Name: Assemblage et quantification de co-cultures combinant des levures hétérotrophes avec des cyanobactéries phototrophes sécrétant du sucre (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-12-27T13:20:00.000+00:00
Duration: 5 min 44 s
Description: Découvrez comment assembler et quantifier des co-cultures de cyanobactéries sucrées et de levures hétérotrophes. Ce protocole optimise la production de sucrose et le suivi des interactions microbiennes.

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<meta charset="utf8"></head><body>Protocole de co-culture de cyanobactéries sécrétant du saccharose avec des partenaires fongiques

<table><tbody><tr><td>10x Objectif Ph1</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>46 04 01-9904</td><td></td></tr><tr><td>525/40 nm Filtre passe-bande</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td>A01-1-0051</td><td>Filtre FITC (en laser 488 nm)</td></tr><tr><td>Filtre passe-bande 660/10 nm</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td>A01-1-0055</td><td>Canal APC (en laser 638 nm)</td></tr><tr><td>Filtre passe-bande 710/50 nm</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td>B71092</td><td>PC5.5 canal (en laser 561 nm)</td></tr><tr><td>Accuvettes pour Multisizer 4e</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td>A35473</td><td>Gobelets d’échantillons avec couvercles</td></tr><tr><td>Tube d’ouverture 30 &mu ; M pour Multisizer 4e</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td>C92760</td><td></td></tr><tr><td>Autoclave</td> capillaire <td>Lab Associates</td><td>EQM-ARBP</td><td>pour la stérilisation du matériel</td></tr><tr><td>Flacons à chicanes ROTILABO&reg ;, Col droit, 250 ml</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>LY95.1</td><td></td></tr><tr><td>BG11 / CoYBG11 composants</td><td>différents fournisseurs</td><td></td><td>voir tableau 1&nbsp ;</td></tr><tr><td>Filtre stérile sur flacon</td><td>Sigmaaldrich</td><td>Z222593</td><td>aux milieux stériles si vous ne souhaitez pas utiliser l’autoclave</td></tr><tr><td>Capillaire 45 & micro ; m</td><td>Omni Life Science</td><td>OLS 5651738</td><td></td></tr><tr><td>CASY Cell Counter Modèle TTC</td><td>Schaerfe Systems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CASY cups</td><td>Omni Life Science</td><td>OLS 5651794</td><td></td></tr><tr><td>CASYclean</td><td>Omni Life Science</td><td>OLS 5651786</td><td>Solution de nettoyage</td></tr><tr><td>CASYton</td><td>Solution Omni Life Science</td><td>OLS 5651808</td><td>Isotonic solution&nbsp ;</td></tr><tr><td>Tubes à centrifuger (50 mL)</td><td>Sigmaaldrich</td><td>CLS430828</td><td></td></tr><tr><td>CO2</td><td>BOC</td><td>270182-L</td><td>pour l’approvisionnement en cultures axéniques de cyanobactéries</td></tr><tr><td>CONTRAD&reg ; 70</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td>81911</td><td>Solution de nettoyage en profondeur</td></tr><tr><td>Verre de couverture 20 & times ; 26 x 0,4 mm</td><td>VWR International GmbH</td><td>631-1190</td><td>Verre de protection pour chambre de comptage</td></tr><tr><td>Cuvettes</td><td>Sarstedt&nbsp ;</td><td>67.742</td><td></td></tr><tr><td>Cyanobactéries BG-11 Solution d’eau douce</td><td>Merck KGaA</td><td>C3061</td><td></td></tr><tr><td>Logiciel CytExpert v. 2.6</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td></td><td>Logiciel d’application de cytomètre CytoFLEX</td></tr><tr><td>Sheath Fluid</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td>B51503</td> Cytomètre <td>à fluide Sheat</td></tr><tr><td>CytoFLEX S</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nettoyeur BE51180 DxH pour Multisizer 4e</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td>628022</td><td>Solution de nettoyage</td></tr><tr><td>Centrifugeuse à tube Eppendorf (petite)</td><td>Labstac</td><td>CEN16-15</td><td>pour centrifuger moins de 2 ml de culture</td></tr><tr><td>Éthanol</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>K928.1</td><td></td></tr><tr><td>Tubes FACS</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td>2523749</td><td>tubes pour le mode semi-automatique</td></tr><tr><td>Agent de nettoyage FlowClean, 500ml</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td>C48093</td><td>Solution de nettoyage quotidien</td></tr><tr><td>Cylindres gradués</td><td>Sigmaaldrich</td><td>Z131121</td><td>pour la préparation des milieux</td></tr><tr><td>HEPPSO</td><td>Merck KGaA</td><td>R426725</td><td></td></tr><tr><td>Infors MultiTron photoincubateur</td><td>Infors AG</td><td></td><td>lumière LED blanche</td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Merck KGaA</td><td>I6758</td><td>Préparer les aliquotes, stocker à -20&deg ; C, décongeler et garder sur la glace&nbsp ;</td></tr><tr><td>Isoton II pour Multisizer 4e</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td>8448011</td><td>Solution isotonique</td></tr><tr><td>Kaluza c. 2.2</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td>B16406</td><td>Logiciel d’analyse de données de cytométrie</td></tr><tr><td>KimWipes</td><td>VWR International GmbH</td><td>115-2221</td><td>Tissus non pelucheux</td></tr><tr><td>KOH</td><td>Merck KGaA</td><td>221473</td><td></td></tr><tr><td>KPO3</td><td>Noah Chemicals</td><td>7790-53-6</td><td></td></tr><tr><td>Béchers de mesure</td><td>VWR</td><td>213-3747</td><td></td></tr><tr><td>Micro plaque de test, 96 puits, couvercle à enfiler, fond plat, PS, transparent</td><td>SARSTEDT AG & Co. KG</td><td>82.1581.001</td><td></td></tr><tr><td>Base de microscope</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>47 09 18-9902/16</td><td></td></tr><tr><td>Tête de microsope</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>47 30 14</td><td></td></tr><tr><td>Système de purification d’eau Milli-Q</td><td>Merck Millipore</td><td>C85358</td><td></td></tr><tr><td>Multitisseur 4e compteur de particules</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td>B23005</td><td>Alternative au compteur de cellules CASY</td></tr><tr><td>Neubauer amélioré, profondeur 0,02 mm</td><td>Assistent Allemagne</td><td></td><td>Chambre de comptage</td></tr><tr><td>Neubauer améliorée, profondeur 0,1 mm</td><td>Paul Marienfeld GmbH & Co. KG</td><td>640010</td><td>Chambre de comptage</td></tr><tr><td>Prêt à l’emploi Fluorosphères QC</td><td>quotidiennes Beckman Coulter, Inc.</td><td>C65719</td><td>Référence pour les</td></tr><tr><td>bouteilles QC SCHOTT</td><td>Dutscher</td><td>90347</td><td>pour le stockage</td></tr><tr><td>Specord&reg ; 200 Plus Spectrophotomètre</td><td>Analytique Jena GmbH</td><td></td><td>OD600/750</td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Merck KGaA</td><td>84100</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse de table (grande)</td><td>Labstac</td><td>CEN18-06R</td><td>collecter la biomasse de culture</td></tr><tr><td>Levure Base d’azote, sans acides aminés, sans sulfate d’ammonium</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td><td></td><td></td>11743014</tr></tbody></table>

assemblage et quantification de co-cultures combinant des levures hétérotrophes avec des cyanobactéries phototrophes sécrétant du sucre

Assembly and Quantification of Co-Cultures Combining Heterotrophic Yeast with Phototrophic Sugar-Secreting Cyanobacteria

Etablissement de co-cultures de S. elongatus phototrophes et de levures hétérotrophes Nous avons déjà présenté des résultats détaillés de la co-culture de Synechococcus elongatus PCC 7942 avec une variété de sous-souches de S. cerevisiae. Pour une description complète des résultats de co-culture avec cette paire cyanobactéries/levures, voir8. Par souci de concision et d’exactitude, ces résultats ne sont pas reproduits ici. Brièvement, les résultats antérieurs indiquent un certain nombre de considérations qui sont importantes pour l’établissement de co-cultures cyanobactériennes-levures à long terme. La capacité de la levure à survivre dans des conditions où les cyanobactéries fournissent les seules formes de carbone fixe dépend fortement de l’efficacité avec laquelle la souche de levure peut utiliser le saccharose. Les souches de S. cerevisiae qui ont évolué ou qui ont été modifiées pour métaboliser plus efficacement le saccharose27,28 étaient plus susceptibles de survivre à la transition vers le mode de croissance en co-culture, ont atteint des densités cellulaires plus élevées et ont montré une plus grande robustesse dans les expériences de co-culture de cyanobactéries à long terme (de quelques jours à quelques semaines)8. La phase initiale de l’inoculation d’une co-culture était particulièrement importante pour la viabilité de la levure, probablement en raison des contraintes de dilution de la culture, de la composition du milieu de commutation et/ou du retrait d’une source de carbone plus concentrée. Par conséquent, les efforts visant à faciliter la transition d’un milieu de croissance plus riche à une disponibilité minimale de carbone au début de la coculture peuvent améliorer le rendement et la cohérence des expériences (voir l’étape 1.2.1.1). De plus, S. cerevisiae a présenté des réponses de stress compatibles avec l’hyperoxie lorsqu’il a été inoculé dans des cultures denses de S. elongatus, ce qui correspond à la formation d’O2 en tant que sous-produit primaire de la photosynthèse oxygénée. Par conséquent, les efforts visant à prévenir la prolifération du partenaire cyanobactérien et/ou l’alternance des cycles de lumière « jour/nuit » pourraient prolonger considérablement la viabilité de S. cerevisiae dans les cocultures à long terme. Voir la section Discussion pour un résumé supplémentaire des phénomènes courants dans les co-cultures par rapport aux échantillons de contrôle axéniques.
Suivi de la croissance des cocultures à l’aide de différentes méthodologies Dans la section suivante, la quantification exemplaire d’un consortium tripartite artificiellement mélangé de Synechocystis et des deux levures S. cerevisiae et U. maydis à l’aide de trois méthodes différentes est décrite. Pour le mélange, les DO750 (pour les cyanobactéries) et DO600 (pour les hétérotrophes) des cultures uniques ont été déterminées et ajustées à DO 0,1. Des cultures simples ont été mélangées dans un rapport de 1:1:1 en utilisant la densité optique (qui est distincte du comptage des cellules, voir ci-dessus). Pour faciliter la discrimination des levures dans le cytomètre, les souches rapporteures de S. cerevisiae FY1679-O1B29 génétiquement modifiées produisent constitutivement mKate2 cytoplasmique (génotype : URA3Δ/pTDH3 ::mKate2 ; souche : S. cerevisiae mKate230) et la souche AB3331 d’U. maydis produisent constitutivement l’eGFP (génotype : pep4Δ/pRpl40 ::egfp ; souche : U. maydis eGFP32) ont été utilisés. Il convient de noter que la souche cyanobactérienne était équipée d’un plasmide réplicatif favorisant l’expression constitutive et forte de la version protéique fluorescente jaune mVenus (Synechocystis sp. PCC 6803 pSHDY-Pcpc560-mVenus, souche Synechocystis mVenus, similaire à33) et en outre, présente la forte autofluorescence typique due à la présence de la machinerie photosynthétique.
Quantification microscopique à l’aide de chambres de comptage : Tous les types de cellules du mélange artificiel utilisé de trois micro-organismes peuvent être facilement discriminés au microscope (figure 2A) : Synechocystis et S. cerevisiae sont représentés par des cellules sphériques qui diffèrent toutefois considérablement par leur diamètre (Synechocystis : diamètre approximatif de 1,5 à 3 m, S. cerevisiae : diamètre approximatif de 3 à 6 m), tandis que les cellules d’U. maydis ont une morphologie allongée en forme de cigare et une longueur d’au moins 10 m (figure 2A). Ces traits morphologiques clairs permettent la quantification exacte de chaque partenaire dans le mélange. À titre d’exemple, 37, 18, 36 et 21 cellules de S. cerevisiae sont comptées dans les quatre grands carrés, respectivement (figure 2B). La valeur moyenne est de 28 cellules. Étant donné qu’un grand carré de l’hémocytomètre utilisé a une aire de 1mm2 et que la profondeur de la chambre était de 0,02 mm, cela donne 28 cellules par 0,02 μL. Cela correspond à 1 400 cellules/μL, ce qui équivaut à 1,4 x 106 cellules/mL. Les autres types de cellules ont été dénombrés, et les concentrations ont été déterminées en conséquence (figure 2C, tableau 2).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67311/67311fig02.jpg"> 
Figure 2 : Quantification microscopique d’un consortium tripartite composé de Synechocystis et des levures S. cerevisiae et U. maydis. (A) Image microscopique à contraste différentiel (CID) d’un mélange combiné artificiellement des micro-organismes indiqués. Toutes les espèces se distinguent facilement par leur morphologie. Barre d’échelle : 10 μm. (B) Résultats de comptage exemplaires pour un mélange assemblé artificiellement des souches indiquées sur la base de cultures axéniques avec une DO de 0,1. Les quatre grands carrés situés sur les bords de la grille ont été analysés (marque rouge sur la figure 1D). (C) La valeur moyenne des différentes cellules comptées dans les quatre carrés a été utilisée pour calculer la concentration des cellules dans la suspension à l’aide de l’équation suivante : Valeur moyenne/(profondeur de la chambre [0,02 mm] x taille du carré compté [1 mm2] x 1 000). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67311/67311fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
Quantification à l’aide de compteurs de particules : Les compteurs de particules déterminent le nombre de particules dans une suspension en fonction de leur taille. Dans l’exemple de jeu de données, un compteur de particules avec un capillaire de 45 μm a été utilisé. Étant donné que les cellules de S. cerevisiae et d’U. maydis présentent des dimensions similaires, elles ne peuvent pas être distinguées dans le compteur de particules, tandis que les cellules plus petites de Synechocystis peuvent être clairement séparées. L’analyse des cultures uniques montre donc des pics à des positions identiques se référant à 3 à 6 μm pour les deux levures (Figure 3A). Pendant la mesure, une pression négative est appliquée, ce qui fait entrer les cellules dans le capillaire. Cela modifie brièvement la résistance électrique afin que l’appareil puisse déterminer la taille des particules en fonction de la modification. Dans la culture mixte, deux pics distincts peuvent être détectés, l’un associé aux cellules cyanobactériennes plus petites et l’autre représentant une fraction conjointe des deux espèces de levures (Figure 3B). Il est important de noter qu’en plus des pics reflétant les cellules vivantes, des pics supplémentaires ont été détectés à environ 1 μm (Figure 3), correspondant à des débris cellulaires et à des particules plus petites. Les signaux qui apparaîtraient à des diamètres plus grands que prévu peuvent être causés par des agrégations de cellules. Il est à noter que la forme des pics reflète l’homogénéité des cellules : un pic pointu montre des cellules très homogènes, ce qui est peu probable pour une co-culture. Dans une co-culture, on s’attend à ce qu’il y ait un pic très large ou même deux pics si les partenaires de la co-culture sont clairement de taille différente. Pour les cultures axéniques de champignons hétérotrophes, le pic peut être un pic de largeur moyenne.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67311/67311fig3v2.jpg"> 
Figure 3 : Quantification d’un consortium tripartite composé de Synechocystis mVenus et des levures S. cerevisiae mKate2 et U. maydis eGFP à l’aide d’un compteur de particules. (A) Sortie visuelle des analyses des cultures axéniques des trois souches comme indiqué dans les graphiques (compteur de cellules avec capillaire de 45 μm). (B) Fichier de sortie visuelle exemplaire pour l’analyse du consortium tripartite artificiel dans des conditions identiques. Le compteur de particules ne permet pas de discriminer les deux espèces de levures qui sont toutes deux représentées par le deuxième pic. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67311/67311fig3v2large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
Quantification par cytométrie unicellulaire : À l’aide du cytomètre en flux unicellulaire, les différentes populations cellulaires peuvent être facilement distinguées en fonction de leurs propriétés d'(auto-)fluorescence et de diffusion de la lumière. Les cellules phototrophes (Synechocystis) peuvent être différenciées des cellules hétérotrophes (U. maydis et S. cerevisiae) sur la base de l’autofluorescence rouge des pigments photosynthétiques qui est mesurée dans le canal APC-H (Figure 4A). Sur la base de cette séparation initiale des cellules phototrophes et hétérotrophes, les deux populations hétérotrophes peuvent être distinguées en fonction de leurs marqueurs fluorescents eGFP dans le canal FITC-H et mKate2 dans le canal PC5.5 (Figure 4B,C). Dans un diagramme à points montrant les propriétés de diffusion des trois populations (FSC-H et FSC-Width), les populations peuvent également être distinguées avec seulement quelques chevauchements mineurs des populations (figure 4D).
Avec cette méthode, 10 μL des échantillons dilués ont été analysés avec un débit de 10 μL/min, permettant une quantification d’environ 70 000 cellules en 1 min. Environ 60 % de ces cellules ont pu être attribuées à Synechocystis (4,23 x 106 cellules/mL), tandis que les 40 % restants étaient répartis également entre U. maydis (1,35 x 106 cellules/mL) et S. cerevisiae (1,36 x 106 cellules/mL, figure 4E, tableau 2).
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67311/67311fig04.jpg"> 
Figure 4 : Quantification d’un consortium tripartite composé de la cyanobactérie Synechocystis mVenus et des levures U. maydis eGFP et S. cerevisiae mKate2 par cytométrie en flux unicellulaire. Exemples de tracés obtenus après mesure d’une culture mixte de Synechocystis mVenus (vert foncé), U. maydis eGFP (vert clair) et S. cerevisiae mKate2 (rouge) dans un rapport de 1/3 OD750 / 1/3 OD600 / 1/3 OD600 sur un cytomètre (A) montrant un histogramme du nombre d’événements et de la fluorescence dans le canal APC-H (ex. : 638 nm, émissaire : 660/10 nm) de toutes les cellules utilisées pour différencier les cellules phototrophes et hétérotrophes en fonction de leur autofluorescence. (B) Un histogramme du nombre d’événements et de la fluorescence dans le canal FITC-H (ex. : 488 nm, ém. : 525/40 nm) de toutes les cellules hétérotrophes utilisées pour différencier les cellules eGFP d’U. maydis et de S. cerevisiae mKate2 en fonction de leurs propriétés de fluorescence verte. (C) Un histogramme du nombre d’événements et de la fluorescence dans le canal PC5.5-H (ex. : 561 nm, ém. : 710/50 nm) de toutes les cellules hétérotrophes utilisées pour différencier les cellules eGFP d’U. maydis et de S. cerevisiae mKate2 en fonction de leurs propriétés de fluorescence rouge. (D) Un diagramme à points des signaux de diffusion dans la largeur FSC sur le canal FSC-H utilisé pour identifier les populations cellulaires sans propriétés de fluorescence. E) Les statistiques de population, y compris le nombre d’événements, les pourcentages, les moyennes arithmétiques et les écarts-types (ET) des canaux de fluorescence pertinents. La quantité totale de cellules, ainsi que leur taille et leur fluorescence, ont été déterminées dans un volume de 10 μL avec un débit de 10 μL/min. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67311/67311fig04large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
Pour visualiser de manière comparative le résultat des différentes méthodes de quantification, les nombres de cellules déterminés sont présentés dans les deux tableaux suivants (tableau 2 et tableau 3). Les concentrations finales de cellules déterminées à l’aide des trois méthodes décrites précédemment se situent dans une fourchette similaire pour toutes les méthodes. Le cytomètre fournit la taille d’échantillon la plus élevée, suivi du compteur de particules et de la quantification microscopique, avec une diminution d’environ un ordre de grandeur entre les méthodes.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="2">Co-culture 1:1:1</td>
			<td>Photomètre</td>
			<td colspan="2">Cytomètre</td>
			<td colspan="2">Compteur de particules</td>
			<td colspan="2">Chambre de comptage de microscopie</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Organisme</td>
			<td>DIAMÈTRE EXTÉRIEUR750/600</td>
			<td>numération cellulaire</td>
			<td>cellules/mL</td>
			<td>numération cellulaire</td>
			<td>cellules/mL</td>
			<td>numération cellulaire</td>
			<td>cellules/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Saccharomyces cerevisiae mKate2</td>
			<td>0.0333</td>
			<td>13,618</td>
			<td>1,36 x 106</td>
			<td rowspan="2">1,546*</td>
			<td rowspan="2">2,58 x 106*</td>
			<td>112</td>
			<td>1,40 x 106</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Ustilago maydis eGFP</td>
			<td>0.0333</td>
			<td>13,541</td>
			<td>1,35 x 106</td>
			<td>89</td>
			<td>1,11 x 106</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Synechocystis sp. PCC 6803 mVénus</td>
			<td>0.0333</td>
			<td>42,330</td>
			<td>4.23 x 106</td>
			<td>3,094</td>
			<td>5,16 x 106</td>
			<td>271</td>
			<td>3,39 x 106</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tableau 2 : Comparaison des différentes méthodes de quantification : Culture mixte artificielle. Notez que U. maydis et S. cerevisiae ne peuvent pas être distingués à l’aide d’un compteur de particules (*).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="2">Culture unique</td>
			<td>Photomètre</td>
			<td colspan="2">Cytomètre</td>
			<td colspan="2">Compteur de particules</td>
			<td colspan="2">Chambre de comptage de microscopie</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Organisme</td>
			<td>DIAMÈTRE EXTÉRIEUR750/600</td>
			<td>numération cellulaire</td>
			<td>cellules/mL</td>
			<td>numération cellulaire</td>
			<td>cellules/mL</td>
			<td>numération cellulaire</td>
			<td>cellules/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Saccharomyces cerevisiae mKate2</td>
			<td>0.1</td>
			<td>38,936</td>
			<td>3,89 x 106</td>
			<td>1,928</td>
			<td>3,21 x 106</td>
			<td>403</td>
			<td>4,03 x 106</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Ustilago maydis eGFP</td>
			<td>0.1</td>
			<td>36,927</td>
			<td>3,69 x 106</td>
			<td>2,465</td>
			<td>4,11 x 106</td>
			<td>307</td>
			<td>3,07 x 106</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Synechocystis sp. PCC 6803 mVénus</td>
			<td>0.1</td>
			<td>127,864</td>
			<td>1,28 x 107</td>
			<td>8,186</td>
			<td>1,36 x 107</td>
			<td>428</td>
			<td>1,07 x 107</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tableau 3 : Comparaison des différentes méthodes de quantification : Calibrage avec des cultures simples/axéniques.

Assemblage et quantification de co-cultures combinant des levures hétérotrophes avec des cyanobactéries phototrophes sécrétant du sucre

With the increasing demand for sustainable biotechnologies, mixed consortia containing a phototrophic microbe and heterotrophic partner species are being ...

Notre recherche vise à comprendre les réseaux microbiens dans des consortiums synthétiques impliquant des cyanobactéries sécrétant du saccharose et des champignons hétérotrophes. Dans le passé, les microbiologistes étudiaient généralement des cultures pures de micro-organismes uniques. Dans la nature, cependant, les microbes se produisent généralement en consortiums, et il est donc essentiel de comprendre également les réseaux microbiens dans les cultures mixtes.L’un des principaux défis consiste à trouver des conditions de croissance appropriées, y compris un milieu qui permette la croissance de tous les membres du consortium. Ici, nous nous concentrons principalement sur l’optimisation de la production et de la sécrétion de saccharose les plus élevées par le membre phototrophe, ce qui constitue la base de la croissance des membres hétérotrophes. Pour suivre la croissance dans les cultures axéniques, des techniques courantes telles que les mesures de densité optique ou de rétrodiffusion peuvent être utilisées.Cependant, ces techniques ne s’appliquent pas aux co-cultures où nous avons besoin du nombre de cellules de l’espèce individuelle. Dans notre protocole, nous appliquons une combinaison de marquage fluorescent et de comptage cellulaire pour distinguer les différents partenaires de co-culture. De plus, nous avons pu montrer que des résultats similaires peuvent être obtenus par différentes méthodes allant de simples et peu coûteuses à des méthodes coûteuses et à haut débit.Pour commencer, granulez les cellules cyanobactériennes après avoir cultivé la culture pendant trois jours. Remettez la pastille en suspension dans 25 millilitres de milieu stérile CoYBG-11. Centrifugez l’échantillon à 4 000 g pendant 20 minutes à température ambiante.Jetez ensuite le surnageant par décantation. Une fois la densité optique déterminée, ajoutez la quantité calculée de CoYBG-11 dans un flacon chicané de 250 millilitres dans des conditions stériles. Ensuite, ajoutez les volumes calculés des suspensions de cellules cyanobactériennes et hétérotrophes pour obtenir un volume de culture final de 50 millilitres.Utilisez 50 microlitres du stock IPTG à une molaire pour une culture de 50 millilitres. Placez ensuite le ballon dans le photoincubateur à environ 200 micromoles de photons par mètre carré et par seconde. Complétez l’environnement avec 2 % de dioxyde de carbone à 30 degrés Celsius, des secousses orbitales à 150 tr/min et 75 % d’humidité.Pour l’échantillonnage, sortez le ballon de l’incubateur et prélevez un échantillon d’un millilitre de la culture dans des conditions stériles. Pour préparer la quantification microscopique, assurez-vous que la chambre de comptage et le verre de couverture sont exempts de poussière et de cellules. Positionnez correctement la vitre de protection en la faisant glisser sur les deux barres de support avec une légère pression tout en évitant de la casser.Une fois que la vitre de protection est correctement positionnée, observez les anneaux de Newton entre les deux surfaces vitrées tout en vous assurant que la vitre de protection ne glisse pas. Maintenant, mélangez soigneusement la suspension cellulaire et appliquez quelques microlitres sur le bord de la chambre. Laissez la chambre se remplir complètement par capillarité.Ensuite, utilisez l’objectif approprié d’un microscope optique et concentrez-vous sur les lignes de la grille de la chambre de comptage. Comptez les cellules dans les carrés appropriés à la taille de cellule donnée. Pour la quantification par comptage de particules, ajustez la densité optique de l’échantillon à 0,1.Ajoutez ensuite 10 microlitres de l’échantillon à 10 millilitres de tampon de mesure isotonique. Fixez le couvercle du gobelet d’échantillon et mélangez doucement l’échantillon en inclinant légèrement le gobelet. Après avoir placé le gobelet d’échantillon dans le compteur de particules, insérez un capillaire avec la taille de pore appropriée pour les cellules utilisées dans le gobelet d’échantillon et fermez la porte de la machine.Démarrez la mesure et enregistrez dans une plage appropriée. Les cellules de tailles différentes peuvent être discriminées à ce stade. Pour la quantification par cytométrie en flux unicellulaire, ajustez la densité optique des échantillons pour qu’elle soit adaptée à la mesure cytométrique.Appliquez la formule donnée pour vous assurer que le nombre de cellules reste dans une plage de 1 000 à 10 000 cellules par seconde à un débit de 10 microlitres par minute. Transférez 300 microlitres de chaque suspension de cellule d’échantillon dans un puits individuel dans une plaque de 96 puits. Transférez ensuite la plaque à 96 puits dans l’échantillon automatique du cytomètre.Diagrammes à points ouverts et histogrammes pour les canaux de fluorescence et de diffusion pertinents pour les échantillons. Pour déterminer la concentration de la cellule, enregistrez un volume d’échantillon défini à l’aide de la fonction d’enregistrement. Séparez les signaux pour les organismes phototrophes et hétérotrophes en fonction de l’autofluorescence rouge de l’organisme phototrophe à l’aide de l’histogramme du canal APC-H.Utilisez ensuite l’histogramme du canal FITC-H affichant uniquement la population hétérotrophe pour identifier les cellules hétérotrophes contenant la protéine fluorescente verte. Utilisez l’histogramme du canal PC5.5-H pour distinguer les cellules hétérotrophes contenant de la protéine fluorescente rouge de celles qui n’en contiennent pas.

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Source : Jiang, H., Ho, M. Isolement et caractérisation de phycobilisomes intacts chez les cyanobactéries. J. Vis. Exp. (2021).Cette vidéo montre la procédure de culture des cyanobactéries pour obtenir de la biomasse en cultivant des cellules sous un éclairage continu avec un apport en dioxyde de carbone et des conditions riches en nutriments, suivie d’une récolte par centrifugation.

Préparation de la culture de cyanobactéries pour la production de biomasse

Nous avons conçu un appareil de culture en continu destiné à être utilisé avec des systèmes optogénétiques pour éclairer les cultures de micro-organismes et cellules d'image régulièrement dans l'effluent avec un microscope inversé. La culture, l'échantillonnage, l'imagerie et l'analyse d'images sont entièrement automatisées afin que les réponses dynamiques à l'éclairage peuvent être mesurés sur plusieurs jours.

Conception et mise en œuvre d&#39;un Illuminating automatisé, la culture, et du système d&#39;échantillonnage pour Microbial optogénétiques Applications

Ici, nous présentons un protocole décrivant comment i) assembler un vecteur auto-réplicant à l'aide de la boîte à outils modulaire de clonage CyanoGate, ii) introduire le vecteur dans un hôte cyanobactérieparpare par conjugaison, et iii) caractériser les souches transgéniques cyanobactéries en utilisant un lecteur de plaque ou cytométrie de flux.

Modification génétique des cyanobactéries par conjugaison à l'aide de la boîte à outils de clonage modulaire CyanoGate

Nous présentons un protocole pour l’identification et la quantification des principales classes de métabolites solubles dans l’eau dans la levure Saccharomyces cerevisiae. La méthode décrite est polyvalente, robuste et sensible. Il permet de séparer les isomères structurels et les formes stéréoisomériques de métabolites solubles dans l’eau les uns des autres.

Métabolomique quantitative de Saccharomyces Cerevisiae par chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse en tandem

Le contrôle optogénétique du métabolisme microbien offre un contrôle dynamique flexible des processus de fermentation. Le protocole montre ici comment mettre en place des fermentations régulées par la lumière bleue pour la production de produits chimiques et de protéines à différentes échelles volumétriques.

Fermentations contrôlées par la lumière pour la production de produits chimiques microbiens et de protéines

Le protocole actuel détaille l’isolement des phycobilisomes des cyanobactéries par centrifugation à travers un gradient de densité de saccharose discontinu. Les fractions de phycobilisomes intacts sont confirmées par le spectre d’émission fluorescent 77K et l’analyse SDS-PAGE. Les fractions phycobilisomes résultantes conviennent à la coloration négative de la TEM et à l’analyse par spectrométrie de masse.

Isolement et caractérisation du phycobilisome intact chez les cyanobactéries

Dans cette étude, l’objectif principal était de surveiller l’absorption cellulaire et l’exocytose éventuelle des nanotubes de carbone (NTC). Dans cette perspective, nous avons proposé ici une méthode unique utilisant la cytométrie en flux d’imagerie multispectrale permettant une quantification et une localisation des NTC dans un nombre statistiquement pertinent de cellules.

Localisation et quantification relative des nanotubes de carbone dans les cellules avec la cytométrie en flux d’imagerie multispectrale

Procédé pour obtenir des nanofibres et des nanostructures complexes de protéines de matrice extracellulaire uniques ou multiples est décrite. Cette méthode utilise les interactions protéine-surface pour créer des matériaux à base de protéines sans date avec la composition accordable et de l'architecture pour une utilisation dans une variété d'applications d'ingénierie tissulaire et de la biotechnologie.

Nanofibres ECM de protéines et Utilisation de l&#39;assemblage de la surface à l&#39;initiative Nanostructures Engineered

Bicouches lipidiques supportées et des particules de la membrane sont des systèmes physiques avantageuses qui peuvent rapprocher les propriétés des membranes des cellules et être incorporés dans une variété de stratégies d'analyse. Nous démontrons ici un procédé pour préparer des microréseaux composées de bicouches lipidiques supportées revêtu de SiO 2, des perles ou des particules des vésicules de phospholipides membranaires naturelles.

Formation de biomembrane puces à ADN avec une méthode Assemblée basée à raclette

Ce manuscrit présente un procédé de moulage par injection pour concevoir des microvaisseaux qui récapitulent les propriétés physiologiques de l'endothélium. Le procédé à base microfluidique crée des réseaux vasculaires 3D de brevet avec conditions, adaptable telles que le débit, la composition cellulaire, la géométrie, et les gradients biochimiques. Le procédé de fabrication et des exemples d'applications possibles sont décrites.

Micromodelage et l&#39;Assemblée des microvaisseaux 3D

Découvrez comment assembler et quantifier des co-cultures de cyanobactéries sucrées et de levures hétérotrophes. Ce protocole optimise la production de sucrose et le suivi des interactions microbiennes.

Assemblage et quantification de co-cultures combinant des levures hétérotrophes avec des cyanobactéries phototrophes sécrétant du sucre (Vidéo) | JoVE Journal

Assemblage et quantification de co-cultures combinant des levures hétérotrophes avec des cyanobactéries phototrophes sécrétant du sucre

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