Assemblage et quantification de co-cultures combinant des levures hétérotrophes avec des cyanobactéries phototrophes sécrétant du sucre

Notre recherche vise à comprendre les réseaux microbiens dans des consortiums synthétiques impliquant des cyanobactéries sécrétant du saccharose et des champignons hétérotrophes. Dans le passé, les microbiologistes étudiaient généralement des cultures pures de micro-organismes uniques. Dans la nature, cependant, les microbes se produisent généralement en consortiums, et il est donc essentiel de comprendre également les réseaux microbiens dans les cultures mixtes.

L’un des principaux défis consiste à trouver des conditions de croissance appropriées, y compris un milieu qui permette la croissance de tous les membres du consortium. Ici, nous nous concentrons principalement sur l’optimisation de la production et de la sécrétion de saccharose les plus élevées par le membre phototrophe, ce qui constitue la base de la croissance des membres hétérotrophes. Pour suivre la croissance dans les cultures axéniques, des techniques courantes telles que les mesures de densité optique ou de rétrodiffusion peuvent être utilisées.

Cependant, ces techniques ne s’appliquent pas aux co-cultures où nous avons besoin du nombre de cellules de l’espèce individuelle. Dans notre protocole, nous appliquons une combinaison de marquage fluorescent et de comptage cellulaire pour distinguer les différents partenaires de co-culture. De plus, nous avons pu montrer que des résultats similaires peuvent être obtenus par différentes méthodes allant de simples et peu coûteuses à des méthodes coûteuses et à haut débit.

Pour commencer, granulez les cellules cyanobactériennes après avoir cultivé la culture pendant trois jours. Remettez la pastille en suspension dans 25 millilitres de milieu stérile CoYBG-11. Centrifugez l’échantillon à 4 000 g pendant 20 minutes à température ambiante.

Jetez ensuite le surnageant par décantation. Une fois la densité optique déterminée, ajoutez la quantité calculée de CoYBG-11 dans un flacon chicané de 250 millilitres dans des conditions stériles. Ensuite, ajoutez les volumes calculés des suspensions de cellules cyanobactériennes et hétérotrophes pour obtenir un volume de culture final de 50 millilitres.

Utilisez 50 microlitres du stock IPTG à une molaire pour une culture de 50 millilitres. Placez ensuite le ballon dans le photoincubateur à environ 200 micromoles de photons par mètre carré et par seconde. Complétez l’environnement avec 2 % de dioxyde de carbone à 30 degrés Celsius, des secousses orbitales à 150 tr/min et 75 % d’humidité.

Pour l’échantillonnage, sortez le ballon de l’incubateur et prélevez un échantillon d’un millilitre de la culture dans des conditions stériles. Pour préparer la quantification microscopique, assurez-vous que la chambre de comptage et le verre de couverture sont exempts de poussière et de cellules. Positionnez correctement la vitre de protection en la faisant glisser sur les deux barres de support avec une légère pression tout en évitant de la casser.

Une fois que la vitre de protection est correctement positionnée, observez les anneaux de Newton entre les deux surfaces vitrées tout en vous assurant que la vitre de protection ne glisse pas. Maintenant, mélangez soigneusement la suspension cellulaire et appliquez quelques microlitres sur le bord de la chambre. Laissez la chambre se remplir complètement par capillarité.

Ensuite, utilisez l’objectif approprié d’un microscope optique et concentrez-vous sur les lignes de la grille de la chambre de comptage. Comptez les cellules dans les carrés appropriés à la taille de cellule donnée. Pour la quantification par comptage de particules, ajustez la densité optique de l’échantillon à 0,1.

Ajoutez ensuite 10 microlitres de l’échantillon à 10 millilitres de tampon de mesure isotonique. Fixez le couvercle du gobelet d’échantillon et mélangez doucement l’échantillon en inclinant légèrement le gobelet. Après avoir placé le gobelet d’échantillon dans le compteur de particules, insérez un capillaire avec la taille de pore appropriée pour les cellules utilisées dans le gobelet d’échantillon et fermez la porte de la machine.

Démarrez la mesure et enregistrez dans une plage appropriée. Les cellules de tailles différentes peuvent être discriminées à ce stade. Pour la quantification par cytométrie en flux unicellulaire, ajustez la densité optique des échantillons pour qu’elle soit adaptée à la mesure cytométrique.

Appliquez la formule donnée pour vous assurer que le nombre de cellules reste dans une plage de 1 000 à 10 000 cellules par seconde à un débit de 10 microlitres par minute. Transférez 300 microlitres de chaque suspension de cellule d’échantillon dans un puits individuel dans une plaque de 96 puits. Transférez ensuite la plaque à 96 puits dans l’échantillon automatique du cytomètre.

Diagrammes à points ouverts et histogrammes pour les canaux de fluorescence et de diffusion pertinents pour les échantillons. Pour déterminer la concentration de la cellule, enregistrez un volume d’échantillon défini à l’aide de la fonction d’enregistrement. Séparez les signaux pour les organismes phototrophes et hétérotrophes en fonction de l’autofluorescence rouge de l’organisme phototrophe à l’aide de l’histogramme du canal APC-H.

Utilisez ensuite l’histogramme du canal FITC-H affichant uniquement la population hétérotrophe pour identifier les cellules hétérotrophes contenant la protéine fluorescente verte. Utilisez l’histogramme du canal PC5.5-H pour distinguer les cellules hétérotrophes contenant de la protéine fluorescente rouge de celles qui n’en contiennent pas.