Dévoilement des protéoformes d’histones à l’aide de l’électrophorèse sur gel 2D-TAU

Nos efforts se concentrent actuellement sur une meilleure caractérisation de la corrélation existante entre les changements épigénétiques et le recâblage métabolique, dans le but ultime d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques épigénétiques. Compte tenu de la nature dynamique et réversible de la modification épigénétique, récemment, plusieurs agents épi-médicamenteux ont été développés, conduisant à l’amélioration du traitement du cancer et à la réduction de la résistance à la chimiothérapie. Récemment, des progrès significatifs ont été réalisés dans le domaine de la caractérisation des instances, grâce à l’application de la spectométrie de masse moderne, couplée aux techniques de séparation, telles que la page supérieure ou la chromatographie liquide à haute performance.

Le principal défi de la caractérisation des histones est l’existence d’innombrables protéoformes d’histones, résultant de l’interaction entre les enzymes modifiées dynamiques et la disponibilité des métabolites. Commencez par préparer un mini gel TAU pour un mini gel vertical de polyacrylamide, système d’électrophorèse. Pour ce faire, dissolvez six molaires d’urée dans une solution de bis-acrylamide à 15 % et un millilitre d’eau ultrapure sous une légère agitation à température ambiante.

Ajoutez ensuite les autres composants et ajustez le volume. Remplissez les plaques de gel prédéfinies avec cette solution, en veillant à ce qu’aucune bulle d’air ne se forme et en laissant 1,5 centimètre du haut. Ajoutez un millilitre d’isopropanol sur le dessus pour niveler le gel.

Pour préparer la dissolution du gel d’empilement, dissolvez l’urée dans un acrylamide à 6 %, du bis-acrylamide avec un millilitre d’eau ultra-pure. Après avoir ajouté les autres composants, remplissez les plaques de gel avec cette solution et insérez un peigne à 10 puits entre les plaques jusqu’à ce que la solution atteigne la moitié des dents du peigne. Ensuite, dissolvez six molaires d’urée, 5 % d’acide acétique glacial et de l’eau distillée deux fois pour préparer 100 microlitres de tampon d’échantillon TAU.

Dissoudre ensuite l’échantillon d’histones lyophilisé dans 30 microlitres de tampon d’échantillon TAU. Remplissez la mini-cassette avec un tampon de coulage TAU avec une concentration finale de 5 % d’acide acétique. À l’aide d’une seringue, rincez les puits du gel avec un tampon coulant et chargez l’échantillon dans les puits à l’aide d’une micro-pipette.

Connectez ensuite la chambre d’électrophorèse à l’alimentation électrique, en plaçant l’électrode positive au fond. De temps en temps, coupez l’alimentation électrique et rincez les puits de gel avec une seringue pour éliminer les bulles de la surface inférieure du gel. Après avoir retiré le gel des plaques de gel, coupez la bande d’intérêt à l’aide d’un scalpel propre.

Lavez maintenant la voie de gel avec 15 millilitres de chlorhydrate de tris 0,5 M, pH 8,8 pendant 15 minutes. Préparez 15 millilitres de tampons d’équilibrage un et deux, en utilisant les composants illustrés ici. Stockez ensuite le tampon d’équilibrage deux dans l’obscurité.

Maintenant, incubez la voie de gel dans 10 millilitres de tampon d’équilibre, un avec une agitation douce pendant 15 minutes, puis décantez. Après cela, incubez la voie de gel dans 10 millilitres de tampon d’équilibrage deux sous une légère agitation pendant 15 minutes dans l’obscurité avant de la transvaser. Ensuite, préparez un gel résolvant à 15 % d’acrylamide, en utilisant la composition indiquée ici.

Installez la plaque de gel et remplissez-la avec la solution de gel de résolution, en laissant 1,5 centimètre de l’extrémité de la longue plaque de gel. Ajoutez un millilitre d’isopropanol sur le dessus pour niveler le gel et lui permettre de polymériser. Une fois le gel polymérisé, décantez l’isopropanol et séchez bien le puits à l’aide d’un papier de chromatographie cellulosique de trois mm.

Insérez la voie de gel coupée dans le puits de gel de résolution, à l’aide d’une pince à épiler pour éviter les bulles d’air, puis scellez la voie de gel au gel de résolution, en utilisant de l’agarose à faible point de fusion de 0,5 % dans de la tris glycine et un tampon SDS, avec cinq microlitres de 0,003 % de bleu de bromophénol. Placez les plaques de gel dans la cassette et remplissez-les de triglycine et de tampon SDS. Faites fonctionner le gel à 120 volts jusqu’à ce que le colorant bleu de bromophénol atteigne le fond.

Après avoir couru, retirez délicatement le gel des plaques et jetez l’excès d’agarose. Pour commencer, effectuez une électrophorèse de l’urée triton-acide sur gel 2D, ou TAU sur des échantillons d’histones, suivie d’une coloration à l’argent. Préparez ensuite les réactifs présentés ici.

À l’aide d’un scalpel propre, excisez les points d’intérêt des histones du gel coloré et placez chaque point dans un tube de silicone frais de 1,5 millilitre pour éviter la contamination croisée des isoformes. Ajoutez 250 microlitres de bicarbonate d’ammonium de 50 millimolaires, ou 50 % d’acétone nitro à chaque point de gel et incubez sous une légère agitation dans un mélangeur thermique à température ambiante. Décantez la solution et répétez ce processus trois fois jusqu’à ce que les morceaux de gel apparaissent transparents.

Pour déshydrater les taches de gel, ajoutez 200 microlitres d’acétone nitrol. Au cours de cette étape, les morceaux de gel deviendront blancs opaques. Décantez l’acétone nitrile et laissez les taches de gel sécher à l’air libre pendant 10 minutes.

Les morceaux de gel apparaîtront secs dans les tubes. Ensuite, réhydratez les taches de gel en ajoutant 20 microlitres de solution de trypsine ou un volume suffisant pour couvrir les morceaux de gel. Incuber les tubes dans un mélangeur thermique à 37 degrés Celsius sous une légère agitation pendant au moins quatre heures et jusqu’à 16 heures.

Transférez le surnageant, contenant les peptides du triptyque, dans un tube frais. Ajoutez 50 microlitres de solution d’extraction aux morceaux de gel et sonicate deux fois dans un bain-marie à ultrasons pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Transférez le surnageant, contenant les peptides triptyques supplémentaires, dans le même tube frais.

À l’aide d’un lyophilisateur, vous pourrez sécher les peptides extraits à 30 degrés Celsius. Une pastille lyophilisée se formera dans le tube. Maintenant, ajoutez 15 microlitres d’acide trifluoroacétique à 0,1 % dans chaque tube et incubez doucement dans un mélangeur thermique à 25 degrés Celsius.

Transférer le surnageant dans un flacon pour l’analyse par chromatographie liquide en tandem et spectrométrie de masse.