Name: Conceptions microfluidiques de laminage de polyéthylène téréphtalate à faible coût pour l’imagerie multiplexée du poisson-zèbre (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-27T14:45:00.000+00:00
Duration: 5 min 48 s
Description: Découvrez la fabrication de dispositifs microfluidiques par laminage PET pour l'imagerie multiplexée d'embryons de poisson-zèbre. Cette méthode économique permet d'étudier l'inflammation et la cicatrisation des plaies avec une haute résolution spatiale.

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</ol>

<table><tbody><tr><td>Verre de protection rond de 25 mm de diamètre Epaisseur #1</td><td>Chemglass Life Sciences</td><td>CLS-1760-025</td><td>Matériau de montage de la base. L’épaisseur a été choisie en fonction des spécifications de l’objectif du microscope.</td></tr><tr><td>Adobe Illustrator v28.5</td><td>Adobe</td><td>N/A</td><td>Éditeur vectoriel pour la conception du motif de l’appareil.</td></tr><tr><td>Chlorure de calcium dihydraté</td><td>Fisher</td><td>C79</td><td>Pour la fabrication du milieu E3.</td></tr><tr><td>Fichiers PNG de conception (miroir en ligne)</td><td>N/A</td><td>N/A</td> https://i.ibb.co/QPYj7BL/multipositionalv7-1.png<<td>br/> https://i.ibb.co/FDpQYXc/multipositionalv7-2.png https://i.ibb.co/5TG4SB6/multipositionalv7-3.png</td></tr><tr><td>Design Space for Desktop v8.39</td><td>Cricut</td><td>N/A</td><td>Logiciel propriétaire pour piloter le cutter artisanal.</td></tr><tr><td>Plastifieuse thermique Fusion Plus 7000L</td><td>GBC</td><td>1703098</td><td>. Ce modèle spécifique a été sélectionné pour ses caractéristiques de qualité de vie, telles que la taille maximale de la pile de feuilles.</td></tr><tr><td>Lame Premium en carbure allemand</td><td>Cricut</td><td>10396595</td><td>Lame de rechange pour coupe-artisan.</td></tr><tr><td>Ensemble d’outils de base gris</td><td>Cricut</td><td>10307854</td><td>ensemble d’outils pour le désherbage des coupes, le nettoyage des tapis et le montage de feuilles de PET. Facultatif.&nbsp ;</td></tr><tr><td>Chlorure de magnésium hexahydraté</td><td>Acros 223211000 organique</td><td></td><td>Pour la fabrication du milieu E3.</td></tr><tr><td>Maker 3</td><td>Cricut</td><td>10669040</td><td>Coupe-amas. La Cricut Maker 3 a été sélectionnée plutôt que la Silhouette Cameo 4 pour sa facilité d’utilisation du logiciel, mais n’importe quel découpeur capable de lire des images en noir et blanc fera l’affaire.</td></tr><tr><td>MemGlow 560</td><td>Cytosquelette</td><td>MG02-10</td><td>Colorant rouge pour membranes cellulaires. Aucun lavage nécessaire. Utilisé dans la figure 3.</td></tr><tr><td>N° 22 Lame de scalpel en carbone</td><td>Surgical Design</td><td> 22-079-697</td><td>Lame de scalpel pour les ajustements manuels de coupe. Tout couteau d’artisanat similaire (par exemple, le couteau X-acto #2) fonctionnera également.</td></tr><tr><td>Chlorure de potassium</td><td>Fisher</td><td>BP366</td><td>Pour la fabrication du milieu E3.</td></tr><tr><td>Chlorure de sodium</td><td>Fisher</td><td>BP358</td><td>Pour la fabrication du milieu E3.</td></tr><tr><td>Tapis de découpe adhésif StandardGrip</td><td>Cricut</td><td>10138842</td><td>Tapis de montage pour coupe-artisanat. Le tapis de découpe LightGrip fonctionnera également, mais évitez les tapis de découpe StrongGrip et FabricGrip car la force de l’adhésif peut déformer la coupe finale lors du désherbage et de l’enlèvement. L’adhésif sur les tapis finira par s’user avec une utilisation continue ; Remplacez les tapis au besoin.</td></tr><tr><td>Ruban de papeterie 12 mm</td><td>Deli</td><td>30014</td><td>Ruban de bureau. La marque Deli a été choisie par des tests pour sa facilité de retrait après le laminage.</td></tr><tr><td>Super colle,</td><td>loctite</td> liquide <td>1364076</td><td>colle cyanoacrylate. <forte> La colle utilisée doit être liquide.</forte> Les formulations de gel ne scelleront pas ou n’imperméabilisent pas suffisamment les bords de l’appareil.</td></tr><tr><td>Pochettes de laminage thermique PET, feuilles</td> PET <td>Scotch</td><td>TP3854</td> de 3 mil <td>avec adhésif thermique. Les feuilles arrivent en sandwich et doivent être séparées avant utilisation. Couper avec le côté adhésif vers le bas.</td></tr><tr><td>Pochettes de laminage thermique PET, 5 mil</td><td>Scotch</td><td>TP5854</td><td>Feuilles PET avec adhésif thermique. Les feuilles arrivent en sandwich et doivent être séparées avant utilisation. Couper avec le côté adhésif vers le bas.</td></tr><tr><td>Tricaïne (MS-222)</td><td>Syndel</td><td>IC10310680</td><td>Anesthésique de poisson.</td></tr></tbody></table>

conceptions microfluidiques de laminage de polyéthylène téréphtalate à faible coût pour l’imagerie multiplexée du poisson-zèbre

Low-cost Polyethylene Terephthalate Lamination Microfluidics Designs for Multiplexed Zebrafish Imaging

Pour comparer la qualité d’image produite par un confocal à balayage laser avec et sans l’aide du RADISH, des embryons exprimant le biocapteur calcique intensiométrique GCaMP6f22,24 dans la couche épithéliale externe ont été colorés à l’aide de MemGlow 560 et imagés avec un confocal à balayage laser inversé couvrant toute l’épaisseur du pli de la nageoire caudale à un intervalle de temps de 1 min par image (Vidéo 2). Sans le dispositif (Figure 3A), les échantillons ont dérivé de manière significative et ont présenté des artefacts de bandes, résultant de la limitation de la pile Z à 25 tranches pour s’adapter à la résolution temporelle spécifiée par rapport à l’imagerie avec le dispositif (Figure 3B). Le RADISH a ensuite été utilisé pour examiner les transitoires calciques immédiatement après la blessure chez les embryons exprimant Tg(krt4 :Gal4, UAS :GCaMP6f) x (cdh1-dTomato)xt1821, mettant en évidence la E-cadhérine endogène en rouge et le calcium cytoplasmique dans l’épithélium apical en vert. Les embryons ont été blessés parallèlement aux côtés de la chambre centrale à l’aide d’une lame de scalpel (Figure 4A et Vidéo 3) ou par ablation laser directe avec un laser IR (Figure 4B), puis imagés sur toute l’épaisseur du pli de la nageoire caudale. 
Pour démontrer l’efficacité du RADISH pour l’imagerie à plus long terme, nous avons étudié le recrutement des cellules immunitaires sur le bord de la plaie pendant 24 heures après la blessure. Quatre embryons de poisson-zèbre à 3 dpf exprimant Tol2(mpx :Dendra2) pour marquer les neutrophiles en vert23 ont été blessés par la section de la queue et imagés pendant 24 heures consécutives (Figure 5). Les artefacts d’imagerie généralement associés aux embryons tardifs de 3 dpf à 4 dpf, tels que l’inclinaison et le flottement, étaient remarquablement absents (vidéo 4), et la repousse des tissus s’est poursuivie sans entrave pendant l’expérience. Le recrutement des neutrophiles sur le bord de la plaie se poursuit tout au long de l’image (Figure 5B), la plupart des cellules migratrices partant 24 heures après la blessure (Figure 5C), ce qui correspond à la résolution attendue del’inflammation 25,26.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67313/67313fig01.jpg"> 
Figure 1 : Conception et utilisation d’un dispositif microfluidique à stratifié PET (RADISH). (A) Schéma illustrant la disposition et l’épaisseur des couches individuelles de PET, l’assemblage, le montage et l’utilisation du dispositif. (B) Produit final, monté dans une découpe de 3/4" dans un plat de 35 mm. (C) 3 embryons dpf, (D) 5 embryons dpf, (E) 14 embryons dpf logés à l’intérieur du dispositif. Barres d’échelle = 1 000 μm (C, D, E). Abréviations : PET = polyéthylène téréphtalate ; RADISH = assistant en rotation pour l’imagerie Danio de la cicatrisation ultérieure ; DFF = jours après la fertilisation. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67313/67313fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67313/67313fig02.jpg"> 
Figure 2 : Illustration photographique étape par étape de l’assemblage d’un dispositif PET. (A) Couches individuelles en PET avant laminage. (B) Couche de PET fixée à la lamelle de 25 mm à l’aide de ruban adhésif. (C) Dispositif en cours fixé à un support en plastique pour le laminage. (D) Dispositif stratifié PET terminé. (E) Antenne parabolique de 35 mm modifiée avant le montage de l’appareil. (F) Appareil terminé. Abréviation : PET = polyéthylène téréphtalate. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67313/67313fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67313/67313fig03.jpg"> 
Figure 3 : Amélioration de la qualité des images confocales à balayage laser d’embryons de 3 dpf dans le design RADISH. (A) Image représentative d’un embryon de 3 dpf Tg(krt4 :Gal4, UAS :GCaMP6f) coloré avec MemGlow 560 sans utiliser le RADISH. (B) Image représentative de l’embryon Tg(krt4 :Gal4, UAS :GCaMP6f) coloré avec MemGlow 560 monté dans le RADISH. Barre d’échelle = 100 μm. Abréviations : RADISH = assistant de rotation pour l’imagerie Danio de la cicatrisation ultérieure ; DFF = jours après la fertilisation. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67313/67313fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67313/67313fig04.jpg"> 
Figure 4 : Compatibilité de la conception RADISH avec plusieurs techniques de blessure. (A) 3 dpf Tg(krt4 :Gal4, UAS :GCaMP6f) x (cdh1-dTomato)xt18 embryon blessé par transsection manuelle de la nageoire caudale. (B) Embryon blessé par ablation au laser. (C, D) Les mêmes embryons 4 minutes plus tard, montrant la progression des transitoires calciques après la blessure. Barres d’échelle = 100 μm. Abréviations : RADISH = assistant de rotation pour l’imagerie Danio de la cicatrisation ultérieure ; DFF = jours après la fertilisation. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67313/67313fig04large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67313/67313fig05.jpg"> 
Figure 5 : Piégeage à long terme d’embryons pour l’imagerie de la migration des phagocytes. (A) Les embryons Tol2(mpx :Dendra2) post-blessure et les mêmes embryons (B) 25 min, (C) 12 h et (D) 24 h plus tard. Barres d’échelle = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67313/67313fig05large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>
Fichier supplémentaire 1 : Fichiers vectoriels et PNG pour la conception du dispositif RADISH, comme illustré à la figure 1A. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67313/67313_Supp%20File%201.zip" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>
Vidéo 1 : Vidéo en fond clair de la section manuelle de l’aileron arrière à l’aide de la conception du dispositif RADISH. Abréviation : RADISH = assistant de rotation pour l’imagerie Danio de la cicatrisation ultérieure. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67313/Movie%201.mp4" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.</a>
Vidéo 2 : Comparaison d’embryons non montés et d’embryons montés de 3 dpf Tg(krt4 :Gal4, UAS :GCaMP6f) de la figure 3, acquis à 1 image/min. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67313/Movie%202.mp4" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.</a>
Vidéo 3 : Transitoires calciques dans les embryons Tg(krt4 :Gal4, UAS :GCaMP6f) x (cdh1-dTomato)xt18 blessés par section de scalpel ou ablation laser de la figure 4, acquis à 1 image/min. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67313/Movie%203.mp4" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.</a>
Vidéo 4 : Imagerie à long terme du recrutement des leucocytes et de la régénération de la nageoire caudale chez les embryons de Tol2(mpx :Dendra2). Abréviations : RADISH = assistant de rotation pour l’imagerie Danio de la cicatrisation ultérieure ; HPW = heures après la blessure. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67313/Movie%204.mp4" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.</a>

Conceptions microfluidiques de laminage de polyéthylène téréphtalate à faible coût pour l’imagerie multiplexée du poisson-zèbre

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Cet article décrit une méthode pour monter les embryons fragiles de poisson zèbre pour la microscopie confocale de time-lapse prolongée. Cette méthode à faible coût est facile à exécuter en utilisant des plats de microscopie à fond de verre réguliers pour l'imagerie sur n'importe quel microscope inversé. Le montage est effectué en couches d'agarose à différentes concentrations.

Une méthode de montage en couches pour la microscopie confocale de temps-lapse prolongée des embryons entiers de poisson zèbre

Nous décrivons des outils optimisés pour étudier le cœur du poisson-zèbre in vivo avec la microscopie à fluorescence à feuille de lumière. Plus précisément, nous suggérons des lignées transgéniques cardiaques brillantes et présentons de nouvelles techniques d’intégration et d’immobilisation douces qui évitent les malformations développementales et cardiaques. Un éventuel pipeline d’acquisition et d’analyse de données adapté à l’imagerie cardiaque est également fourni.

Microscopie à feuille de lumière de la dynamique cardiaque rapide chez les embryons de poisson zèbre

Ce protocole utilise l’imagerie par feuille de lumière pour étudier la fonction contractile cardiaque chez les larves de poisson-zèbre et mieux comprendre la mécanique cardiaque grâce au suivi cellulaire et à l’analyse interactive.

Imagerie 4D de la contraction cardiaque du poisson-zèbre

Une stratégie de préparation d’échantillons pour l’imagerie d’embryons précoces de poisson-zèbre dans un chorion intact à l’aide d’un microscope à feuillet de lumière est décrite. Il analyse les différentes orientations que les embryons acquièrent à l’intérieur du chorion aux stades épibolique et bourgeonnaire à 70 % et détaille les stratégies d’imagerie pour obtenir une résolution à l’échelle cellulaire dans tout l’embryon à l’aide du système de feuillet lumineux.

Stratégies d’imagerie et de montage par microscopie à feuillet de lumière pour les embryons précoces de poisson-zèbre

Découvrez la fabrication de dispositifs microfluidiques par laminage PET pour l'imagerie multiplexée d'embryons de poisson-zèbre. Cette méthode économique permet d'étudier l'inflammation et la cicatrisation des plaies avec une haute résolution spatiale.

Conceptions microfluidiques de laminage de polyéthylène téréphtalate à faible coût pour l’imagerie multiplexée du poisson-zèbre

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