Name: Dévoilement des protéoformes d’histones à l’aide de l’électrophorèse sur gel 2D-TAU (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-18T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 20 s
Description: Découvrez la caractérisation des protéoformes d'histones par électrophorèse 2D-TAU et spectrométrie de masse. Cette méthode permet d'identifier de nouvelles cibles thérapeutiques épigénétiques pour le traitement du cancer.

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<meta charset="utf8"></head><body>Séparation de gel 2D pour l’enrichissement en isoformes d’histones et la caractérisation PTM

<ol><li>Strahl, B. D., Allis, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+language+of+covalent+histone+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The language of covalent histone modifications.</a> Nature. 403 (6765), 41-45 (2000).</li>
<li>Cutter, A. R., Hayes, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+brief+review+of+nucleosome+structure%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">A brief review of nucleosome structure.</a> FEBS Lett. 589 (20 Pt A), 2914-2922 (2015).</li>
<li>Millán-Zambrano, G., Burton, A., Bannister, A. J., Schneider, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+post-translational+modifications+-+cause+and+consequence+of+genome+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Histone post-translational modifications - cause and consequence of genome function.</a> Nat Rev Genet. 23 (9), 563-580 (2022).</li>
<li>Sun, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+reprogramming+and+epigenetic+modifications+on+the+path+to+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Cell%22%5BJournal%5D)">Metabolic reprogramming and epigenetic modifications on the path to cancer.</a> Protein Cell. 13 (12), 877-919 (2022).</li>
<li>Kinnaird, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+control+of+epigenetics+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Metabolic control of epigenetics in cancer.</a> Nat Rev Cancer. 16 (11), 694-707 (2016).</li>
<li>Díaz-Hirashi, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+reprogramming+and+signaling+to+chromatin+modifications+in+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Exp+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Metabolic reprogramming and signaling to chromatin modifications in tumorigenesis.</a> Adv Exp Med Biol. 1219, 225-241 (2020).</li>
<li>Panatta, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+regulation+by+p53+prevents+R-loop-associated+genomic+instability%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Metabolic regulation by p53 prevents R-loop-associated genomic instability.</a> Cell Rep. 41 (5), 111568(2022).</li>
<li>Scumaci, D., Zheng, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+meets+metabolism%3A+novel+vulnerabilities+to+fight+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Commun+Signal%22%5BJournal%5D)">Epigenetic meets metabolism: novel vulnerabilities to fight cancer.</a> Cell Commun Signal. 21 (1), 249(2023).</li>
<li>Chiaradonna, F., Scumaci, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+metabolism+as+a+new+real+target+in+tumor+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Cancer metabolism as a new real target in tumor therapy.</a> Cells. 10 (6), 1393(2021).</li>
<li>Scumaci, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DJ-1+proteoforms+in+breast+cancer+cells%3A+The+escape+of+metabolic+epigenetic+misregulation%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">DJ-1 proteoforms in breast cancer cells: The escape of metabolic epigenetic misregulation.</a> Cells. 9 (9), 1968(2020).</li>
<li>Olivo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Moving+beyond+the+tip+of+the+iceberg%3A+DJ-1+implications+in+cancer+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Moving beyond the tip of the iceberg: DJ-1 implications in cancer metabolism.</a> Cells. 11 (9), 1432(2022).</li>
<li>Zheng, Q., Maksimovic, I., Upad, A., David, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-enzymatic+covalent+modifications%3A+a+new+link+between+metabolism+and+epigenetics%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Cell%22%5BJournal%5D)">Non-enzymatic covalent modifications: a new link between metabolism and epigenetics.</a> Protein Cell. 11 (6), 401-416 (2020).</li>
<li>Maksimovic, I., David, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-enzymatic+covalent+modifications+as+a+new+chapter+in+the+histone+code%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem+Sci%22%5BJournal%5D)">Non-enzymatic covalent modifications as a new chapter in the histone code.</a> Trends Biochem Sci. 46 (9), 718-730 (2021).</li>
<li>Lowe, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+H3+mutations%3A+an+updated+view+of+their+role+in+chromatin+deregulation+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Histone H3 mutations: an updated view of their role in chromatin deregulation and cancer.</a> Cancers. 11 (5), 660(2019).</li>
<li>Karsli-Ceppioglu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+epigenetic+landscape+of+promoter+genome-wide+analysis+in+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">The epigenetic landscape of promoter genome-wide analysis in breast cancer.</a> Sci Rep. 7 (1), 6597(2017).</li>
<li>Yang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+methyltransferase+and+drug+resistance+in+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Histone methyltransferase and drug resistance in cancers.</a> J Exp Clin Cancer Res. 39 (1), 173(2020).</li>
<li>Vardabasso, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+variants%3A+emerging+players+in+cancer+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Histone variants: emerging players in cancer biology.</a> Cell Mol Life Sci. 71 (3), 379-404 (2014).</li>
<li>Ilango, S., Paital, B., Jayachandran, P., Padma, P. R., Nirmaladevi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+alterations+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Biosci%22%5BJournal%5D)">Epigenetic alterations in cancer.</a> Front Biosci. 25 (6), 1058-1109 (2020).</li>
<li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+H2AX+promotes+metastatic+progression+by+preserving+glycolysis+via+hexokinase-2%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Histone H2AX promotes metastatic progression by preserving glycolysis via hexokinase-2.</a> Sci Rep. 12 (1), 3758(2022).</li>
<li>Nowsheen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ZNF506-dependent+positive+feedback+loop+regulates+H2AX+signaling+after+DNA+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">ZNF506-dependent positive feedback loop regulates H2AX signaling after DNA damage.</a> Nat Commun. 9 (1), 2736(2018).</li>
<li>Ribeiro-Silva, C., Vermeulen, W., Lans, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SWI%2FSNF%3A+Complex+complexes+in+genome+stability+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Repair%22%5BJournal%5D)">SWI/SNF: Complex complexes in genome stability and cancer.</a> DNA Repair. 77, 87-95 (2019).</li>
<li>Yang, Y., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+epigenetic+regulation+in+plasticity+of+tumor+immune+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Role of epigenetic regulation in plasticity of tumor immune microenvironment.</a> Front Immunol. 12, 640369(2021).</li>
<li>Miranda Furtado, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidrugs%3A+targeting+epigenetic+marks+in+cancer+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenetics%22%5BJournal%5D)">Epidrugs: targeting epigenetic marks in cancer treatment.</a> Epigenetics. 14 (12), 1164-1176 (2019).</li>
<li>Thomas, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+guide+for+analysis+of+histone+post-translational+modifications+by+mass+spectrometry%3A+best+practices+and+pitfalls%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">A practical guide for analysis of histone post-translational modifications by mass spectrometry: best practices and pitfalls.</a> Methods. 184, 53-60 (2020).</li>
<li>Noberini, R., Robusti, G., Bonaldi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry-based+characterization+of+histones+in+clinical+samples%3A+applications%2C+progress%2C+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+J%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry-based characterization of histones in clinical samples: applications, progress, and challenges.</a> FEBS J. 289 (5), 1191-1213 (2022).</li>
<li>Kwak, H. G., Dohmae, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+characterization+of+histone+variants+in+the+mouse+testis+by+mass+spectrometry-based+top-down+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Biosci+Trends%22%5BJournal%5D)">Proteomic characterization of histone variants in the mouse testis by mass spectrometry-based top-down analysis.</a> Biosci Trends. 10, 357-364 (2016).</li>
<li>Sidoli, S., Simithy, J., Karch, K. R., Kulej, K., Garcia, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+resolution+data-independent+acquisition+in+an+LTQ-Orbitrap+allows+for+simplified+and+fully+untargeted+analysis+of+histone+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Low resolution data-independent acquisition in an LTQ-Orbitrap allows for simplified and fully untargeted analysis of histone modifications.</a> Anal Chem. 87, 11448-11454 (2015).</li>
<li>Shechter, D., Dormann, H. L., Allis, C. D., Hake, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extraction%2C+purification+and+analysis+of+histones%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Extraction, purification and analysis of histones.</a> Nat Protoc. 2 (6), 1445-1457 (2007).</li>
<li>Basak, S. K., Ladisch, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlation+of+electrophoretic+mobilities+of+proteins+and+peptides+with+their+physicochemical+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Correlation of electrophoretic mobilities of proteins and peptides with their physicochemical properties.</a> Anal Biochem. 226 (1), 51-58 (1995).</li>
<li>Nuccio, A. G., Bui, M., Dalal, Y., Nita-Lazar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry-based+methodology+for+identification+of+native+histone+variant+modifications+from+mammalian+tissues+and+solid+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry-based methodology for identification of native histone variant modifications from mammalian tissues and solid tumors.</a> Methods Enzymol. 586, 275-290 (2017).</li>
<li>Zhang, S., Roche, K., Nasheuer, H. P., Lowndes, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modification+of+histones+by+sugar+%CE%B2-N-acetylglucosamine+%28GlcNAc%29+occurs+on+multiple+residues%2C+including+histone+H3+serine+10%2C+and+is+cell+cycle-regulated%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Modification of histones by sugar β-N-acetylglucosamine (GlcNAc) occurs on multiple residues, including histone H3 serine 10, and is cell cycle-regulated.</a> J Biol Chem. 286 (43), 37483-37495 (2011).</li>
<li>Perri, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+proteomics+reveals+novel+post-translational+modifications+in+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Aging%22%5BJournal%5D)">Histone proteomics reveals novel post-translational modifications in breast cancer.</a> Aging. 11, 11722-11755 (2019).</li>
<li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).</li>
<li>Omenn, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Research+on+the+human+proteome+reaches+a+major+milestone%3A+%3E90%25+of+predicted+human+proteins+now+credibly+detected%2C+according+to+the+HUPO+human+proteome+project%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Research on the human proteome reaches a major milestone: >90% of predicted human proteins now credibly detected, according to the HUPO human proteome project.</a> J Proteome Res. 19 (12), 4735-4746 (2020).</li>
<li>Noberini, R., Robusti, G., Bonaldi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry-based+characterization+of+histones+in+clinical+samples%3A+applications%2C+progress%2C+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+J%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry-based characterization of histones in clinical samples: applications, progress, and challenges.</a> FEBS J. 289 (5), 1191-1213 (2022).</li>
<li>Starkova, T. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+profile+of+post-translational+modifications+of+histone+H1+in+chromatin+of+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Naturae%22%5BJournal%5D)">The profile of post-translational modifications of histone H1 in chromatin of mouse embryonic stem cells.</a> Acta Naturae. 11 (2), 82-91 (2019).</li>
<li>García-Giménez, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+carbonylation+occurs+in+proliferating+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Histone carbonylation occurs in proliferating cells.</a> Free Radic Biol Med. 52 (8), 1453-1464 (2012).</li>
<li>García-Saura, A. G., Schüler, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PARP10+multi-site+auto-+and+histone+MARylation+visualized+by+acid-urea+gel+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">PARP10 multi-site auto- and histone MARylation visualized by acid-urea gel electrophoresis.</a> Cells. 10, 654(2021).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>1,4-Dithioérythritol</td><td>SIGMA- ALDRICH</td><td>D8255&nbsp ;</td><td>Réactif pour l’entretien &minus ; les groupes SH à l’état réduit ; réduit quantitativement les disulfures.</td></tr><tr><td>1,5 M Tampon Tris-HCL, pH 8,8</td><td>BIO-RAD</td><td>161-0798</td><td>Gel résolvant Tampon</td></tr><tr><td>10x Tris/Glycine/SDS&nbsp ;</td><td>BIO-RAD&nbsp ;</td><td>1610772</td><td>Utilisez ce tampon de course Tris/glycine/SDS prémélangé 10x pour séparer les échantillons de protéines par SDS-PAGE.</td></tr><tr><td>2-Propanol</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>33539</td><td>Le 2-Propanol (Isopropanol) est un alcool secondaire. Il a été testé comme substitut du carburant pour une utilisation dans diverses piles à combustible. La poudre de CuO dissoute dans du 2-propanol a été utilisée pour la synthèse assistée par ablation laser de colloïdes de Cu. La suspension de 2-propanol avec du Zn(NO3)2 a été utilisée pour la fabrication de photoanode en acier inoxydable revêtue de dioxyde de titane (P25-TiO2/SS) recouverte d’une couche uniformément épaisse de P25-TiO2.Cette photoanode a été utilisée pour le processus de dégradation photocatalytique électrochimique (ECPC).</td></tr><tr><td>30 % Acrylamide/Bis Solution&nbsp ;</td><td>BIO-RAD</td><td>1610158</td><td>2,6 % de réticulant. Réactif de pureté d’électrophorèse&nbsp ;</td></tr><tr><td>Acide acétique Glacial</td><td>Carlo Erba Reagennts</td><td>401392</td><td>L’acide acétique est un réactif chimique important avec de nombreuses applications industrielles.</td></tr><tr><td>Acétone</td><td>Panreac Applichem</td><td>211007.1214</td><td>Acétone&nbsp ; est un solvant, réputé pour sa polyvalence dans diverses applications de laboratoire, de fabrication et de nettoyage.</td></tr><tr><td>Acétonitile</td><td>VWR</td><td>83640320</td><td>pour HPLC&nbsp ; &nbsp ; Agarose de qualité LC-MS</td></tr><tr><td></td><td>Invitrogen</td><td>15510-027</td><td>Agarose&nbsp ; est a&nbsp ; hétéropolysaccharide&nbsp ; Fréquemment utilisé en biologie moléculaire.</td></tr><tr><td>Bicarbonate d’ammonium</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>A6141</td><td>minimum 99,0 %</td></tr> <tr><td>Persulfate d’ammonium</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>A3678</td><td>Pour la biologie moléculaire, Pour l’électrophorèse, &ge ; 98 %&nbsp ;</td></tr><tr><td>Bioruptor plus</td><td>Diagenode</td><td>B01020001 - B01020002- B01020003</td><td>sonicateur</td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>SIGMA- ALDRICH</td><td>D9163-5G</td><td>Agent réducteur utilisé pour réduire les liaisons disulfure dans les protéines.</td></tr><tr><td>Kit de teinture à l’argent Dodeca&nbsp ;</td><td>BIO-RAD</td><td>161-0480</td><td>Le kit de coloration à l’argent Dodeca est facile à utiliser pour la détection des niveaux non agrammiques de protéines dans les gels de polyacrylamide.</td></tr><tr><td>Glycérol</td><td>GE - Soins de santé Sciences de la vie</td><td>171325010L</td><td>Le glycérol est un composé triol simple, il est impliqué pour aider à la coulée des gels de gradient, stabilisateur de protéines et composant tampon de stockage.</td></tr><tr><td>Inhibiteur de la phosphatase Stop&nbsp ;</td><td>Thermo SCIENTIFIC</td><td>78428</td><td>Le cocktail d’inhibiteurs de la phosphatase Thermo Scientific Halt préserve l’état de phosphorylation des protéines pendant et après la lyse cellulaire ou l’extraction des protéines tissulaires&nbsp ; Cocktail à usage unique (100X).&nbsp ; &nbsp ;</td></tr><tr><td>Inhibiteur de la protéase Stop&nbsp ;</td><td>Thermo SCIENTIFIC</td><td>78430</td><td>Thermo Scientific Halt Protease Inhibitor Cocktail (100X) sont des solutions mères concentrées prêtes à l’emploi d’inhibiteurs de protéase à ajouter aux échantillons pour prévenir la dégradation protéolytique lors de la lyse cellulaire et de l’extraction des protéines. Cocktail à usage unique (100X).&nbsp ; &nbsp ;</td></tr><tr><td>Acide chlorhydrique</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>H1758</td><td>BioRéactif, pour la biologie moléculaire</td></tr><tr><td>Iodoacétamide</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>I6125</td><td>&ge ; 99 % (RMN), cristall</td></tr><tr><td>KCl</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>P9541</td><td>Chlorure de potassium, KCl, est&nbsp ; Généralement utilisé dans les routines de laboratoire. Son utilisation comme tampon de stockage pour les électrodes de pH et comme solution de référence pour les mesures de conductivité est bien établie.</td></tr><tr><td>Lignée cellulaire MCF10</td><td>ATCC</td><td>CRL-10317&nbsp ;</td><td>lignée cellulaire épithéliale isolée en 1984 à partir de la glande mammaire d’une femme blanche de 36 ans aux seins fibrokystiques. Cette lignée cellulaire a été déposée par la Michigan Cancer Foundation.</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>208337</td><td>Le chlorure de magnésium est un solide cristallin incolore.</td></tr><tr><td>N,N,N',N'-Tétraméthyléthylène-diamine</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>T9281</td><td>Pour l’électrophorèse, environ 99</td></tr> % <tr><td>Tampon salin phosphaté 1X</td><td>Corning</td><td>15373631</td><td>1 X PBS (solution saline tamponnée au phosphate) est&nbsp ; un tampon&nbsp ; solution saline équilibrée&nbsp ; Utilisé pour diverses applications biologiques et de culture cellulaire, telles que le lavage des cellules avant la dissociation, le transport de cellules ou de tissus, la dilution de cellules pour le comptage et la préparation de réactifs.</td></tr><tr><td>Hexacyanoferrate de potassium</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>60299</td><td>Accepteur d’électrons, utilisé dans les systèmes impliquant le transport d’électrons,</td></tr> <tr><td>solution SDS 20 % (p/v)&nbsp ;</td><td>BIO-RAD</td><td>161-0418</td><td>Dodécylsulfate de sodium. Réactif de pureté d’électrophorèse&nbsp ;</td></tr><tr><td>Thiosulfate de sodium, ReagentPlus 99 %</td> <td>SIGMA- ALDRICH</td><td>21,726-3</td><td>Thiosulfate de sodium, ReagentPlus 99</td></tr><tr><td> % Acide sulfurique</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>339741</td><td>Acide sulfurique, réactif, est&nbsp ; Un acide extrêmement corrosif qui se présente sous la forme d’un liquide jaunâtre légèrement visqueux. Il est soluble dans l’eau et est un acide diprotique. Il a de très fortes propriétés corrosives, déshydratantes et oxydantes en plus d’être hygroscopique.</td></tr><tr><td>Acide trichloracétique</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>T6399-5G</td><td>L’acide trichloracétique (TCA) est&nbsp ; Utilisé comme réactif pour la précipitation des protéines 1,2 et des acides nucléiques 3.&nbsp ;</td></tr><tr><td>Acide trifluoroacétique</td><td>Riedel-de Ha&euml ; n</td><td>34957</td><td>Acide trifluoroacétique</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>SIGMA- ALDRICH</td><td>T9284-1L</td><td>Triton X-100 est un tensioactif polyoxyéthylène non ionique qui est le plus fréquemment utilisé pour extraire et solubiliser les protéines.</td></tr><tr><td>Trypsine du pancréas porcin</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>T6567</td><td>Qualité protéomique, BioRéactif, Urée diméthylée</td></tr><tr><td></td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>33247</td><td>L’urée est un agent chaotrope et est utilisée pour la dénaturation des protéines. Il perturbe les liaisons hydrogène dans la structure secondaire, tertiaire et quaternaire des protéines. Il peut également perturber la liaison hydrogène présente dans la structure secondaire de l’ADN</td></tr></tbody></table>

dévoilement des protéoformes d’histones à l’aide de l’électrophorèse sur gel 2d-tau

Unveiling Histone Proteoforms using 2D-TAU Gel Electrophoresis

Sur la figure 1A, il est possible d’observer comment les protéines d’histones migrent dans un gel 1D. Il s’agit d’une étape préliminaire importante pour comprendre le temps de fonctionnement de la première dimension. Une fois que le bon moment de séparation est déterminé, exécutez la deuxième dimension. La carte 2D des protéoformes d’histones montre un motif topographique distinctif (Figure 1B). Chaque point de la figure 1B représente un type d’histone spécifique. Observez la région exacte du gel où se trouve chaque histone protéoforme. L’identification par spectrométrie de masse de chaque histone protéoforme est rapportée dans Perri et al.32. Par conséquent, chaque tache de cette condition est associée à un type d’histones spécifique. La présence de taches supplémentaires, à côté des taches canoniques, peut indiquer l’existence de nouvelles modifications. Les images sur gel peuvent être acquises à l’aide de la densitométrie, et l’image résultante peut être analysée à l’aide d’un logiciel d’analyse d’images.
La fiabilité de la carte TAU 2D dépend de la rotondité du spot. Si la course a été effectuée correctement, les taches apparaîtront comme des signaux distincts et aucune traînée horizontale ou verticale ne sera visible. À l’inverse, les impuretés dans l’échantillon, les solutions et la superposition d’agarose peuvent provoquer des stries et/ou des rayures dans le gel. La qualité du gel aura un impact sur la numérisation de l’image et l’analyse quantitative et qualitative qui s’ensuit. De plus, cela pourrait influencer le succès de l’analyse Western Blot et des investigations sur la SEP. Pour vérifier la fiabilité de la méthode, nous avons sondé la membrane nitrocellulosique des protéoformes d’histones résolues avec l’anticorps primaire Acetylated-Lysine (Ac-K2-100) Rabbit mAb32 (Figure 2). Un anticorps secondaire HRP anti-lapin a été utilisé pour détecter les signaux d’histones. Comme prévu, à l’aide d’un densitomètre, il est possible de quantifier la modification post-traductionnelle particulière sur chaque variante d’histones présente dans le blot.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67321/67321fig01.jpg"> 
Figure 1 : TAUgel 1D et 2D. (A) Image représentative du motif topographique des histones obtenue à l’aide du TAUgel 1D. (B) Image représentative du motif topographique des histones obtenue à l’aide de TAUgel 2D. Les identifications de données sont rapportées par Perri et al. 32. Comme prévu, chaque tache représente une histone protéoforme spécifique. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67321/67321fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67321/67321fig02.jpg"> 
Figure 2 : Transfert Western représentatif du 2DTAU. Sur l’image, il est possible d’observer le niveau d’acétylation de la lysine dans chaque histone protéoforme. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67321/67321fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Réactifs</td>
			<td>Concentration : 15 %</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 % Acrylamide/Bis</td>
			<td>3.75</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,5 M Tris pH 8,8</td>
			<td>2,5 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eau MilliQ</td>
			<td>3,6 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 % FDS</td>
			<td>100 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 % APS</td>
			<td>50 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>5 μL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tableau 1 : Composition de la solution de gel de résolution.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Pas</td>
			<td>Heure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixation 50 % méthanol / 5 % acide acétique</td>
			<td>1 h</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lavage 30 % éthanol</td>
			<td>2 x 20 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laver l’eau déminéralisée</td>
			<td>1 x 20 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Réactif de thiosulfate sensibilisant</td>
			<td>1 minute</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laver l’eau déminéralisée</td>
			<td>3 x 20 s</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Argent Nitrate d’argent</td>
			<td>Durée : 30 minutes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laver l’eau déminéralisée</td>
			<td>3 x 1 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Développeur de développement</td>
			<td>25-30 min Remarque : Développer le gel jusqu’à ce que les taches soient visibles (brun clair)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>solution d’arrêt</td>
			<td>1 x 10 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laver l’eau déminéralisée</td>
			<td>2 x 5 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laver l’eau déminéralisée</td>
			<td>1 h</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tableau 2 : Méthode de coloration à l’argent.

Dévoilement des protéoformes d’histones à l’aide de l’électrophorèse sur gel 2D-TAU

Histones undergo various post-translational modifications (PTMs) such as methylation, acetylation, phosphorylation, acylation, and ubiquitination, which ...

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Dévoilement des protéoformes d’histones à l’aide de l’électrophorèse sur gel 2D-TAU

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