Imagerie longitudinale intravitale de la dynamique vasculaire dans la moelle osseuse calvaire

Cette recherche se concentre sur la compréhension de la dynamique vasculaire dans le macroenvironnement de la moelle osseuse à l’aide de la microscopie intravitale, dans le but de révéler comment les vaisseaux sanguins réagissent à l’hématopoïèse normale et pathologique. Nous utilisons des technologies d’imagerie avancées telles que la photomicroscopie, des modèles animaux transgéniques et analysons un traceur pour visualiser et quantifier les changements vasculaires dynamiques dans les tissus vivants au fil du temps. L’avancée clé est un raffinement de notre protocole pour améliorer le bien-être des animaux et s’aligner sur les trois R. Notre approche longitudinale minimise les étapes chirurgicales et réduit considérablement le nombre d’animaux nécessaires à notre étude.

Notre protocole répond au besoin d’imagerie intravitale non toxique à long terme en utilisant un microscope à deux photons, qui permet une pénétration profonde des tissus et une visualisation à haute résolution du comportement et de l’interaction cellulaires. L’utilisation de l’implant de tête imprimé en 3D permettra de trouver très facilement la zone d’intérêt lors d’une séance d’imagerie longitudinale sans viser à modifier la hauteur, l’angle ou l’ordre. Nous utilisons actuellement ce protocole pour suivre des sous-types endothéliales spécifiques et leur réponse au développement de la leucémie et au traitement médicamenteux afin de mieux comprendre leur contribution à la pathogenèse de la maladie.

Pour commencer, lancez le logiciel de segmentation et importez les fichiers DICOM micro-CT pour isoler le crâne. Effectuez une segmentation basée sur des seuils pour séparer le tissu osseux des structures environnantes. Ajustez manuellement les régions complexes ou bruyantes pour affiner la segmentation.

Dans 3D Slicer, importez les fichiers DICOM et chargez le jeu de données. Observez les coupes CT dans les vues axiale, sagittale et coronale. Ouvrez l’éditeur de segments et cliquez sur Ajouter pour créer une nouvelle segmentation, puis cliquez à nouveau sur Ajouter pour créer un nouveau segment pour le seuillage.

Dans le panneau de l’éditeur de segments, cliquez sur l’effet de seuil. Ajustez les curseurs de seuil inférieur et supérieur ou entrez des valeurs numériques pour mettre en surbrillance la région segmentée en rouge. Pour exporter le crâne segmenté sous forme de fichier stl, passez au module de segmentation.

Assurez-vous que le segment seuillé est sélectionné. Dans la section Exportation/importation de modèles et d’étiquettes, définissez le type d’exportation sur modèles et le format de fichier sur stl, puis cliquez sur exporter pour enregistrer le fichier. Pour la préparation du modèle de crâne en CAO, importez d’abord le modèle de crâne simplifié au format stl dans le logiciel de CAO en tant que nouvelle pièce ou modèle.

Dans le plan médian, créez un axe tangent à la calvariose, puis enregistrez le modèle de crâne préparé. Créez une esquisse dans le plan calvaire et concevez une cannelure en forme de poire de AP plus 6,5 à moins deux. Avec une largeur de six millimètres à AP 0,0, ce sera le contour de surface observable.

Concevoir la queue de l’implant en s’assurant qu’elle s’adapte à la structure du crâne pour une bonne fixation tout en respectant le volume disponible. Enfin, créez une housse de protection pour protéger la fenêtre d’observation lorsqu’elle n’est pas utilisée. Placez une souris anesthésiée sur un coussin chauffant réglé à 37 degrés Celsius et surveillez visuellement la fréquence respiratoire.

Rasez la tête de la souris avec un rasoir électrique. Appliquez ensuite une goutte de gel ophtalmique sur les yeux de la souris. Assurez-vous que tous les poils sont enlevés pour éviter les artefacts d’imagerie et réduire le risque d’infection de la plaie.

Maintenant, utilisez une paire de pinces et de ciseaux stériles pour faire une petite incision dans la partie centrale du cuir chevelu afin d’exposer la cicatrice osseuse centrale. Retirez le tissu conjonctif entre le crâne et le cuir chevelu. Mélangez suffisamment de ciment dentaire dans une boîte de Pétri pour faire une pâte.

Appliquez-le rapidement sur le bas de l’implant de fixation de la tête. Sans laisser le ciment dentaire pénétrer dans la zone d’imagerie, placez le support de tête sur le crâne exposé et laissez-le reposer. Allumez le flux d’isoflurane vers le masque stéréotaxique du microscope.

Maintenant, amenez rapidement la souris au microscope. Insérez soigneusement les dents de la souris dans le masque pour assurer une bonne pénétration de l’isoflurane en soulevant son nez d’une main. Tout en tenant la souris d’une main, glissez doucement la queue d’aronde de l’implant de fixation de la tête dans le support de fixation à l’aide de l’autre main.

Fixez-le avec un demi-tour du bouton à vis. Ensuite, introduisez une sonde rectale pré-intégrée avec un gel à base d’eau pour surveiller la température de la souris. Remplissez la chambre d’imagerie de la tête avec une grande quantité de gel à base d’eau, ou PBS.

Abaissez l’objectif d’immersion dans l’eau jusqu’à ce qu’il soit complètement immergé pour une excitation et une détection de signal optimales lors de l’excitation à deux photons. Déplacez les étages x, y et z pour vous concentrer sur l’os central de la cicatrice d’échafaudage. Identifiez le tissu marqué par la surface de l’os et la veine centrale.

Éteignez la lumière dans la pièce et fermez la boîte autour du support de microscope. Après avoir activé les détecteurs non-TOSCAN. Réglez PMT1 pour détecter le deuxième SHG à 423 à 461 nanomètres, D2 élevé pour GFP à 485 à 548 nanomètres et D3 élevé pour TD D’Amato à 551 à 645 nanomètres.

Laissez le décalage à zéro. Maintenant, réglez le gain PMT SHG sur 850 volts et les gains D élevés à 100 %Augmentez la puissance du laser infrarouge jusqu’à ce qu’une image avec une plage dynamique de 200 niveaux de gris soit visible sur le plus bas des trois canaux. Dans le logiciel d’acquisition, la région de localisation contenant les poches de moelle osseuse est indiquée enfermée dans les surfaces osseuses.

Pour identifier différentes régions d’intérêt, ou ROI, activez le Navigateur de pertes et créez une vue d’ensemble à l’aide du mode spirale. Cliquez sur l’icône de l’image unique pour enregistrer les positions de retour sur investissement sélectionnées et renommer chaque position dans la liste des tâches. Pour acquérir un volume de pile Z, sélectionnez le mode de pile Z et définissez la taille du pas à trois micromètres.

Désélectionnez l’option de la même taille de pile pour toutes les régions, puis appuyez sur Début pour commencer et sur Fin pour terminer. Après la capture, cliquez sur redéfinir la pile. Appuyez sur Démarrer pour démarrer la collecte d’images et enregistrez les images dans le dossier approprié.

Pour mesurer une caractéristique dynamique, telle que la perméabilité vasculaire, changez le mode d’acquisition en XYZT pour acquérir un laps de temps. Dans le module T, réglez l’intervalle de temps à trois minutes et la durée à une heure. Maintenant, injectez 100 microlitres de 70 kilodaltons de Dextran TRITC par voie intraveineuse à une concentration de quatre milligrammes par millilitre, et commencez l’acquisition.

Après avoir transféré la souris sur une marque chirurgicale sur un coussin chauffant à 37 degrés Celsius, appliquez du gel intrasite sur le crâne pour le garder hydraté. Fermez la zone d’imagerie de l’implant crânien avec le couvercle spécifique et fixez soigneusement le couvercle avec une vis. Placez la souris dans le boîtier chauffant réglé à 37 degrés Celsius et attendez qu’elle se réveille.

Une fois que la souris s’est complètement rétablie, transportez-la à l’animalerie et hébergez-la dans une cage propre avec de l’hydrogel et un enrichissement environnemental. Pour les acquisitions longitudinales, placez une petite goutte de gel ophtalmique sur les yeux d’une souris avec un support de tête déjà installé. Obtenez l’image de vue d’ensemble comme illustré précédemment.

Si nécessaire, réalignez les images précédentes et nouvelles à l’aide du module de chargement et d’alignement des images. Ouvrez l’image de capture d’écran pour marquer les positions à leur place d’origine. Le modèle CAO d’un implant de fixation de la tête en titane a été conçu pour s’adapter à la structure anatomique du crâne, assurant une fixation stable à la platine du microscope pour l’imagerie au niveau cellulaire.

L’implant a été fixé avec succès au crâne de la souris et a permis une imagerie stable au fil du temps, tout en permettant à la souris de maintenir des activités normales. La vascularisation de la moelle osseuse calvaire a été visualisée à l’aide d’un balayage de tuiles, révélant un réseau complexe d’artérioles, de capillaires de transition et de sinusoïdes. L’analyse quantitative des vaisseaux a démontré la segmentation des structures vasculaires, permettant de mesurer le diamètre, la longueur et la rectitude des vaisseaux, ainsi que leur corrélation.

L’imagerie longitudinale a permis de capturer un remodelage progressif du système vasculaire calvarial au cours de la progression de la leucémie, avec une augmentation de la densité vasculaire observée au fil du temps. La perméabilité vasculaire a été évaluée de manière dynamique, montrant une rétention différentielle du colorant fluorescent au fil du temps, montrant une perméabilité différentielle de différents vaisseaux de la moelle osseuse.