Isolement et enregistrement par patch-clamp de cellules entières de la microglie de l’hippocampe chez des souris adultes

Notre recherche se concentre sur l’isolement aigu de la microglie pour les enregistrements de cellules entières, y compris les courants potassiques, afin de comprendre l’activité des canaux ioniques. Le protocole est également adaptable pour isoler la microglie dans diverses régions du cerveau, fournissant des informations sur zéro dans différentes conditions neurologiques.

Les développements les plus récents dans notre domaine de recherche comprennent l’utilisation de la digestion enzymatique traditionnelle de la pancréatite, combinée à la purification de la microglie par tri cellulaire actif par fluorescence. Ces progrès ont amélioré la précision et l’efficacité de l’isolement de populations microgliales spécifiques pour une étude plus approfondie.

Notre protocole étudie les propriétés électrophysiologiques de la microglie directement à partir de l’hippocampe de souris adulte, plutôt que de s’appuyer sur des CS cultivés primaires. Cette approche permet une analyse plus précise des fonctions des microglies dans leur environnement d’origine.

Nos résultats ont ouvert la voie à de nouvelles questions scientifiques sur les propriétés biochimiques et fonctionnelles de la microglie dans des conditions physiologiques et pathologiques, offrant aux chercheurs de précieux conseils pour explorer davantage ces aspects.

[Présentateur] Pour commencer, placez l’animal anesthésié en décubitus dorsal sur une table de dissection et épinglez ses membres. Exposez la poitrine et perfiguez le cœur avec du PBS stérile et glacé pour éliminer les cellules sanguines circulantes intravasculaires. Ensuite, tenez la tête et coupez la peau le long de la ligne médiane du cerveau avec des ciseaux pour exposer le crâne. Ensuite, coupez l’arrière du crâne bilatéralement et entre les orbites avec de petits ciseaux. Coupez le crâne le long de la suture sagittale et retirez le crâne avec une pince à épiler. Après cela, extrayez rapidement le tissu cérébral. Maintenant, placez le tissu cérébral dans des boîtes de culture de 10 centimètres contenant du PBS glacé. Disséquez le cortex cérébral bilatéralement à l’aide d’une pince à épiler. Isolez le tissu de l’hippocampe et coupez-le en petits morceaux. Transférez les morceaux dans un tube à centrifuger de 15 millilitres. Ensuite, mettez en suspension les petits morceaux de tissu de l’hippocampe dans deux millilitres de solution saline équilibrée de Hanks glacée ou HBSS. Et centrifuger à 300 G pendant trois minutes à température ambiante. Après avoir jeté le surnageant, ajoutez 1 950 microlitres de mélange d’enzymes dans le tube à centrifuger de 15 millilitres contenant les morceaux de tissu de l’hippocampe. Agitez le tube de centrifugation en continu dans un bain-marie à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes. Ensuite, ajoutez 30 microlitres de mélange d’enzymes fraîchement préparé dans le tube à centrifuger de 15 millilitres. Pipetez les fragments de tissu de haut en bas 20 fois avec une pointe de pipette d’un millilitre et incubez dans un bain-marie pendant cinq minutes en secouant continuellement à 37 degrés Celsius. Après avoir retiré le tube à centrifuger, pipetez la suspension de haut en bas plusieurs fois avec une pipette d’un millilitre jusqu’à ce qu’il ne reste plus de gros morceaux de tissu. Ensuite, filtrez la suspension cellulaire à travers un filtre de criblage de cellules de 70 micromètres et collectez le filtrat dans un tube à centrifuger propre de 50 millilitres. Transférez le filtrat dans un nouveau tube à centrifuger de 15 millilitres et centrifugez-le à 300 G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Jetez ensuite le surnageant à l’aide d’une pipette d’un millilitre. Maintenant, pipetez la suspension cellulaire de haut en bas 20 fois avec 15 millilitres de HBSS pour la laver et centrifugez-la à 300 G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Après avoir jeté le surnageant, remettez la pastille en suspension dans un millilitre de tampon de tri cellulaire activé magnétiquement. Pour commencer, transférez un millilitre de la suspension unicellulaire préparée dans un tube de microcentrifugation de deux millilitres et centrifugez à 300 G pendant trois minutes à quatre degrés Celsius. Une fois le surnageant retiré, remettez en suspension la pastille unicellulaire dans 90 microlitres de tri cellulaire activé magnétiquement ou de tampon max. Ajoutez 10 microlitres de microbilles CD11b ou c et incubez la suspension à quatre degrés Celsius pendant 15 minutes sur un agitateur horizontal. Ajoutez ensuite un millilitre de tampon max directement dans le tube pour laver la suspension unicellulaire. Après la centrifugation, remettre en suspension la pastille de cellule dans 500 microlitres de tampon max. À l’aide d’une pipette d’un millilitre, transférez la suspension cellulaire remise en suspension dans la colonne de tri dans le champ magnétique. Tant qu’il reste dans le champ magnétique, lavez la colonne trois fois avec 500 microlitres de tampon maximum. Retirez ensuite la colonne de tri du champ magnétique. Ajoutez un millilitre de tampon maximum à la colonne et poussez-le lentement à travers avec le piston. Collectez le flux. Maintenant, ensemencez les cellules sélectionnées dans une plaque à 24 puits contenant une lamelle recouverte de Poly-L-lysine. Ajoutez 200 microlitres de milieu de culture et incubez pendant 20 minutes dans un incubateur à 37 degrés Celsius avec 95 % d’oxygène, 5 % de dioxyde de carbone et 60 à 80 % d’humidité. Pour commencer, prenez la microglie cultivée isolée du tissu cérébral de souris. Localisez la microglie sphérique au microscope à l’eau à l’aide de l’objectif 40x. Ensuite, remplissez l’électrode avec une solution intracellulaire et fixez-la à l’étage de tête de l’amplificateur de l’installation d’électrophysiologie. Appliquez une pression positive. Passez à l’objectif 4x et localisez l’électrode. Abaissez ensuite l’électrode dans la solution du bain. Réglez l’amplificateur en mode pince de tension pour effectuer le test de membrane en mode bain. Après cela, revenez à l’objectif 40x et rapprochez la pointe de l’électrode de la microglie. Ensuite, appliquez une petite pression négative pour maintenir la cellule. Lorsque la résistance atteint 100 mégaohms, passez du mode bain au mode patch dans le test membranaire. Lorsque la résistance atteint 300 mégaohms, relâchez la pression négative. Lorsque la résistance indique la formation d’un joint giga-ohm entre l’électrode et la membrane microgliale. Passez du mode patch au mode cellule dans le test membranaire. Appliquez ensuite une petite quantité d’aspiration et déclenchez un choc électrique pour rompre la membrane. Après cela, passez en mode pince de tension, ouvrez le programme d’enregistrement et enregistrez les courants de potassium pendant 200 millisecondes.