Conceptions microfluidiques de laminage de polyéthylène téréphtalate à faible coût pour l’imagerie multiplexée du poisson-zèbre

Notre laboratoire s’intéresse aux mécanismes régulant la migration et l’activation des neutrophiles dans les lésions tissulaires, les infections et le cancer, en mettant l’accent sur les caractéristiques et la signification biologique de la signalisation intracellulaire du calcium dans la cicatrisation des plaies.

[Shelly] Les méthodes conventionnelles de conception microfluidique sont coûteuses et complexes, ce qui ralentit les progrès dans des domaines tels que la biologie du développement qui nécessitent des environnements diversifiés. Nous avons constaté une approche plus rapide et plus efficace pour développer et tester des conceptions individuelles. Ainsi, cette méthode de construction offre une plus grande flexibilité de conception et une résolution spatiale plus grande que les protocoles simples similaires, tout en permettant une itération plus rapide et plus facile que les dispositifs PDMS standard. À l’aide de celui-ci, nous avons développé le RADISH pour imager simultanément plusieurs embryons de poisson-zèbre dans un seul champ de vision.

Avec ce dispositif de piégeage qui prend en charge l’imagerie de la vie à haute résolution, nous sommes prêts à comprendre comment divers signaux, y compris des stimuli chimiques et mécaniques, s’intègrent pour coordonner l’inflammation et la cicatrisation des plaies.

[Instructeur] Pour commencer, concevez le motif de l’appareil à l’aide du logiciel de votre choix. En fonction de l’âge et de la taille de l’embryon, ajustez la largeur du canal et la taille de la chambre d’imagerie centrale pour obtenir le meilleur ajustement. Enregistrez chaque calque sous la forme d’un fichier image individuel aux dimensions identiques. Maintenant, initialisez la machine de découpe selon les instructions du fabricant. Dans l’espace de travail de conception, sélectionnez les conceptions nouvellement téléchargées. Regroupez les motifs destinés à la même épaisseur de feuille de PET dans la même coupe. Confirmez le nombre et le type de motifs dans la coupe, puis sélectionnez le matériau coupé. Ensuite, fixez la feuille de PET au tapis de découpe à l’épaisseur souhaitée en appuyant fermement pour éliminer les bulles d’air et chargez le tapis dans la machine de découpe. Suivez les instructions à l’écran pour demander à la machine de découpe de commencer la coupe. Ensuite, retirez les coupes finies du tapis de découpe. Maintenant, alignez les couches sur une vitre de recouvrement, sans aide ou avec des marques de repérage prédécoupées. Fixez les couches avec du ruban adhésif de bureau pour éviter de les déplacer pendant le laminage. En fonction de la taille de l’appareil et de la capacité de la plastifieuse, montez les petits motifs sur un support plus grand avec plus de ruban adhésif pour éviter de coincer ou d’obstruer l’alimentation de la plastifieuse. Ensuite, allumez la plastifieuse et plastifiez selon les instructions du fabricant. Retirez le ruban adhésif de bureau avant d’aligner la couche suivante. À l’aide de colle cyanoacrylate, fixez l’appareil à une parabole de 35 millimètres percée d’un trou de trois quarts de pouce. Ensuite, imperméabilisez le stratifié en enduisant soigneusement les bords extérieurs de l’appareil avec de la colle cyanoacrylate. Utilisez suffisamment de colle pour couvrir entièrement les bords extérieurs sans espaces. Pour commencer, élevez les embryons de poisson-zèbre au moins deux jours après la fécondation dans E3 ou un autre milieu d’élevage d’embryons approprié. Ensuite, anesthésez les embryons à l’aide de 164 milligrammes par litre de MS-222. Ensuite, remplissez le plat de maintien contenant l’appareil monté avec cinq millilitres d’E3 ou un autre milieu embryonnaire contenant 164 milligrammes par litre de MS-222. À l’aide d’une pipette de transfert, déposez un embryon anesthésié dans chaque chambre de maintien du dispositif. Ensuite, à l’aide d’une boucle de cheveux, orientez les embryons avec la queue de chaque embryon saillant dans la chambre d’imagerie centrale et le jaune immobilisé dans le canal en forme de coin. Si vous le souhaitez, fixez la tête de l’embryon en ajoutant 1,5 % d’agarose à bas point fondu dans la chambre de rétention à l’aide d’une micro-pipette. Enfin, déplacez l’appareil avec des embryons vers le système d’imagerie de votre choix pour commencer l’imagerie, sélectionnez le système d’imagerie et l’objectif appropriés pour l’expérience. Ajustez la mise au point de l’échantillon et les paramètres d’imagerie pour optimiser le rapport signal/bruit et la vitesse d’acquisition. Pour blesser l’embryon par transsection manuelle, appliquez une pression avec une lame de scalpel sur le tissu de la nageoire caudale à l’extrémité de la notocorde sous un stéréomicroscope. Ensuite, remettez l’appareil sur la scène. Pour blesser l’embryon par stimulation laser, définissez une région d’intérêt près du bord du pli de la nageoire caudale et stimulez-la en fonction de la puissance laser disponible. Imagez l’embryon à température ambiante à l’aide des canaux GFP et RFP avec un intervalle d’image d’une minute pour un total d’une heure. Si nécessaire, libérez les embryons après l’imagerie en aspirant doucement près de la tête à l’aide d’une pipette de transfert ou en faisant tourner la boîte.