Name: Extraction en une étape et analyse zymographique des gélatinases bactériennes (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-08-01T12:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 20 s
Description: Découvrez une méthode d'extraction en une étape des gélatinases actives de Leptospira suivie d'une analyse zymographique pour confirmer l'activité enzymatique. Cette approche simplifiée facilite l'étude des protéines membranaires bactériennes impliquées dans la pathogenèse.

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<ol><li>Yue, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biology+of+the+extracellular+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22J+Glaucoma%22%5BJournal%5D)">Biology of the extracellular matrix.</a> J Glaucoma. 23 (8 Suppl 1), S20-S23 (2014).</li>
<li>Cabral-Pacheco, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+roles+of+matrix+metalloproteinases+and+their+inhibitors+in+human+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">The roles of matrix metalloproteinases and their inhibitors in human diseases.</a> Int J Mol Sci. 21 (24), 1-53 (2020).</li>
<li>Ambili, M., Jayasree, K., Sudhakaran, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((60K+gelatinase+involved+in+mammary+gland+involution+is+regulated+by+%CE%B2-oestradiol%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">60K gelatinase involved in mammary gland involution is regulated by β-oestradiol.</a> Biochim Biophys Acta. 1403 (3), 219-231 (1998).</li>
<li>Zhang, Y. -Z., Ran, L. -Y., Li, C. -Y., Chen, X. -L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity%2C+structures%2C+and+collagen-degrading+mechanisms+of+bacterial+collagenolytic+proteases%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Diversity, structures, and collagen-degrading mechanisms of bacterial collagenolytic proteases.</a> Appl Environ Microbiol. 81 (18), 6098-6107 (2015).</li>
<li>Duarte, A. S., Correia, A., Esteves, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+collagenases+-+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Crit+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Bacterial collagenases - A review.</a> Crit Rev Microbiol. 42 (1), 106-126 (2016).</li>
<li>Madathiparambil, M. G., Cattavarayane, S., Perumana, S. R., Manickam, G. D., Sehgal, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presence+of+46+kDa+gelatinase+on+the+outer+membrane+of+Leptospira%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Presence of 46 kDa gelatinase on the outer membrane of Leptospira.</a> Curr Microbiol. 62 (5), 1478-1482 (2011).</li>
<li>Kramer, R. A., Zandwijken, D., Egmond, M. R., Dekker, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+folding%2C+purification+and+characterization+of+Escherichia+coli+outer+membrane+protease+OmpT%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Biochem%22%5BJournal%5D)">In vitro folding, purification and characterization of Escherichia coli outer membrane protease OmpT.</a> Eur J Biochem. 267 (3), 885-893 (2000).</li>
<li>Kum, S. L., Ho, J. C. S., Parikh, A. N., Liedberg, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amphiphilic+membrane+environments+regulate+enzymatic+behaviors+of+Salmonella+outer+membrane+protease%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Bio+Med+Chem+Au%22%5BJournal%5D)">Amphiphilic membrane environments regulate enzymatic behaviors of Salmonella outer membrane protease.</a> ACS Bio Med Chem Au. 2 (1), 73-83 (2022).</li>
<li>Sarma, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+proteome+analysis+shows+the+abundance+of+histidine+kinase+sensor+protein%2C+DNA+helicase%2C+putative+lipoprotein+containing+peptidase+M75+domain+and+peptidase+C39+domain+protein+in+Leptospira+interrogans+grown+in+EMJH+medium%5BTitle%5D)+AND+%22Pathogens%22%5BJournal%5D)">Extracellular proteome analysis shows the abundance of histidine kinase sensor protein, DNA helicase, putative lipoprotein containing peptidase M75 domain and peptidase C39 domain protein in Leptospira interrogans grown in EMJH medium.</a> Pathogens. 10 (7), 852(2021).</li>
<li>Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+proteins%2C+lipids+and+detergents%3A+not+just+a+soap+opera%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Membrane proteins, lipids and detergents: not just a soap opera.</a> Biochim Biophys Acta. 1666 (1-2), 105-117 (2004).</li>
<li>Levy, D., Gulik, A., Seigneuret, M., Rigaud, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospholipid+vesicle+solubilization+and+reconstitution+by+detergents.+Symmetrical+analysis+of+the+two+processes+using+octaethylene+glycol+mono-n-dodecyl+ether%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Phospholipid vesicle solubilization and reconstitution by detergents. Symmetrical analysis of the two processes using octaethylene glycol mono-n-dodecyl ether.</a> Biochemistry. 29 (40), 9480-9488 (1990).</li>
<li>Lichtenberg, D., Ahyayauch, H., Alonso, A., Goñi, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detergent+solubilization+of+lipid+bilayers%3A+a+balance+of+driving+forces%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem+Sci%22%5BJournal%5D)">Detergent solubilization of lipid bilayers: a balance of driving forces.</a> Trends Biochem Sci. 38 (2), 85-93 (2013).</li>
<li>Schägger, H., Cramer, W. A., von Jagow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+molecular+masses+and+oligomeric+states+of+protein+complexes+by+blue+native+electrophoresis+and+isolation+of+membrane+protein+complexes+by+two-dimensional+native+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Analysis of molecular masses and oligomeric states of protein complexes by blue native electrophoresis and isolation of membrane protein complexes by two-dimensional native electrophoresis.</a> Anal Biochem. 217 (2), 220-230 (1994).</li>
<li>Schägger, H., von Jagow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue+native+electrophoresis+for+isolation+of+membrane+protein+complexes+in+enzymatically+active+form%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Blue native electrophoresis for isolation of membrane protein complexes in enzymatically active form.</a> Anal Biochem. 199 (2), 223-231 (1991).</li>
<li>Zeug, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+microscopic+methods+for+the+neural+ECM+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Current microscopic methods for the neural ECM analysis.</a> Prog Brain Res. 214, 287-312 (2014).</li>
<li>Madathiparambil, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+zymography+analysis+of+proteinase+activity+present+in+Leptospira%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A zymography analysis of proteinase activity present in Leptospira.</a> Curr Microbiol. 62 (3), 917-922 (2011).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Acide 6-aminocaproïque</td><td>Merck</td><td>A2504</td><td></td></tr><tr><td>Acide acétique</td><td>&nbsp ; Sigma</td><td>&nbsp ; 695092</td><td></td></tr><tr><td>Acétone</td><td>&nbsp ; &nbsp ; Sigma</td><td>&nbsp ; 32201</td><td></td></tr><tr><td>Acrylamide</td><td>&nbsp ; &nbsp ; Sigma</td><td>&nbsp ; A-3553</td><td></td></tr><tr><td>Persulfate d’ammonium</td><td>&nbsp ; &nbsp ; Sigma</td><td>&nbsp ; A-3678</td><td></td></tr><tr><td>Bis Acrylamide</td><td>&nbsp ; &nbsp ; Sigma</td><td>&nbsp ; Référence M7279</td><td></td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine fraction V (BSA)</td><td>&nbsp ; Sigma</td><td>&nbsp ; A-8022</td><td></td></tr><tr><td>Bleu bromophénol</td><td>&nbsp ; &nbsp ; Sigma</td><td>&nbsp ; Réf. B-8026</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Merck</td><td>Réf. C4901</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie bleu brillant</td><td>&nbsp ; &nbsp ; Sigma</td><td>1.12553</td><td></td></tr><tr><td>Désoxycholate</td><td>&nbsp ; &nbsp ; Sigma-Aldrich</td><td>D6750</td><td></td></tr><tr><td>Ellinghausen&ndash ; McCullough&ndash ; Johnson&ndash ; Harris (EMJH) moyen, Difco</td><td>&nbsp ; Difco</td><td>&nbsp ; 279410</td><td></td></tr><tr><td>Gélatine</td><td>Merck</td><td>G9382</td><td></td></tr><tr><td>Glycérol</td><td>Merck</td><td>Référence G5516</td><td></td></tr><tr><td>Glycine G8790</td><td>&nbsp ; &nbsp ; Sigma</td><td>&nbsp ; G-8898</td><td></td></tr><tr><td>Leptospira interrogans sérovar de Copenhague souche Fiocruz L1-130 (ATCC BAA-1198)&nbsp ;, conservée dans la biobanque de l’ICMR-RMRC Portblair</td><td>Conservé dans la biobanque de l’ICMR-RMRC Port Blair</td><td></td><td>Température de croissance optimale 30 &deg ; C</td></tr><tr><td>Chlorure de magnésium M8266</td><td>&nbsp ; Sigma</td><td>&nbsp ; Référence M8266</td><td></td></tr><tr><td>Méthanol</td><td>&nbsp ; &nbsp ; Sigma</td><td>&nbsp ; 17995-7</td><td></td></tr><tr><td>Solution saline tamponnée au phosphate</td><td>&nbsp ; &nbsp ; Sigma</td><td>P4417&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Outil de séparation des plaques</td><td>Wonder Wedgle</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rotor</td><td>Thermoscientifique</td><td>FIBERLite F15 8x50 cy</td><td></td></tr><tr><td>Dodécylsulfate de sodium (FDS)</td><td>&nbsp ; &nbsp ; Sigma</td><td>&nbsp ; L-4396</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>&nbsp ; &nbsp ; Sigma</td><td>&nbsp ; Réf. T-9281</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>&nbsp ; &nbsp ; Sigma-Aldrich</td><td>Réf. T8787</td><td></td></tr><tr><td>Base Trizma (TRIS)&nbsp ;</td><td>&nbsp ; &nbsp ; Sigma</td><td>&nbsp ; Réf. T6066</td><td></td></tr></tbody></table>

extraction en une étape et analyse zymographique des gélatinases bactériennes

One-step Extraction and Zymographic Analysis of Bacterial Gelatinases

Le résultat montre le zymogramme de la protéine leptospirale et des gélatinases du sérum humain. Les résultats, illustrés à la figure 1, représentent les protéases sous forme de bandes blanches claires sur un fond bleu. Les bandes représentent les zones où la gélatine copolymérisée est dégradée et donc non colorée, tandis que d’autres zones de l’ensemble du gel sont colorées en bleu en raison de la présence de gélatine. De plus, il montre que même si la gélatine est également une protéine, e...

Extraction en une étape et analyse zymographique des gélatinases bactériennes

Proteinases of pathogenic bacteria contribute to invasion and pathogenesis by actively degrading the host's extracellular matrix (ECM) components and ...

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Biochimie

Ce protocole décrit une analyse basée sur les activités de détection des métalloprotéinases matricielles dans les surnageants de culture ou de fluides corporels.

Détection des métalloprotéinases matricielles fonctionnelle par zymographie

Un ensemble straight-forward de méthodes pour isoler et déterminer l'identité des protéines les plus abondantes ont exprimé dans le muscle squelettique. Environ 800 places sont discernées sur un gel à deux dimensions à partir de 10 mg de muscle, ce qui permet pour la détermination du sexe d'expression de protéines spécifiques. Ces méthodes donnent des résultats équivalents dans la plupart des tissus.

Skeletal Muscle dimorphisme des sexes de la protéomique

Nous avons récemment rapporté une nouvelle approche pour générer des sondes DNAzyme fluorogènes qui peuvent être appliqués à mettre en place un simple, «mix-and-lire" immunofluorescence pour la détection bactérienne. Ces sondes d'ADN spécifiques catalyser le clivage d'un chromophore de modification d'ADN-ARN substrat chimérique en présence d'un mélange brut extracellulaire (LEC) produite par une bactérie spécifique, traduisant ainsi la détection de bactéries dans la génération du signal de...

Détection des bactéries à l&#39;aide ADNzymes fluorogènes

Nous décrivons la méthode prototype pour la fabrication des lamelles de microscope recouvertes de gélatine fluorescente pour visualiser dégradation de la matrice invadopodes médiation. Techniques de calcul à l'aide du logiciel disponible sont présentées pour quantifier les niveaux résultants de protéolyse de la matrice de cellules individuelles au sein d'une population mixte et des groupes pluricellulaires englobant ensemble des champs microscopiques.

Mesure quantitative de invadopodes la protéolyse matrice extracellulaire dans des contextes simples et multicellulaire

Dans cette vidéo, nous effectuons une zymographie, une technique électrophorétique, pour analyser l’activité protéolytique dans des échantillons biologiques.

Zymographie peptidique fluorescente : une technique modifiée pour détecter l’activité de la protéase à l’aide de substrats fluorogènes dans des gels de zymogramme

Cette vidéo démontre la technique d’électrophorèse sur gel de zymographie pour évaluer l’activité des métalloprotéinases matricielles (MMP) présentes dans le surnageant de culture cellulaire. Les MMP actifs dégradent le substrat spécifique du MMP incorporé dans un gel de polyacrylamide, qui apparaît sous forme de bandes transparentes sur un fond sombre coloré après la coloration.

Électrophorèse sur gel zymographique : une technique électrophorétique pour détecter les métalloprotéinases matricielles en évaluant l’activité enzymatique

Les membres du genre Burkholderia sont des agents pathogènes d'importance clinique. Nous décrivons un procédé pour l'extraction totale de la protéine bactérienne, en utilisant une rupture mécanique, et un gel d'électrophorèse 2D pour l'analyse protéomique ultérieure.

Extraction des protéines totales et 2-D Méthodes électrophorèse sur gel pour<em&gt; Burkholderia</em&gt; Espèces

Nous présentons ici un protocole détaillé pour une technique mis à jour le zymographic dans lequel les peptides fluorescents sont utilisés comme substrat biodégradable en lieu et place des protéines natives. Électrophorèse d’échantillons biologiques dans zymogrammes de peptides fluorescents permet la détection d’un plus large éventail de protéases que les techniques de zymographic précédente.

Détection d’activité de la protéase par Zymographie peptides fluorescents

Les analogues du tréhalose apparaissent comme des molécules importantes pour les applications bio(technologiques)logiques et biomédicales. Nous décrivons un protocole optimisé pour la synthèse enzymatique et la purification des analogues du tréhalose, simple, efficace, rapide et respectueux de l’environnement. Son application à la production et à l’administration rapides d’une sonde pour la détection de mycobactéries est démontrée.

Rapid One-step Synthèse enzymatique et All-aqueuse Purification de tréhalose Analogues

La composition protéique de la valvule mitrale humaine est encore partiellement inconnue, car son analyse est compliquée par une faible cellularité et donc par une faible biosynthèse des protéines. Ce travail fournit un protocole pour extraire efficacement les protéines pour l'analyse du protéome de la valvule mitrale.

Protocole optimisé pour l&#39;extraction de protéines à partir de la soupape mitrale humaine

Découvrez une méthode d'extraction en une étape des gélatinases actives de Leptospira suivie d'une analyse zymographique pour confirmer l'activité enzymatique. Cette approche simplifiée facilite l'étude des protéines membranaires bactériennes impliquées dans la pathogenèse.

Extraction en une étape et analyse zymographique des gélatinases bactériennes

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