Modèle de co-culture utilisant deux types de lignées cellulaires adhérentes

Comme le nom de notre institution, l’Institut de médecine maternelle et fœtale, nos recherches portent principalement sur la biologie reproductive féminine. Notre objectif est de comprendre le mécanisme des troubles de la reproduction et d’identifier des cibles potentielles pour les traiter. L’un des principaux avantages de cette approche est la réduction substantielle du temps et des dépenses par rapport aux systèmes de co-culture disponibles dans le commerce.

L’échafaudage fait maison est construit à partir de matériaux facilement disponibles, ce qui réduit considérablement le coût de l’installation. Ces modèles in vitro multicellulaires représentent mieux une anatomie in vivo complexe de la région d’implantation. À l’avenir, notre laboratoire introduira d’autres types de cellules dans ce modèle multicellulaire in vitro d’ensemencement mixte, et étudiera davantage les études d’implantation et la fonction utérine dans la pathogenèse de maladies telles que les lésions de l’endomètre et l’adhérence intra-utérine.

Pour commencer, procurez-vous l’échafaudage imprimé en 3D pour la construction de maquettes. Pour la culture cellulaire, placez une lamelle carrée propre et stérile de 18 millimètres au fond d’une plaque à 12 puits. Enduire la lamelle de 200 microlitres de matrice extracellulaire à une concentration de 200 à 300 microgrammes par millilitre.

Gardez l’assiette à 37 degrés Celsius pendant une heure. Retirez ensuite la matrice extracellulaire de la plaque. Ensuite, inspectez au microscope les cellules souches embryonnaires humaines et les cellules d’Ishikawa préalablement cultivées pour confirmer la confluence appropriée.

Retirez ensuite le milieu épuisé des puits et lavez les cellules deux fois avec trois millilitres de PBS. Maintenant, incubez les cellules avec deux millilitres d’enzyme de dissociation à 37 degrés Celsius pendant deux minutes pour les détacher. Neutralisez la réaction à l’aide d’un milieu de culture complet.

Créez ensuite une suspension unicellulaire en pipetant de haut en bas. Mélangez maintenant 100 microlitres de suspension cellulaire avec du bleu de trypan, en maintenant un facteur de dilution de deux. Faites ensuite glisser la lamelle sur la chambre de l’hémocytomètre.

Remplissez les deux chambres latérales avec la suspension cellulaire mélangée à du bleu trypan. Comptez le nombre de cellules en carrés des deux côtés à l’aide d’un microscope 20X et calculez la densité cellulaire en fonction des comptages. Ensemencez maintenant les cellules souches embryonnaires humaines à une concentration de 10 à la puissance cinq cellules par millilitre dans la plaque préparée contenant du milieu frais, et incubez à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone pendant 24 heures.

Pour la lignée cellulaire Ishikawa, ensemencez les cellules dans le puits sans lamelle le lendemain. Trempez soigneusement les échafaudages avec de l’alcool éthylique et de l’eau doublement distillée pendant deux jours. Après le trempage, retirez l’eau distillée deux fois et fermez la boîte métallique.

Ensuite, stérilisez les échafaudages à l’aide d’un autoclave à 121 degrés Celsius. Après cela, laissez-les sécher. Ajoutez environ deux millilitres de milieu complémentaire dans le puits avec les cellules Ishikawa.

Transférez la lamelle avec les cellules souches embryonnaires humaines attachées sur l’échafaudage, en positionnant la cellule vers le bas. Branchez l’échafaudage dans le puits contenant les cellules Ishikawa. Pour la deuxième configuration, placez la lamelle avec les cellules d’Ishikawa sur l’échafaudage et branchez-la dans le puits contenant les cellules souches embryonnaires.

Incuber les systèmes de co-culture à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone. Retirez délicatement le milieu de culture des puits et rincez doucement les cellules avec du PBS stérile. À l’aide d’une pince fine ou d’une pince à épiler, retirez les lamelles avec les cellules attachées des boîtes de culture.

En option, placez les lamelles dans un nouveau plat avec du PBS pour les garder hydratées pendant le processus de transfert. Ajoutez une goutte de PBS sur une lame de microscope propre et transférez doucement la lamelle contenant les cellules sur la goutte, en vous assurant que les cellules sont face vers le bas sur la lame. Positionnez la lame préparée sur la platine d’un microscope inversé.

Sélectionnez l’objectif approprié et utilisez les boutons de mise au point grossière et fine pour régler la mise au point. Réglez les paramètres du microscope, y compris l’intensité de l’éclairage et les paramètres de la caméra. Utilisez le logiciel de microscope pour capturer des images aux grossissements et aux champs de vision souhaités.

La densité des deux types de cellules est restée faible dans la condition de co-culture après 72 heures, tandis que les densités cellulaires cultivées indépendamment ont augmenté de manière significative. La longueur des cellules souches embryonnaires humaines co-cultivées était plus courte que celle de celles cultivées indépendamment.