Quantification de la modulation de l’activité de l’enzyme élastase par analyse colorimétrique

Le champ de nos recherches se concentre sur le développement de composés réactifs naturels. Ainsi, à l’aide d’une méthode in vitro, nous visons à évaluer l’activité de l’élastase, une enzyme impliquée dans la dégradation de l’élastine et la perte d’élasticité, afin de restaurer l’homéostasie du tissu. La quantification des extraits naturels de plantes, l’activité, présente plusieurs défis, principalement liés à leur composition chimique complexe et à leur coloration souvent forte qui peut interférer avec les mesures courantes.

Le développement de protocoles adaptatifs fiables est essentiel pour faire avancer ce domaine de recherche. Notre étude offre plusieurs avantages aux domaines, notamment la simplicité, la sensibilité, le résultat rapide de la tension et l’adaptabilité aux différents besoins de recherche. Pour commencer, pesez la quantité appropriée de base Tris à l’aide d’une balance analytique et transférez la base Tris pesée dans un bécher.

À l’aide d’un cylindre gradué, ajoutez de l’eau déminéralisée dans le bécher. Agitez la solution à l’aide d’un agitateur magnétique jusqu’à ce que la base Tris soit complètement dissoute. Ajustez ensuite le pH de la solution à huit en utilisant quatre acides chlorhydriques normaux.

Une fois le pH souhaité atteint, transférez la solution dans une fiole jaugée. À l’aide d’eau déminéralisée, remplissez le ballon jusqu’au volume marqué. Transférez le tampon préparé dans une bouteille de stockage étiquetée et conservez-le à température ambiante.

Pour la préparation des échantillons, pesez avec précision la quantité requise d’échantillon à l’aide d’une balance analytique. Dissoudre l’échantillon dans le tampon de réaction préparé pour obtenir la concentration souhaitée. Utilisez un mélangeur vortex pour dissoudre complètement l’échantillon.

Et conservez l’échantillon préparé sur de la glace. Ensuite, préparez une solution de travail d’enzyme élastase dans un tampon de réaction à une concentration finale de 10 microgrammes par millilitre. Conservez la solution d’élastase sur de la glace jusqu’au moment de l’utiliser.

Préparez maintenant une solution SANA de 0,8 millimolaire dans un tampon de réaction. Protégez la solution de la lumière et conservez-la à quatre degrés Celsius jusqu’à ce qu’elle soit utilisée. Pour le fluorure de phénylméthanesulfonyle, ou stock PMSF, préparez une solution PMSF de 100 millimolaires dans de l’isopropanol.

Conservez la solution préparée sur de la glace. Préparez toutes les réactions en trois exemplaires à l’aide de microtubes à centrifuger. Incuber tous les tubes à température ambiante pendant 20 minutes.

Ajoutez ensuite 100 microlitres de la solution de substrat SANA dans chaque tube, à l’exception des commandes de couleur. Retournez doucement les tubes plusieurs fois pour mélanger les échantillons et transférez 300 microlitres de chaque tube sur une plaque de 96 puits, en assurant des mesures triples pour chaque échantillon. Enfin, placez la plaque à 96 puits dans un lecteur de microplaques réglé à 410 nanomètres, et mesurez l’absorbance périodiquement, toutes les minutes pendant 20 minutes, ou jusqu’à ce que le signal se stabilise à température ambiante.

L’extrait un a montré une activité inhibitrice de l’élastase faible mais significative à des concentrations de un, 0,75 et 0,5 milligramme par millilitre, sans effet significatif à 0,25 milligramme par millilitre. L’extrait deux a démontré une activité inhibitrice élevée de l’élastase à toutes les concentrations testées, avec des niveaux d’inhibition similaires à ceux du témoin positif à un, 0,75 et 0,5 milligramme par millilitre.