zn2+ à des conditions limitées en Zn2+ ou la croissance subie dans des environnements où la disponibilité libre de Zn2+ est limitée. Enfin, l’ajout d’agents chélateurs peut ne pas être compatible avec les applications en aval (par exemple, les infections de macrophages ou d’animaux). Des conclusions fondamentalement différentes ont été tirées sur la forme et la fonction des ribosomes Alt obtenus avec des agents chélateurs par rapport à la déplétion progressive en Zn2+ dans les cultures en croissance active17,24. On met en évidence ici différents phénotypes résultant de différences relativement mineures de pureté de l’eau dans différents lots de milieux, même lorsque la procédure est effectuée correctement. Le système quantifiable, reproductible et biologiquement pertinent de génération de ribosomes Alt présenté ici, c’est-à-dire dans des cultures de type sauvage limitées en Zn2+ sans ajout de chélateurs, offre une méthode standardisée qui sera primordiale pour unifier les contributions à travers le domaine vers une meilleure compréhension de la biologie alternative des ribosomes.

L’ion zinc (Zn2+) est un micronutriment essentiel et un composant standard des milieux microbiologiques. Cependant, de nombreuses bactéries subissent une limitation de Zn2+ dans l’environnement, car les conditions de limitation de Zn2+ sont répandues ; soil1, marine2, et les niches au sein de host3 sont souvent limitées en Zn2+. En tant que telles, la plupart des bactéries ont développé des mécanismes pour surmonter la limitation de Zn2+ et préserver la fonction cellulaire4. Les systèmes impliqués dans le maintien de l’homéostasie du Zn2+ sont soumis à un contrôle transcriptionnel strict5 et sont impliqués dans le piégeage du Zn2+ à l’aide de systèmes d’importation de Zn2+ de haute affinité, la mobilisation des réserves cellulaires de Zn2+ et le remplacement de certaines protéines de liaison au Zn2+ par des paralogues alternatifs indépendants du Zn2+6. Un exemple de ce dernier est celui des paralogues de la protéine ribosomique (RP) indépendante du Zn2+, qui sont une caractéristique commune des régulons sensibles au Zn2+ dans les bactéries4. Ces RP hautement divergents indépendants du Zn2+ se distinguent de leurs paralogues de liaison au Zn2+ par la perturbation du motif CXXC de liaison au Zn2+7. Plus de la moitié des génomes procaryotes séquencés contiennent au moins une paire de RP dupliqués où, dans beaucoup d’entre eux, un RP se lie à Zn2+, tandis que son paralogue ne 8. Alors que la notation C+/C- (indiquant la présence/l’absence du motif de liaison au Zn2+ riche en cystéine) est couramment utilisée en référence à ces paires de RP paralogues7, les RP indépendants du Zn2+ ont également été décrits comme des versions alternatives (Alt) des paralogues RP primaires (Prim), liant le Zn2+, puisque les AltRP servent de RP alternatifs pour la biogenèse des ribosomes dans le Zn2+-limité chez certaines bactéries et c’est un mot-clé avec une meilleure facilité de recherche9,10,11.
Comme l’expression d’AltRP est étroitement régulée par Zn2+, il est logique de supposer que l’expression d’AltRP offre une redondance fonctionnelle aux protéines ribosomales dépendantes de Zn2+ face à la limitation de Zn2+. En effet, cette caractéristique des AltRP a été démontrée pour la bactérie modèle du sol Bacillus subtilis, où la croissance est sauvée pendant la limitation de Zn2+ par la libération de la surface PrimRP L31 et le remplacement par l’AltRP L3112,13. Cependant, certains AltRP sont paralogues aux PrimRP de base, par exemple S14, ce qui signifie que leur incorporation est nécessaire pendant la biogenèse des ribosomes12,13. La reconstruction du ribosome avec des AltRP est un programme engagé et énergivore. Bien que ces AltRP centraux puissent servir à libérer Zn2+ du ribosome, il est également possible que certains AltRP aient développé une fonction supplémentaire dans l’environnement limité à Zn2+. Ceci est soutenu par l’observation que les AltRP sont divergents de leurs PrimRP paralogues ; L’homologie de séquence des gènes AltRP est souvent plus élevée entre homologues de différentes espèces qu’avec la séquence du gène PrimRP liant Zn2+ au sein de la même espèce7,10. Parce que les gènes codant pour des AltRP hautement divergents sont sous contrôle transcriptionnel dépendant de Zn2+, ils sont retirés de la pression sélective exercée sur les superopérons ribosomales étroitement régulés et hautement conservés14. La pression sélective découplée sur l’information génétique codant pour la machinerie ribosomique et les AltRP expose ces RP à des trajectoires évolutives différentes de celles des PrimRP homologues et pourrait permettre une évolution spécifique à la lignée du même AltRP chez différentes bactéries10,15. L’existence généralisée des AltRP chez les bactéries et la régulation génétique découplée de ces RP uniques soulèvent une question intéressante : savoir si l’incorporation des AltRP dans les ribosomes bactériens confère une propriété spéciale aux ribosomes contenant des AltRP (ribosomes Alt).
Les mycobactéries constituent un groupe idéal de bactéries pour étudier les propriétés mécanistes des ribosomes Alt. Tout d’abord, les mycobactéries possèdent un opéron altRP hautement conservé contenant quatre gènes qui codent pour les AltRP : S14-2, S18-2, L28-2 et L33-28,9. Les AltRP mycobactériens sont significativement différents de leurs paralogues PrimRP ; dans les quatre paires PrimRP/AltRP, un gène AltRP donné est plus similaire chez toutes les espèces mycobactériennes qu’il ne l’est au gène PrimRP de la même espèce10. L’évolution spécifique de la lignée des AltRP est également apparente chez les mycobactéries, comme en témoignent les AltRP S18-2 et L28-2 chez Mycobacterium tuberculosis et M. bovis, qui contiennent des séquences uniques à l’extrémité C-terminale qui ne sont pas présentes chez d’autres mycobactéries10. Deuxièmement, ce groupe de bactéries très apparentées contient des membres non pathogènes et pathogènes qui résident dans divers environnements, du sol (p. ex., M. smegmatis) à une myriade d’hôtes : humains (p. ex., M. tuberculosis), bovins (p. ex., M. bovis), aquatiques (p. ex., M. marinum) et aviaires (p. ex., M. avium), pour n’en nommer que quelques-uns. La nature hautement conservée de l’opéron altRP chez les mycobactéries, l’évolution spécifique à la lignée de gènes AltRP spécifiques et les environnements très différents dans lesquels les membres de ce groupe existent offrent une occasion unique d’analyser l’évolution conservée et spécifique à la lignée de la fonction AltRP et les propriétés mécanistes des ribosomes Alt. Malgré l’abondance des AltRP dans les génomes procaryotes, le rôle des AltRP et des ribosomes Alt n’a été étudié que chez quelques bactéries 9,10,11,12,13,16,17,18,19. La mise en place d’un système normalisé avec des mesures spécifiques pour valider les conditions de croissance limitant le Zn2+ chez les mycobactéries améliorerait les résultats expérimentaux et ferait progresser la compréhension des ribosomes Alt dans le domaine de la recherche sur les ribosomes.
Zn2+ est un micronutriment ; par conséquent, des traces de Zn2+ contaminant dans les produits chimiques et l’eau contribuent à la biodisponibilité du Zn2+, même lorsqu’elles sont omises de la préparation du milieu. Les traces de Zn2+ présentes dans l’eau ou les produits chimiques peuvent varier considérablement d’un laboratoire à l’autre, affectant ainsi le résultat de la croissance limitant le Zn2+. La quantification empirique du [Zn2+] dans chaque préparation indépendante de milieux est trop lourde pour la plupart des laboratoires qui effectuent des essais de croissance de routine, mais un mécanisme permettant d’éliminer la possibilité de contamination par le Zn2+ dans les milieux de croissance serait intrinsèquement précieux. À cette fin, nous présentons ici une méthode détaillée pour préparer un milieu limité en Zn2+ (ZLM), des vaisseaux de croissance et des cultures de graines chimiquement définis pour la croissance limitant le Zn2+ et la production de ribosomes alternatifs chez M. smegmatis et M. tuberculosis. Les principales caractéristiques morphogéniques (densité cellulaire mesurée par OD600, longueur cellulaire et fluorescence de la coenzyme F420) après croissance dans ZLM sont utilisées pour vérifier que la limitation de Zn2+ a été atteinte. La coenzyme F420 est un cofacteur de la déazaflavine qui joue un rôle important dans le catabolisme et la défense contre le stress oxydatif chez les méthanogènes et les mycobactéries20,21. Il est important de noter que les mycobactéries sont autofluorescentes lorsqu’elles sont excitées à 420 nm en raison de l’abondance de ce cofacteur 22. Le lien moléculaire entre la fluorescence de [Zn2+] et de F420 n’est pas résolu, mais le suivi de la fluorescence de F420 dans les cultures est un bio-indicateur traitable et fiable.
Chez M. smegmatis, les phénotypes bioindicateurs sont présents chez les bactéries de type sauvage, mais un mutant de délétion dépourvu de l’opéron altRP ne subit pas le même programme morphogénique et peut être utilisé comme bioindicateur différentiel10. Bien que M. tuberculosis ne suive pas le même programme morphogénique que M. smegmatis pendant la limitation en Zn2+, M. tuberculosis a une réponse robuste et globale au Zn2+ et un phénotype de bioindicateur clé suivant cette méthode 23. Ainsi, le système défini ici permet de générer des ribosomes Prim- et Alt- dans les mêmes conditions de croissance (c’est-à-dire une limitation Zn2+), facilitant la dissection mécaniste de la fonction des ribosomes Alt et son rôle dans la formation de la physiologie bactérienne. Cette méthode de croissance a été utilisée pour résoudre la structure des ribosomes Alt actifs et démontrer leur activité translationnelle chez M. smegmatis24. De plus, l’expression d’AltRP est nécessaire pour la morphogenèse dépendante de Zn2+ et a un effet profond sur le transcriptome et le protéome de M. smegmatis Zn2+ class="xref">10,25. La même méthode, avec des modifications mineures de la quantité d’inoculum et du temps d’incubation, est utilisée pour générer des cultures de M. tuberculosis9,23. Ici, les protocoles et les phénotypes de bioindicateurs permettant d’atteindre une croissance limitant le Zn2+ chez M. smegmatis et M. tuberculosis sont détaillés, en mettant l’accent sur M. smegmatis, car cette bactérie est plus sensible à la contamination par le Zn2+ dans les milieux et est plus largement accessible que l’agent pathogène à croissance lente.

Systèmes de <table><tbody><tr><td>filtration sous vide de 1000 ml, ligne standard</td><td>VWR</td><td>10040-440</td><td></td></tr><tr><td>Erlenmeyer Flacons agitateurs</td><td>Greiner Bio-One</td><td>679501</td><td></td></tr><tr><td>14 mL Tubes de culture, plastique, avec capuchons à double position VWR</td><td></td><td>60818-725</td><td></td></tr><tr><td>Erlenmeyer Flacons agitateurs</td><td>Greiner Bio-One</td><td>679502</td><td></td></tr><tr><td>40X-1000X Composé biologique binoculaire de laboratoire Microscope</td><td>Omax</td><td>M82EZ</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Tubes de bioréaction, stériles</td><td>VWR</td><td>76211-286</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Tubes à centrifuger haute performance avec capuchons de drapeau</td><td>VWR</td><td>89039-656</td><td></td></tr><tr><td>Alcojet Détergent en poudre peu moussant</td><td>Alconox</td><td>1404</td><td></td></tr><tr><td>Citrate d’ammonium et de fer (III), brun</td><td>Thermo Scientific</td><td>AAA1119930&nbsp ;</td><td>MW : 265 g/mol, pour une solution 1M, ajouter 1,325 g à 5 mL d’eau ultrapure ; conserver à l’abri de la lumière à 4 °C</td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine</td><td>Thermo Scientific</td><td>J10857-A1</td><td></td></tr><tr><td>D-Pantothénate de calcium</td><td>Thermo Scientific</td><td>AC243300050</td><td></td></tr><tr><td>Catalase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1345-10G</td><td></td></tr><tr><td>Acide citrique anhydre, cristallin</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP339-500</td><td></td></tr><tr><td>Dextrose anhydre</td><td>Fisher Scientific</td><td>D14-500</td><td></td></tr><tr><td>Difco Middlebrook 7H9 Broth</td><td>BD Diagnostics</td><td>271310</td><td></td></tr><tr><td>DiluPhotometer OD600 pour la détermination de la densité cellulaire et les dosages Bradford</td><td>Implen</td><td>OD600-10</td><td></td></tr><tr><td>GENios FL Lecteur de microplaques</td><td>Tecan</td><td></td><td>Discontinued</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Fisher Scientific</td><td>G33-4</td><td></td></tr><tr><td>Infinite M200 PRO Lecteur de microplaques multimode</td><td>Tecan</td><td>LGE140213-20BL</td><td></td></tr><tr><td>L-Asparagine</td><td>Thermo Scientific</td><td>AAB2147336</td><td></td></tr><tr><td>L-Leucine</td><td>Thermo Scientific</td><td>A1231122</td><td></td></tr><tr><td>Macrofire SP Caméra CCD</td><td>Optronique</td><td></td><td>À utiliser avec le microscope Olympus</td></tr><tr><td>Sulfate de magnésium heptahydraté</td><td>VWR</td><td>97062-134</td><td></td></tr><tr><td>Système de purification d’eau Milli-Q Direct 8 Millipore</td><td></td><td>C85358</td><td></td></tr><tr><td>Moticam X3</td><td>Motic</td><td></td><td>Abandonné, remplacé par Moticam X5 Plus ; pour utilisation avec un microscope composé</td></tr><tr><td>Acide oléique</td><td>Thermo Scientific</td><td>031997-14</td><td></td></tr><tr><td>Olympus BX51 microscope droit</td><td>Olympus</td><td></td><td>Abandonné, remplacé par BX53M</td></tr><tr><td>Phosphate de potassium, monobasique</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP362-500</td><td></td></tr><tr><td>Semi-Micro Two-Sided Disposable Plastic Cuvettes</td><td>VWR</td><td>97000-590</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de sodium, cristal</td><td>VWR</td><td>VW1494-01</td><td></td></tr><tr><td>Hydroxyde de sodium</td><td>Fisher Scientific</td><td>S318-500&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Tween 80</td><td>MP Biomedicals</td><td>103170</td><td></td></tr><tr><td>Sulfure de zinc heptahydraté, cristallin/ACS</td><td>MP Biomedicals</td><td>219145290</td><td></td></tr></tbody></table>

utilisation de mycobacterium smegmatis comme bioindicateur des conditions de croissance limitées en zinc chez les mycobactéries

Using Mycobacterium smegmatis as a Bioindicator for Zinc-Limited Growth Conditions in Mycobacteria

De nombreuses bactéries construisent des ribosomes alternatifs dans des conditions de croissance limitant le Zn2+ en remplaçant les protéines ribosomiques liant le Zn2+ par des paralogues indépendants du Zn2+. La définition d’un système pour étudier ces ribosomes alternatifs s’est avérée difficile car la contamination en Zn2+ en laboratoire est courante. Pour résoudre ce problème, des agents chélateurs sont parfois ajoutés aux milieux de croissance, mais cette approche complique la réponse biologique à la limitation progressive de Zn2+ et est associée à l’hibernation des ribosomes. Vous trouverez ici des instructions détaillées sur la préparation des milieux et l’ensemencement des cultures pour une croissance limitée en Zn2+ sans ajout de chélateurs. Selon cette méthode, la bactérie modèle, Mycobacterium smegmatis, subit une morphogenèse, qui dépend de ribosomes alternatifs. Parce que la morphogenèse est traitable et ne se produit que dans des conditions limitantes de Zn2+, M. smegmatis peut être utilisé comme bioindicateur pour vérifier les conditions de croissance biologiquement pertinentes. Trois phénotypes de bioindicateurs (densité cellulaire, longueur cellulaire et fluorescence de la coenzyme F420) qui indiquent une limitation de Zn2+ chez le type sauvage sont décrits, et les changements dans ces bioindicateurs pour un mutant de délétion qui ne peut pas construire de ribosomes alternatifs sont décrits. Étant donné que la contamination à l’état de traces de Zn2+ est difficile à contrôler pour chaque lot de milieux, et que la quantification précise du Zn2+ dans chaque préparation de milieu est trop lourde, le suivi de ce phénotype de bioindicateur est un moyen accessible de valider la préparation de milieux de croissance limités en Zn2+. Afin d’aider à identifier les conditions propices à la croissance limitant le Zn2+ et à la production de ribosomes alternatifs, les changements dans les phénotypes bioindicateurs ont également été profilés pour les préparations de milieux limités en Zn2+ ou gravement appauvris en Zn2+. D’autres détails pour atteindre une croissance limitant le Zn2+ et une production alternative de ribosomes chez M. tuberculosis sont présentés, ainsi que le phénotype du bioindicateur associé. Dans l’ensemble, les instructions détaillées et les phénotypes de bioindicateurs décrits ici aideront à normaliser la production de ribosomes alternatifs actifs translationnellement chez les mycobactéries.

Phénotypes bioindicateurs de M. smegmatis 
sauvage M. smegmatis cultures cultivées dans du ZLM ayant atteint le Zn2+- limitant la croissance présentent trois phénotypes bioindicateurs principaux par rapport aux cellules cultivées en présence de Zn2+- conditions de réplétion : [1] diminution de la DO600, [2] des cellules allongées et [3] une diminution du pic de fluorescence à 420 nm. Le mutant dépourvu d'AltRPs (ΔaltRP) n'a pas le même Zn2+morphogenèse dépendante comme le type sauvage10, et son phénotype unique en Zn2+Les milieux limités peuvent être utilisés comme bioindicateurs différentiels. Par conséquent, les trois paramètres bioindicateurs doivent d'abord être évalués chez le type sauvage cultivé dans du ZRM et du ZLM. Si le Zn attendu2+-un phénotype sauvage limité est observé, le ΔaltRP La souche délétée doit ensuite être évaluée. La croissance en ZLM n'atteint pas toujours le Zn2+-des conditions limitées, ce qui est précisément la raison pour laquelle des bioindicateurs sont nécessaires. Souches sauvages uniques et ΔaltRP les phénotypes bio-indicateurs confirment que le Zn est biologiquement pertinent2+des conditions limitantes ont été obtenues. Lorsque les cultures cultivées en ZLM n'atteignent pas le Zn2+limitation de la croissance due au Zn2+ contamination dans le milieu ou les récipients de culture (ZLM-C), ces phénotypes bioindicateurs seront moins prononcés, comme illustré dans Figure 1 et Figure 2. Inversement, si la concentration de Zn2+ dans le ZLM est trop faible, la croissance est altérée par le Zn2+ appauvrissement (ZLM-D), qui se manifeste par une faible turbidité de la culture et des phénotypes altérés des bioindicateurs, décrit également dans Figure 1 et Figure 2.
La densité cellulaire est un indicateur pertinent de la limitation en Zn2+. Les cultures cultivées dans le milieu ZRM atteignent systématiquement une forte turbidité (supérieure à une DO600 de 5) après 72 h, parfois avec formation d'agrégats, et apparaissent visiblement plus jaunes (données non montrées) que les cultures cultivées dans le milieu ZLM (Figure 1A). La limitation en Zn2+ restreint la croissance (marquée par une diminution de la DO600) de toutes les souches par rapport à la condition suffisante en Zn2+, et la souche ΔaltRP présente une densité cellulaire inférieure à celle du type sauvage (Figure 1A). La croissance limitée en Zn2+ dans le milieu ZLM donne régulièrement une DO600 supérieure à 3,5 et inférieure à 5 chez le type sauvage, et inférieure à 3 chez la souche ΔaltRP (Figure 1A). Les cultures cultivées dans le milieu ZLM contenant une contamination en Zn2+ (ZLM-C) atteignent une densité cellulaire similaire (DO600 supérieure à 5) à celle des cultures suffisantes en Zn2+ cultivées dans le milieu ZRM (Figure 1A). Si la [Zn2+] dans le milieu ZLM est trop faible, les cultures sont fortement appauvries en Zn2+ (ZLM-D), et la croissance est altérée, comme en témoigne la diminution de la densité cellulaire chez les cultures de type sauvage (DO600 inférieure à 3 ; Figure 1A). La densité cellulaire du type sauvage (3,5 &lt; DO600 &lt; 5) doit constituer le premier critère phénotypique de contrôle pour confirmer des conditions limitantes en Zn2+. Seules les cultures de type sauvage ayant atteint la densité cellulaire attendue doivent être prises en compte, et l'analyse de la souche ΔaltRP doit intervenir après avoir vérifié le phénotype indicateur de limitation en Zn2+ chez le type sauvage.
Cultures sauvages en phase stationnaire cultivées dans du ZLM limité en Zn2+ sont allongées avec une longueur moyenne de cellule d'environ 9 µm, alors que le Zn2+- les cultures repues cultivées dans du ZRM sont courtes, avec une longueur cellulaire moyenne d'environ 3 µm (Figure 1B). Des cultures de type sauvage cultivées dans du ZLM avec du Zn2+ la contamination (ZLM-C) n'assurent pas une élongation complète mais sont légèrement plus longues que le Zn2+- des cellules reconstituées avec une longueur moyenne de 5 µm. Bioindication du Zn2+ la contamination de lots entiers de ZLM indique une contamination possible lors de la préparation, tandis que la contamination de cultures individuelles (c’est-à-dire de flacons) indique un défaut de lavage des flacons ou une préparation incorrecte des cultures. Des souches sauvages cultivées dans un ZLM fortement appauvri en Zn2+ (ZLM-D) présentent une élongation moins marquée avec une longueur moyenne des cellules d'environ 7 µm (Figure 1B). Le phénotype sauvage allongé n'est pas observé chez le ΔaltRP souche, et ΔaltRP cellules limitées en Zn2+ ont une longueur moyenne d'environ 5 µm (Figure 1B). Figure 2 montre des images représentatives de cellules cultivées dans différentes préparations de ZLM ou de ZRM (après l'étape 2) et visualisées au microscope optique composé. Après l'étape 4, les cellules provenant de nombreux champs dans des images telles que celles illustrées dans Figure 2 sont utilisés pour calculer la longueur moyenne des cellules des cultures présentées dans Figure 1B. Le phénotype allongé de type sauvage est spécifique au Zn2+- des conditions limitantes ; l'allongement cellulaire n'est pas observé lorsque les cultures sont en présence de Zn2+-replet ou gravement déficient en Zn2+-appauvri (Figure 1B et Figure 2).
Le phénotype de l'indicateur biologique de fluorescence diminuée de F420 est mieux observé sur des analyses de fluorescence (Figure 1C). La diminution de la fluorescence du cofacteur F420 est quantifiée en calculant le pourcentage d'intensité de fluorescence à 375 nm (fond) par rapport à 420 nm (autofluorescence du cofacteur F420), comme décrit à l'étape 3.16.5, exprimé sous la forme F375/420. Pour les lecteurs de plaque monocromatiques dépourvus de capacité de balayage fluorescent, des mesures ponctuelles à 375 nm et 420 nm (les deux avec une émission à 475 nm) conviennent pour calculer F375/420. Les cultures de type sauvage cultivées dans des conditions suffisantes en Zn2+ (c'est-à-dire dans ZRM) présentent une valeur F375/420 très reproductible d'environ 17 % (Figure 1D). La réduction de la fluorescence de F420 dans les cultures limitées en Zn2+ cultivées dans ZLM se traduit par une augmentation de F375/420 d'environ 27 % (Figure 1D). La fluorescence de F420 chez la souche ΔaltRP limitée en Zn2+ est remarquablement plus faible que chez le type sauvage dans les mêmes conditions, ce qui est visuellement évident sur les analyses de fluorescence (Figure 1C). La valeur F375/420 est plus variable chez la souche ΔaltRP limitée en Zn2+, avec une plage allant d'environ 50 % à 80 % (Figure 1D). Les cultures cultivées dans ZLM mais montrant un indice biologique de contamination par le Zn2+ (ZLM-C) présentent une réduction de F375/420 d'environ 21 %, tandis que les cultures appauvries en Zn2+ (ZLM-D) ont une valeur F375/420 d'environ 35 % (Figure 1D).
En résumé, trois phénotypes bioindicateurs doivent être évalués chez les souches de type sauvage et ΔaltRP afin de confirmer l'état de limitation en Zn2+ des cultures cultivées dans le milieu ZLM. Les bioindicateurs doivent être les suivants en cas de croissance biologiquement limitée par le Zn2+ : [1] la DO600 de la souche de type sauvage est comprise entre 3,5 et 5, tandis que celle de la souche ΔaltRP est inférieure à 3, [2] les cellules de type sauvage mesurent environ 10 µm de longueur, alors que les cellules ΔaltRP ont une longueur réduite de moitié, et [3] le rapport F375/420 de la souche ΔaltRP est élevé, c’est-à-dire supérieur à 50 %.
Phénotypes bioindicateurs de M. tuberculosis 
Zn2+-limité M. tuberculosis ne présente pas le même programme morphogénique que M. smegmatis. Plus précisément, il n'existe aucune différence dans la DO600 entre Zn2+-replet et Zn2+-cultures limitées, et Zn2+les cultures limitées ne présentent aucun phénotype morphologique évident, c'est-à-dire qu'elles n'allongent pas23De même, il n'existe pas de Zn2+-phénotype d'indicateur biologique appauvri (c'est-à-dire une densité cellulaire réduite) dans M. tuberculosis comme observé dans M. smegmatis. Zn2+- les cultures limitées présentent un regroupement plus marqué par rapport au Zn2+-des cultures complètes, bien que les deux conditions soient nettement grumeleuses au jour 10 (observé à la fois avec Mtb-H37Rv et Mtb-Aux). Le phénotype d'indicateur biologique clé pour le Zn2+ limitation dans M. tuberculosis est une diminution du pic de F420 fluorescence, comme rapporté précédemment23Les résultats concernant les cultures incubées pendant 8 jours sont présentés ici au lieu de 10 jours afin de minimiser l'agglutination. Diminution de F420 la fluorescence est apparente dans le Zn2+-cultures limitées avec lumière monochromatique (Figure 3) et les lecteurs de plaques à filtres. Pour les lecteurs de plaques à filtres, en utilisant Mtb-H37Rv, Zn2+les cultures limitantes (c'est-à-dire cultivées dans du ZLM) présentent environ 50 % des valeurs brutes de fluorescence par rapport au Zn2+-cultures complètes (c'est-à-dire cultivées dans du ZRM ; données non montrées). En utilisant un lecteur de plaques monochromatique, le mode de lecture par le fond et Mtb-Aux, Zn2+- les cultures complètes ont F375/420 environ 75 %, et Zn2+- les cultures ZLM contaminées ont des valeurs similaires. Diminution de F420 fluorescence dans le Zn2+-les cultures limitées cultivées dans du ZLM se reflètent par F375/420 de plus de 100 %. Le Zn2+- limité ΔaltRP la souche présente une croissance et une F similaires420 fluorescence observée dans le Zn2+-sauvage limité (Figure 3) et n'est pas utile comme bioindicateur dans M. tuberculosis comme il est dans M. smegmatis (Figure 1). Par conséquent, il est conseillé de tester les milieux qui seront utilisés pour cultiver M. tuberculosis avec la croissance rapide M. smegmatis
<img alt="Courbes de croissance, distribution des longueurs et analyse de fluorescence dans une étude bactérienne ; graphiques et boîtes à moustaches." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67274/67274fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 1"> 
Figure 1 : Phénotypes bioindicateurs de M. smegmatis cultivé en conditions de limitation en Zn2+ et effet de la contamination par le Zn2+ et de l'épuisement en Zn2+ sur les phénotypes. Les exemples représentatifs des phénotypes bioindicateurs montrés dans chaque panneau proviennent des mêmes cultures après 72 heures. Les exemples de résultats de croissance en présence de contamination par le Zn2+ (ZLM-C), de limitation en Zn2+ (ZLM-L) et d'épuisement en Zn2+ (ZLM-D) proviennent de préparations indépendantes de milieux, toutes réalisées selon la même méthode décrite ici (étape 2). Les phénotypes représentatifs des souches sauvage limitée en Zn2+ et ΔaltRP sont issus d’un même lot de ZLM. Toutes les souches et conditions comprennent trois réplicats biologiques (n=3). (A) Courbes de croissance montrant la densité optique mesurée à 600 nm (OD600) et la diminution de la densité cellulaire en conditions de limitation et d'épuisement en Zn2+. Les barres d'erreur représentent l'écart-type entre les réplicats. (B) Longueurs cellulaires des souches sauvage et ΔaltRP, illustrant le phénotype allongé de la souche sauvage en conditions de limitation en Zn2+. La boîte à moustaches montre l'écart interquartile, les longueurs minimales, maximales et médianes en µm. (C) Scans de fluorescence représentatifs des cultures, montrant une diminution du pic de fluorescence F420 en conditions de limitation en Zn2+ et une fluorescence F420 fortement réduite chez la souche ΔaltRP limitée en Zn2+. Un seul culture représentatif parmi les triplicats biologiques de chaque préparation de milieu est présenté. Les scans de fluorescence utilisent une gamme de longueurs d'onde d'excitation de 230 nm à 440 nm avec un pas de 5 nm et une longueur d'onde d'émission de 475 nm. Le panneau en surimpression en haut à gauche est un agrandissement des souches sauvage et ΔaltRP limitées en Zn2+, mettant en évidence la diminution du pic de fluorescence à 420 nm chez la souche ΔaltRP limitée en Zn2+. Les unités des axes sont identiques à celles du graphique principal. Toutes les légendes sont identiques à celles du panneau (A). (D) Quantification de la diminution de la fluorescence du cofacteur F420, calculée à partir du pourcentage de F375/420. Les pourcentages sont calculés à partir des valeurs obtenues lors des scans de fluorescence présentés en (C). La boîte à moustaches montre l'écart interquartile, les valeurs minimales, maximales et médianes en pourcentage. Les abréviations indiquant le statut relatif au Zn2+ du milieu, fournies entre parenthèses après le type de milieu, sont : R = milieu réapprovisionné en Zn2+, C = milieu contaminé par le Zn2+, L = milieu limité en Zn2+, D = milieu épuisé en Zn2+ ; les autres abréviations sont : WT = souche sauvage, a.u. = unités arbitraires. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67274/67274fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Résultats de l'électrophorèse en fonction du statut en Zn²⁺, WT par rapport à ΔaltRP, analyse de la séparation des protéines." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67274/67274fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 2"> 
Figure 2 : Images représentatives d'observations microscopiques de M. smegmatis après 72 h. Les images proviennent des cultures présentées dans la Figure 1. Les cellules ont été observées à l’aide d’un microscope optique composé avec un grossissement total de 1000x, en utilisant un objectif à immersion dans l’huile de 100x. Les barres d’échelle représentent 10 µm. Les abréviations indiquant le statut relatif au Zn2+ du milieu, fournies entre parenthèses après le type de milieu, sont : R = milieu suffisant en Zn2+, C = milieu contaminé en Zn2+, L = milieu limité en Zn2+, D = milieu appauvri en Zn2+ ; d'autres abréviations sont : WT = souche sauvage. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67274/67274fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Graphique du spectre d'excitation de fluorescence ; longueur d'onde contre fluorescence ; analyse d'étude protéique." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67274/67274fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 3"> 
Figure 3 : Perte du phénotype de bioindicateur F420 chez M. tuberculosis en conditions de limitation en Zn2+, démontrée par des analyses représentatives de fluorescence de la souche auxotrophe Mtb mc26206 (Mtb-Aux). Les exemples de résultats de croissance contaminés en Zn2+ et limités en Zn2+ proviennent de préparations indépendantes de milieux. Les souches sauvage limitée en Zn2+ et ΔaltRP proviennent du même lot de ZLM. Toutes les souches et conditions comprennent trois réplicats biologiques (n=3). Un seul culture représentatif parmi les réplicats biologiques est présenté pour chaque préparation de milieu et chaque souche sur le graphique. Les analyses de fluorescence ont été réalisées en mode de lecture par le fond après 8 jours de croissance, en utilisant une gamme de longueurs d'onde d'excitation de 230 nm à 440 nm avec un pas de 5 nm et une longueur d'onde d'émission de 475 nm. Les abréviations indiquant le statut relatif au Zn2+ du milieu, fournies entre parenthèses après le type de milieu, sont : R = milieu réapprovisionné en Zn2+, C = milieu contaminé en Zn2+, L = milieu limité en Zn2+, D = milieu appauvri en Zn2+ ; d'autres abréviations sont : WT = souche sauvage, a.u. = unités arbitraires. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67274/67274fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.</a>

Ce protocole détaille la préparation de milieux limités en Zn2+, de vaisseaux de croissance et de cultures de graines pour produire des ribosomes limités en Zn2+ chez les mycobactéries. Des traces de Zn2+ conduisent à une croissance limitant le Zn2+ et nous décrivons les caractéristiques morphogéniques utilisées comme bioindicateurs pour vérifier la limitation du Zn2+ in vitro chez la bactérie modèle, Mycobacterium smegmatis, et l’agent pathogène humain M. tuberculosis.

Utilisation de Mycobacterium smegmatis comme bioindicateur des conditions de croissance limitées en zinc chez les mycobactéries

Many bacteria build alternative ribosomes in Zn2+-limiting growth conditions by replacing Zn2+-binding ribosomal proteins with Zn2+-independent paralogs. ...

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JoVE Journal

Biology

Biologie

Mycobacterium tuberculosis forme des biofilms de drogues tolérantes quand elles sont cultivées dans certaines conditions. Nous décrivons ici les méthodes de culture, M. biofilms tuberculose et la détermination de la fréquence des persistants de drogue tolérante. Ces protocoles seront utiles pour d'autres études sur les mécanismes de la tolérance au médicament chez M. la tuberculose.

La croissance de la Mycobacterium tuberculosis Les biofilms

Actuelle des tests de diagnostic de sensibilité aux antimicrobiens repose sur la croissance planctonique des isolats en nutriments riches, des conditions aérobies. Ici, nous employons un moyen alternatif d'expectoration artificielle pour étudier la sensibilité aux antimicrobiens des biofilms de Pseudomonas aeruginosa dans des conditions aérobies et microaérophiles plus représentatives de la fibrose pulmonaire kystique.

L&#39;utilisation de moyen d&#39;expectoration artificielle pour tester l&#39;efficacité des antibiotiques contre<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Dans des conditions plus pertinents à la fibrose kystique du poumon

Source : Gupta, S., et al. Isolement et caractérisation des vésicules extracellulaires produites par des mycobactéries limitées en fer. J. Vis. Exp. (2019)Cette vidéo montre la procédure de culture de Mycobacterium tuberculosis dans des conditions limitées en fer pour induire un stress en fer et favoriser la sécrétion de sidérophores qui favorisent la survie bactérienne.

Culture de Mycobacterium tuberculosis dans des conditions limitées en fer

Ici, nous décrivons une analyse phénotypique applicable aux écrans à haut débit/à haute teneur de l’ARN synthétique de petit-interférent (siRNA), du composé chimique, et des bibliothèques mutantes de tuberculose de mycobactérie. Cette méthode repose sur la détection de Mycobacterium tuberculosis marqué par fluorescence dans une cellule hôte marqué par fluorescence à l’aide d’une microscopie confocale automatisée.

Un test phénotypique microscopique pour la quantification des mycobactéries intracellulaires adaptées au criblage à haut débit /haute teneur

Le charcoal agar resazurin assay (CARA) est une méthode semi-quantitative à débit moyen pour évaluer l’activité des agents d’essai contre les mycobactéries qui se répliquent, qui ne se répliquent pas ou qui sont les deux.  Le CARA permet d’évaluer rapidement l’activité dépendante du temps et de la concentration et de déterminer les paramètres à suivre à l’aide d’essais d’unités formant colonies (UFC).

Visualisation de l&#39;Agar Charcoal résazurine Essai pour semi-quantitative, Moyen-débit Enumération des mycobactéries

Mycobacterium tuberculosis montre une augmentation de la production et la libération de vésicules extracellulaires en réponse à de faibles conditions de fer. Ce travail détaille un protocole pour générer de faibles conditions de fer et des méthodes pour la purification et la caractérisation des vésicules extracellulaires mycobactériennes libérées en réponse à une carence en fer.

Isolement et caractérisation des vésicules extracellulaires produites par des mycobactéries limitées en fer

Ce protocole décrit une méthode robuste pour développer un biofilm pelliculaire. La méthode est adaptable à différents volumes de culture, ce qui permet une adoption facile pour divers objectifs expérimentaux. La conception de la méthode permet d’évaluer qualitativement ou quantitativement le potentiel de formation de biofilms de plusieurs espèces mycobactériennes.

Cultiver un biofilm mycobactérien comme modèle pour étudier la résistance aux antimicrobiens

Cette étude a mis au point un test de criblage à haut débit contre Mycobacterium abscessus avec une souche à double rapporteur récemment créée, en utilisant la fluorescence et la luminescence pour évaluer rapidement la viabilité bactérienne. Ce protocole sera pertinent pour les chercheurs qui souhaitent cribler de nouveaux médicaments contre cette bactérie résistante aux médicaments.

Développement d’un test pour le criblage de médicaments à haut débit contre les mycobactéries

T CD4 + des lymphocytes capturer en utilisant une puce jetable microfluidiques pour le VIH

Stratégies pathogènes mycobactériens restent mal compris. Le taux de croissance lente de la plupart des espèces, la nature impénétrable de la paroi cellulaire, et les dangers de travailler avec des agents pathogènes font mycobactéries difficiles à étudier et sont largement responsables de notre mauvaise compréhension de ces organismes. Dans cette vidéo, nous allons démontrer la technique d'électroporation, qui consiste à soumettre les cellules à une impulsion brève électrique élevée pour...

Electroporation de mycobactéries

Découvrez comment utiliser Mycobacterium smegmatis comme bioindicateur des conditions de croissance limitées en zinc chez les mycobactéries. Cette méthode standardisée permet d'étudier les réponses physiologiques et les interactions hôte-pathogène.

Utilisation de Mycobacterium smegmatis comme bioindicateur des conditions de croissance limitées en zinc chez les mycobactéries

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