Identification et quantification des métabolites dérangés chez les patients gravement malades à l’aide de la métabolomique basée sur la RMN

Notre recherche utilise la métabolomique basée sur la RMN pour identifier les métabolites dérégulés et les voies biochimiques qui sont modifiés chez les patients gravement malades en soins intensifs, et nous avons également inclus des patients atteints de SDRA, qui est une maladie pulmonaire grave. En profilant et en comparant les signatures métaboliques, nous visons à découvrir les perturbations biochimiques liées à la progression de la maladie et à personnaliser les traitements pour améliorer les résultats. En fait, nous essayons de combler le manque de compréhension de la dysrégulation métabolique chez toutes les catégories de patients atteints de SDRA, ce qui comprend les patients atteints de SDRA léger, modéré et sévère.

Améliorer nos connaissances, pour une meilleure compréhension de la maladie, de sa progression, dans le but global d’améliorer l’état de suite du patient en fournissant une médecine de précision et personnalisée. La RMN facilite la préparation des échantillons, préservant l’intégrité du sérum pour la réanalyse et la détection des métabolites connus et inconnus sans dérivation chimique. Il fournit des données quantitatives reproductibles, garantissant une mesure fiable des métabolites.

Contrairement aux approches ciblées, la RMN permet une exploration sensible et impartiale des changements métaboliques, ce qui la rend idéale pour découvrir les signatures et les voies de progression de la maladie. Notre découverte améliorera la recherche sur le SDRA en découvrant des changements métaboliques à différents stades, qui sont sous-étudiés. À l’aide de la métabolomique basée sur la RMN, nous visons à identifier les métabolites et les voies dérégulés, conduisant à des signatures potentielles pour un diagnostic précoce, un pronostic, une prédiction et des traitements plus précoces.

Cette approche fait progresser la prise en charge personnalisée et approfondit les connaissances en matière de profilage métabolique multi-états. Nos résultats ont ouvert la voie à de nouvelles questions scientifiques, telles que : Comment des métabolites spécifiques identifiés à différents stades du SDRA influencent-ils la progression de la maladie ? Ces voies dérégulées peuvent-elles être ciblées pour des interventions thérapeutiques précoces ?

De plus, comment ces changements métaboliques varient-ils entre d’autres affections respiratoires ou inflammatoires ? Pour commencer, à l’aide d’une aiguille stérile, prélevez deux millilitres de sang dans les artères d’un patient diagnostiqué avec un syndrome de détresse respiratoire aiguë léger ou modéré ou un SDRA. Transférez le sang dans un flacon stérile et laissez-le coaguler pendant 30 minutes à température ambiante.

Centrifugez le sang coagulé à 3,100 G pendant 15 minutes pour séparer le sérum. Transférez le sérum dans des tubes de microcentrifugation stériles, en faisant des aliquotes de 400 à 500 microlitres. Étiquetez les tubes avec les coordonnées du patient et rangez-les à 80 degrés Celsius.

Pour les expériences RMN, mélanger 250 microlitres de l’aliquote sérique avec 250 microlitres de tampon phosphate salin pour minimiser la variation du pH. Agitez le mélange pendant environ 15 secondes pour assurer un mélange homogène. Transvaser l’échantillon préparé dans un tube RMN propre muni d’un insert coaxial contenant du TSP à une concentration de 0,05 millimolaire.

Ensuite, placez le tube RMN dans l’aimant. Tapez WRPA et sélectionnez le numéro d’expérience approprié pour configurer une expérience de protons avec le programme d’impulsions CPMG. Cliquez sur l’option Titre pour entrer le nom du patient et d’autres détails nécessaires.

Tapez lock et appuyez sur Entrée pour verrouiller le champ magnétique. Ensuite, sélectionnez les options 90 % d’eau et 10 % d’oxyde de deutérium. Ensuite, tapez ATMM et appuyez sur Entrée pour effectuer le réglage et la correspondance de la sonde.

Ensuite, dans l’option Paramètres d’acquisition, sélectionnez les paramètres 64 000 points sur 128 balayages pour collecter les données d’optimisation. Réglez le délai de relaxation de cinq secondes, une largeur de balayage spectral de 12 PPM et un temps d’écho de 200 microsecondes, répété 300 fois. Appliquez un élargissement de ligne de 0,3 hertz à l’aide d’une fonction de fenêtre exponentielle.

Ensuite, à l’aide des outils de traitement et d’analyse RMN, acquérez les spectres RMN. Une fois les spectres finaux obtenus, tapez APK et ABSN pour effectuer respectivement la correction de phase et la correction de base. Ensuite, cliquez sur l’option Calibrer l’axe dans le panneau supérieur et calibrez le pic TSP à 0 PPM, automatiquement ou manuellement.

Enfin, transférez les données acquises du système RMN vers le poste de travail pour une analyse plus approfondie. Après avoir acquis les spectres RMN de patients diagnostiqués avec un SDRA léger ou modéré, ouvrez un logiciel de quantification des métabolites RMN pour le traitement des données. Pour effectuer une correction manuelle de la ligne de base à l’aide de la méthode Whitaker, ouvrez le fichier spectral dans le module processeur du logiciel de quantification des métabolites RMN.

Sélectionnez la correction de la ligne de base, puis choisissez la méthode Whitaker. Placez des points à la base des pics dans l’ensemble du spectre. Une fois l’opération terminée, enregistrez les fichiers spectraux corrigés de la ligne de base dans un seul dossier.

Ensuite, pour effectuer le regroupement spectral à l’aide du module Profiler, sélectionnez Outils, puis Traitement par lots, puis Regroupement spectral. Pour générer la feuille de regroupement finale pour l’analyse statistique, sélectionnez le dossier contenant tous les fichiers spectraux corrigés par la ligne de base. Divisez les spectres en compartiments de taille égale avec une largeur spectrale définie allant de 0,01 à 0,04 partie par million.

Spécifiez la taille du compartiment et les valeurs PPM de début et de fin. Choisissez un dossier pour enregistrer les feuilles de regroupement de sortie. Exclure les régions de décalage chimique correspondant à l’eau et au solvant TSP pour éviter les interférences spectrales.

La feuille de calcul finale affichera les noms d’échantillons sur une ligne et les valeurs de groupe avec les PPM correspondants sur d’autres lignes. Avant d’effectuer une analyse statistique, normalisez les données à l’aide de la normalisation, de la transformation logarithmique et de la mise à l’échelle de Pareto. Pour l’analyse multivariée, effectuez l’analyse en composantes principales, l’analyse discriminante partielle des moindres carrés et l’analyse discriminante orthogonale partielle des moindres carrés pour observer la discrimination entre les groupes, ce qui permet d’obtenir des scores de projection d’importance variable pour chaque métabolite responsable de la différence dans le profil métabolique.

Effectuer le test t de Student pour identifier les métabolites significatifs ayant une valeur p inférieure à 0,05. Les tests T produisent des diagrammes à moustaches montrant des différences dans les concentrations de métabolites. Ensuite, effectuez une analyse de biomarqueurs pour générer une aire sous le graphique de la courbe caractéristique de fonctionnement du récepteur.

Sélectionnez la liste finale des métabolites significatifs en fonction d’une importance variable d’un score de projection supérieur à un, d’une valeur p corrigée de Bonferroni inférieure à 0,05 et d’une aire sous la courbe supérieure à 0,8. À l’aide de la base de données sur le métabolome humain, identifiez les métabolites correspondant à des valeurs spécifiques de PPM. Avant de commencer la quantification, à l’aide du module processeur, calibrez le composé de référence sélectionné pour l’étude.

Cliquez sur l’option Calibrer l’indicateur de décalage chimique et entrez la concentration du composé de référence. Faites glisser le pic logiciel sur le pic de référence spectrale et ajustez sa hauteur et sa largeur. Une fois que les pics de référence spectrale s’alignent sur le pic du logiciel, cliquez sur Accepter.

Ensuite, ouvrez les spectres souhaités dans le module Profiler et sélectionnez la bibliothèque de composés appropriée pour l’étude. En bas de l’écran, une liste de métabolites s’affichera. Sélectionnez le métabolite d’intérêt dans la liste.

Cliquez sur la valeur PPM dans le coin supérieur de l’écran. Zoomez sur les spectres à l’échelle PPM spécifique du métabolite. À ce stade, deux pics apparaissent à l’écran, l’un représentant les données enregistrées et l’autre, représenté par une ligne pointillée, représentant le pic du logiciel.

Faites glisser le pic logiciel pour l’aligner sur le pic enregistré, en ajustant la hauteur et la position en conséquence. Une fois les pics correctement alignés, lire la concentration du métabolite à partir de la valeur affichée sous la rubrique Concentration en millimolaires. Pour générer le fichier de sortie, sous le menu Outils, cliquez sur l’option Opérations par lots et spécifiez le dossier souhaité pour l’enregistrement du fichier de sortie.

L’analyse en composantes principales a montré un regroupement distinct entre les groupes de patients atteints de SDRA léger et modéré. L’analyse discriminante orthogonale des moindres carrés partiels a révélé une séparation claire entre les groupes de SDRA léger et modéré, mettant l’accent sur les différences métaboliques. Le test t de Student et l’analyse des biomarqueurs ont révélé des métabolites déréglés clés entre le SDRA léger et modéré.

Le lactate et l’isoleucine ont été identifiés comme des métabolites significativement dérégulés corrélés à la gravité du SDRA.