In vivo Imagerie confocale par fluorescence de l’activité neuronale induite par la stimulation sensorielle chez des larves de poisson-zèbre partiellement restreintes

[Instructeur] Pour commencer, préparez des agros à faible point de fusion de 3 % dans un milieu embryonnaire, chauffez les agros à une température sûre pour manipuler le poisson zèbre sans causer de dommages. Avant que l’agros ne refroidisse et ne se solidifie, placez les larves qui sont deux à sept jours après la fécondation, côté dorsal vers le haut, dans une boîte de Pétri avec un fond en verre. Une fois que l’agros s’est solidifié avec les larves en place, ajoutez cinq millilitres de milieu embryonnaire dans le plat. À l’aide d’un scalpel, coupez les agros au besoin autour des larves. Transférez la boîte de Pétri avec le poisson zèbre sur la platine du microscope confocal. Après s’être acclimaté pendant 20 minutes, utilisez l’imagerie en fond clair pour centrer le poisson sous l’objectif d’immersion 40 fois dans l’eau à température ambiante. Réglez les paramètres d’acquisition du microscope confocal en fonction des qualités et des niveaux d’expression de la molécule fluorescente, ainsi que de la profondeur et des propriétés optiques du tissu. Ajustez les paramètres de puissance laser et de gain principal pour capturer correctement la lumière fluorescente dans la plage optimale et éviter la perte inutile de fluorescence dépendante du succès du camp G. Centrez ensuite le champ de vision sur un amas neuronal situé coddlée à la partie rostrale de la moelle épinière. Effectuez un balayage de série chronologique avec un champ de vision de 79,86 micromètres carrés à une fréquence d’images de 1,20 images par seconde avec une résolution spatiale de 0,119 micromètre carré par pixel. Ajustez le champ de vision, la taille et la vitesse d’acquisition en fonction des objectifs de l’expérience. Deux minutes après le début de l’imagerie, ajoutez 41,67 microlitres de solution mère d’isothiocyanate d’aloès ou de milieu embryonnaire dans la boîte, et continuez l’enregistrement pendant environ 30 secondes pour observer les changements dans l’activité de G Camp 6 dans la région d’intérêt grâce à l’imagerie en accéléré. Si la sortie enregistrée n’est pas au format de fichier dot TIF, exportez les fichiers d’image sous forme de fichiers dot TIF à partir de la suite logicielle de microscope pour l’analyse en aval des Fidji. Après avoir téléchargé le logiciel Fiji pour l’analyse des traces neuronales, ouvrez Fidji, importez les fichiers point CZI dans le programme. Utilisez le cercle ou les outils à main levée aux Fidji pour mettre en évidence une zone ou un neurone d’intérêt en cliquant sur les icônes respectives. Après avoir sélectionné la région d’intérêt ou le retour sur investissement, cliquez sur analyser, outils et gestionnaire de retour sur investissement dans la barre d’outils Fidji. Cliquez sur Ajouter T pour ajouter le retour sur investissement sélectionné à la fenêtre du gestionnaire de retour sur investissement. Dans le gestionnaire de retour sur investissement, cliquez sur plus et multi-mesure pour analyser le retour sur investissement. Laissez les paramètres par défaut et cliquez sur OK pour générer des données brutes. Enregistrez ensuite la sortie sous forme de fichier CSV pour une manipulation ultérieure à l’aide de Python ou de feuilles de calcul. Maintenant, normalisez les données brutes pour les représenter comme une trace neuronale en faisant la moyenne des 30 dernières secondes du préstimulus de deux minutes et générez une intensité de fluorescence normalisée à l’aide de la formule donnée et tracez les données normalisées comme des traces neuronales. L’administration d’isothiocyanate d’aloès a provoqué une augmentation de la fluorescence de G CAMP 6S dans une région cérébrale localisée de larves de poisson-zèbre, indiquant une activité neuronale accrue. À une vitesse de capture lente de 0,10 image par seconde, les neurones du cerveau postérieur et de la moelle épinière étaient clairement visibles avec une haute résolution. L’augmentation de la vitesse de capture à 0,79 image par seconde a entraîné une légère perte de résolution spatiale, mais une résolution temporelle améliorée. À 3,16 images par seconde, les neurones semblaient moins distincts tout en capturant plus de dynamique temporelle.