Name: Microbiote des jardins de fourmis attines : visualisation d’un paysage microbien par microscopie électronique à balayage (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-04T14:50:00.000+00:00
Duration: 7 min
Description: Découvrez l'organisation du microbiote dans les jardins de champignons des fourmis attines par microscopie électronique à balayage optimisée. Cette méthode révèle les interactions biofilms-champignons in situ.

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<meta charset="utf8"></head><body> Analyse MEB à l’échelle microscopique des communautés microbiennes dans les cultures de fourmis fongiques

Les écosystèmes sont composés d’organismes interconnectés par des processus dans un lieu géographique précis (c’est-à-dire l’environnement). Les organismes interagissent avec leur environnement au fil du temps, d’où émergent des motifs spatiaux complexes et hétérogènes. La structure spatiale détermine la diversité et la stabilité écologiques et, en fin de compte, le fonctionnement de l’écosystème 1,2,3,4. Dans les écosystèmes à grande échelle, tels que les zones humides, les savanes, les récifs coralliens et les écosystèmes arides, les modèles spatiaux sont corrélés avec le flux et la concentration des ressources. L’optimisation des ressources, l’hétérogénéité spatiale et la structuration permettent d’obtenir des écosystèmes plus résilients que des écosystèmes homogènes2. La localisation spatiale des organismes qui est à la base de l’écologie des communautés se traduit également dans le monde microbien.
Les écosystèmes microbiens, loin des organismes mélangés de manière aléatoire et homogène dans les microhabitats, présentent des modèles spatiaux définissant une grande partie de leur fonctionnement 5,6,7. Des colonnes de Winogradsky au microbiote associé à l’environnement et à l’hôte, ces écosystèmes sont organisés de manière hétérogène dans l’espace, avec des arrangements spatiaux suscitant différentes réponses phénotypiques. Les espèces qui cohabitent sont plus susceptibles d’interagir et d’influencer la physiologie de l’autre. Ainsi, l’organisation spatiale communautaire, plus que sa composition en soi, délimite les propriétés de l’écosystème et les niches écologiques 5,7,8. À l’appui de ces concepts, les changements dans la structure spatiale semblent corrélés à la progression pathologique des plaques dentaires, des caries, des maladies des gencives 9,10, des maladies inflammatoires de l’intestin11, des infections pulmonaires de la fibrose kystique, des infections chroniques des plaies12,13, du cancer colorectal et des adénomes14.
Dans le cadre de la biogéographie microbienne (l’étude de la distribution et de la structuration de la biodiversité à travers l’espace et le temps à une échelle microbienne), la connaissance des écosystèmes microbiens est largement enrichie par la compréhension de leurs modèles spatiaux 6,13,15,16,17. Nous nous sommes penchés sur les modèles spatiaux d’un écosystème microbien construit par des insectes, trouvé au cœur des colonies charismatiques de fourmis attines (Hymenoptera : Formicidae : Myrmicinae : Attini : Attina). Il existe un « jardin microbien », centré autour d’un champignon basidiomycète dans la tribu des Leucocoprinae (Basidiomycètes : Agaricaceae) ou dans la famille des Ptérulaceae (Basidiomycètes : Agaricales)18,19,20,21,22. Le jardin est une structure spongieuse émergeant d’un maillage entrelacé d’hyphes qui se développe en métabolisant le substrat principalement végétal incorporé par les fourmis (Figure 1). Il peut s’agir, selon les genres d’attines : de parties sèches de plantes, d’excréments et de carcasses d’insectes, de feuilles fraîchement coupées, de graines et de parties florales23,24. Analogue à un intestin herbivore externe, le jardin convertit enzymatiquement et chimiquement les polymères récalcitrants en ressources nutritionnelles labiles, fournissant aux fourmis des acides aminés essentiels, des lipides et des sucres solubles 21,25,26,27,28.
Les analyses ultrastructurales, enzymatiques et transcriptomiques effectuées pour les jardins des genres coupeuses de feuilles Atta et Acromyrmex suggèrent que ces environnements structurent un continuum de dégradation du substrat et de taches nutritionnelles 26,29,30,31,32. Les jeunes parties du jardin ont tendance à être plus foncées en raison du substrat fraîchement incorporé après avoir été fragmenté. Ces substrats récemment ajoutés sont souvent colonisés par les bords, qui ont été coupés par les ouvrières des fourmis et inoculés avec des touffes de mycélium. Rayonnant à partir des bords coupés, des hyphes fongiques se répandent sur le substrat 29,32,33. L’abondance des hyphes augmente à mesure que la dégradation du substrat progresse, ce qui entraîne des régions blanchâtres et métaboliquement actives 30,31,32. Les régions plus anciennes, avec un substrat plus dégradé et un microbiote abondant 29,32, ont tendance à présenter des tons brunâtres et une humidité plus élevée. Les ouvrières enlèvent des fragments de cette région, les séparant en tas de déchets, où elles prennent également des substrats qui nuisent au symbiote fongique 34,35,36. Les tas de déchets, bien que physiquement détachés du jardin, sont un point de dégradation continue du substrat et de cycle des nutriments par le microbiote abondant des habitants 29,32,37,38,39.
Un microbiote principalement composé d’Enterobacter, Klebsiella, Pantoea, Pseudomonas et Serratia, habite également le jardin, apparemment partagé par divers systèmes de fongiculture de l’attine. Codant pour des voies métaboliques qui pourraient compléter le métabolisme fongique, le microbiote participe potentiellement aux réponses physiologiques du jardin 40,41,42,43,44. Non seulement les données métagénomiques indiquaient que le microbiote était là41,42, mais l’analyse par microscopie électronique à balayage (MEB) de la fungiculture des fourmis coupeuses de feuilles a montré principalement des bactéries en forme de bâtonnet sur le substrat végétal32. Bien que les bactéries (y compris les souches cellulolytiques) aient été isolées de l’ensemble du jardin, elles n’ont été visualisées que dans les parties les plus anciennes du jardin et dans les tas de déchets, ainsi que dans la pastille initiale transportée par les reines fondatrices29,32. Il n’était pas non plus certain que le microbiote puisse former des biofilms in vivo (c’est-à-dire dans le jardin et les déchets), comme le suggère leur capacité métabolique42 et observée in vitro44.
Ici, nous avons utilisé le SEM pour mieux comprendre l’organisation spatiale du microbiote dans les régions du jardin, en détaillant les interactions physiques microbiote-substrat et microbiote-hyphes. En fournissant des images avec une plus grande profondeur focale, le MEB permet d’observer des structures microscopiques tridimensionnelles à haute résolution, ce qui permet une analyse approfondie des modèles spatiaux du microbiote du jardin. Nous détaillons les étapes de fixation, de déshydratation, de séchage, de pulvérisation et d’imagerie de ces échantillons hétérogènes et délicats à base de champignons. En supprimant l’étape de postfixation à l’aide de tétroxyde d’osmium (OsO4) et en réduisant le temps de déshydratation, nous avons simplifié les protocoles 32,33,45 de préparation des échantillons de jardin et de déchets pour l’analyse MEB. Ce protocole adapté préserve les motifs structurels des hyphes, ainsi que l’organisation spatiale du microbiote et du biofilm, et pourrait être appliqué à d’autres écosystèmes microbiens délicats et aux biofilms.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67334/67334fig01v2.jpg"> 
Figure 1 : Jardins microbiens d’Attine. Le jardin est une structure semblable à une éponge résultant d’un maillage entrelacé d’hyphes qui se développe en métabolisant le substrat principalement végétal incorporé par les fourmis. Le jardin est également habité par le microbiote, qui code pour des voies métaboliques qui pourraient compléter le métabolisme fongique. Les données métagénomiques et les analyses antérieures en microscopie électronique à balayage ont indiqué sa présence, bien que nous ayons une connaissance limitée de son organisation spatiale et de ses interactions physiques avec le substrat et les hyphes fongiques. Nous avons utilisé le SEM pour dévoiler l’organisation spatiale et la structuration du microbiote et du biofilm. Illustrations de Mariana Barcoto (jardin et microbiote adaptés de Barcoto et Rodrigues 94), et photos de Mariana Barcoto et Enzo Sorrentino. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67334/67334fig01largev2.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>

<table><tbody><tr><td>Tube de 2 mL</td><td>Axygen</td><td>MCT-200-C-BRA</td><td>Pour fixer et déshydrater les échantillons</td></tr><tr><td>Chlorure de calcium anhydre</td><td>Merck</td><td>C4901</td><td>CaCl2 anhydre pour préparer Karnovsky' s fixateur</td></tr><tr><td>Séchoir à point critique</td><td>Leica</td><td>EM CPD 300</td><td>Pour le séchage au point critique</td></tr><tr><td>Ruban conducteur de carbone double face, 12 mm (L) x 5 M (L)</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td>77819-12</td><td>Pour le montage d’échantillons</td></tr><tr><td>Pince entomologique</td><td>Aucun fournisseur</td><td></td> spécifique <td>Pour manipuler des échantillons</td></tr><tr><td>de jardin Alcool éthylique (=éthanol), pur (&ge ; 99,5 %)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>459836</td><td>Pour la déshydratation</td></tr><tr><td>Pinces</td><td>Aucun fournisseur</td><td></td> spécifique <td>Pour manipuler des échantillons de jardin</td></tr><tr><td>Bécher en verre</td><td>Aucun fournisseur</td><td></td> spécifique <td>Pour la déshydratation Boîte</td></tr> de <tr><td>Pétri en verre</td><td>Aucun fournisseur</td><td></td> spécifique <td>Pour manipuler des échantillons de jardin</td></tr><tr><td>Pipette en verre</td><td>Aucun fournisseur</td><td></td> spécifique <td>Pour fixer et déshydrater des échantillons</td></tr><tr><td>Glutaraldéhyde (glutaraldéhyde aqueux EM Grade 25 %)</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td>16220</td><td>Pour préparer Karnovsky' s fixateur</td></tr><tr><td>d’or cible&nbsp ;</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>8071</td><td>Pour pulvériser une couche d’or</td></tr><tr><td>Acide chlorhydrique</td><td>Sigma-Aldrich 320331</td><td></td><td>Pour ajuster les solutions pH</td></tr><tr><td>Éditeur d’images</td><td>Photoshop</td><td>n’importe quelle version</td><td>Pour ajuster les images</td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde (Paraformaldéhyde 20 % Solution aqueuse EM Grade)</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td>15713</td><td>Pour préparer Karnovsky' s fixateur</td></tr><tr><td>Récepteur de propilene</td><td>Aucun fournisseur</td><td></td> spécifique <td>Pour maintenir en vie les colonies de fourmis</td></tr><tr><td>Microscope électronique à balayage</td><td>JEOL&nbsp ;</td><td>IT300 MEB</td><td>Pour l’imagerie d’échantillons&nbsp ;</td></tr><tr><td>Cacodylate de sodium trihydraté</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0250</td><td>Pour la préparation d’un tampon de cacodylate de sodium</td></tr><tr><td>Spatule</td><td>Aucun fournisseur</td><td></td> spécifique <td>Pour manipuler des échantillons de jardin</td></tr><tr><td>Récipients à échantillons de 15 mm de diamètre x 10 mm de hauteur</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>4591</td><td>Pour le séchage au point critique</td></tr><tr><td>Etueuse par pulvérisation baltec</td><td>&nbsp ;</td><td>SCD 050</td><td>À revêtir avec</td></tr><tr><td>embout doré (passe-partout en aluminium, goupille d’extrémité plate) 12,7 mm x 8 mm ;</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td>75520</td><td>Pour le montage d’échantillons</td></tr></tbody></table>

microbiote des jardins de fourmis attines : visualisation d’un paysage microbien par microscopie électronique à balayage

Microbiota of Attine Ants' Gardens: Visualizing a Microbial Landscape by Scanning Electron Microscopy

Ici, nous avons présenté un protocole simplifié pour visualiser les composants du jardin d’attine et des échantillons de déchets, tels que les hyphes fongiques, le substrat, le microbiote et les biofilms. La MEB a amélioré notre compréhension de la façon dont le jardin et les déchets échafaudent les modèles structurels du microbiote (Figure 3). Dans les jardins d’attines, les hyphes fongiques sont des structures en forme de branches couvrant une partie de la surface du substrat. Étant donné que les hyphes fongiques ont tendance à être très sensibles à la déshydratation et à la rupture, l’utilisateur peut être guidé par l’aspect des hyphes pour évaluer les résultats de la préparation de l’échantillon. Comme on l’a également observé dans les travaux précédents 32,33,45, les hyphes présentent un aspect tubulaire ; Des hyphes intacts en forme de tube indiquent une préparation efficace de l’échantillon (figure 3A et figure 4C). Lorsque les hyphes sont en forme de ruban, un tel aplatissement est peut-être un artefact de la technique (Figure 4C).
Les surfaces du substrat végétal peuvent être reconnues par les couches de cuticule et d’épiderme, ainsi que par les stomates et les trichomes. De telles structures sont plus reconnaissables lorsque les substrats ne sont pas encore colonisés par les hyphes fongiques et le microbiote (Figure 3A et Figure 4C). Lorsque le substrat est colonisé, le microbiote et/ou les hyphes fongiques recouvrent sa surface, de sorte que les structures spécifiques de la plante ne sont pas facilement discernables (Figure 3A). Le microbiote peut coloniser soit les hyphes fongiques, soit le substrat, chacun d’entre eux ayant une organisation spatiale apparemment distincte. Dans la figure 3, ces modèles spatiaux ont été illustrés schématiquement et encadrés dans des images MEB respectives où ils ont été identifiés ; cela peut faciliter le lien entre les résultats du MEB et leur interprétation.
Le microbiote colonisant les hyphes est moins fréquemment observé et, lorsqu’il est trouvé, il est composé de cellules en bâtonnets ou en coccoïdes isolées ou en petits groupes attachés à la surface de l’hyphe. Une matrice exopolysaccharidique (EPS) du biofilm, ressemblant à une structure de « tissu de dentelle », peut être observée autour des hyphes en petits amas (Figure 3A). Assez commun est le microbiote colonisant le substrat, que l’on trouve dans les jardins de différentes espèces de fourmis attines. Les schémas de colonisation semblent définis dans une certaine mesure par les stades de détérioration du substrat. Ainsi, tout en colonisant des substrats non encore dégradés, le microbiote peut soit se présenter sous forme de cellules individuelles, soit se rassembler en petits groupes. Le microbiote peut recouvrir le substrat lorsqu’il présente des signes microscopiques de détérioration (c.-à-d. lorsque les couches cuticulaires/épidermiques des plantes et d’autres structures végétales ne sont pas discernables, et que les sillons et les indentations sont abondants).
Dans ces « tapis microbiens », la morphologie des cellules est plus reconnaissable en l’absence de matrice EPS. Dans les cas où les cellules microbiennes sont intégrées dans la matrice EPS, leur morphologie n’est pas facilement distinguable. Selon leur organisation spatiale, nous avons caractérisé les biofilms comme « étalés » ou comme « tridimensionnels ». Lorsque le biofilm est étalé, les cellules microbiennes et la matrice EPS recouvrent par intermittence la surface du substrat, formant une couche plate de 1 à 3 cellules d’épaisseur (Figure 3B). Lorsque le biofilm est tridimensionnel, les cellules microbiennes et la matrice EPS s’empilent, formant des amas de plusieurs épaisseurs de cellules. Les régions de jardin constituées de substrats détériorés (tels que les vieux jardins et les déchets) abritent le microbiote dans ses sillons et ses indentations, où ils forment des communautés épaisses (Figure 3C). En particulier, les substrats largement dégradés des échantillons de déchets abritent un microbiote abondant, le plus diversifié sur le plan morphologique de toutes les régions. Les levures ajoutent plus de complexité à cette communauté, interagissant physiquement avec les procaryotes via le biofilm. Dans les échantillons de déchets d’Atta sexdens et d’Acromyrmex sp., les matrices EPS ont été observées formant un réseau fibrillaire visible entourant les procaryotes en forme de bâtonnets et coccoïdes ainsi que les levures fusiformes et sphériques (figure 3C). 
Résultant d’un maillage entrelacé d’hyphes, la structure spongieuse du jardin nécessite une pulvérisation supplémentaire pour enrober l’échantillon plus uniformément. De telles étapes évitent la diffusion des électrons qui déforme l’image et entrave sa résolution (Figure 4A). Les étapes de préparation des échantillons ont permis de préserver l’essentiel de la structure du jardin, dévoilant la distribution spatiale et l’organisation du microbiote. Il convient toutefois de rappeler que des structures telles que les hyphes fongiques et la matrice EPS sont très sensibles à la déshydratation et très difficiles à conserver, en particulier pour le MEB. La structure hyphale était relativement bien conservée, mais il est raisonnable de considérer que le biofilm visualisé dans certains échantillons de jardin pourrait manquer de certains composants structurels de la matrice EPS. Bien que la couche externe lisse de polysaccharides entourant le microbiote ait été préservée dans certains échantillons (figures 3A, B), certains d’entre eux avaient conservé les caractéristiques morphologiques du microbiote mais n’avaient pas de matrice EPS. Cependant, il n’est pas clair si la matrice EPS était effectivement absente ou si elle a été retirée lors de la préparation de l’échantillon.
D’une part, l’élimination de la couche lisse du biofilm nuit à la compréhension de la structure précise du biofilm. D’autre part, il révèle la morphologie, l’organisation spatiale et les interactions physiques des cellules vivant sous la couche, ce qui est notre principal objectif de recherche. Des études antérieures ont rapporté la préservation des hyphes fongiques et de la matrice du biofilm en utilisant de la vapeur de tétroxyde d’osmium (OsO4) comme fixateur primaire 44,50,51,52,53,54. Ensuite, nous avons réalisé une expérience comparative de fixation d’échantillons frais de jardin avec de la vapeur d’OsO4, qui aurait conservé l’aspect lisse des biofilms (Figure 4B). Cette méthode a cependant provoqué un aplatissement important des hyphes et du microbiote. Cet aplatissement a entraîné la perte des aspects spatiaux généraux du jardin décrits précédemment 29,33,32,45, limitant ainsi les études ultérieures sur les modèles structurels du jardin. La fixation avec OsO4 a rendu difficile à la fois la distinction de la morphologie et de la distribution microbiennes et la différenciation des structures cellulaires des artefacts techniques, compliquant ainsi l’interprétation des données.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67334/67334fig03v2.jpg"> 
Figure 3 : Motifs architecturaux du microbiote. Le microbiote colonise soit les hyphes fongiques, soit le substrat dans une organisation spatiale distincte. De tels modèles spatiaux ont été illustrés schématiquement et ont été encadrés sur des images MEB respectives où ils ont été identifiés (délimités dans la figure par des carrés blancs) : (A) Les microbiotes colonisant les hyphes sont composés de cellules isolées ou de petits groupes, avec une matrice exopolysaccharidique de biofilm détectable dans certains échantillons. (B) Le microbiote colonisant le substrat se propage dans tout le substrat, la matrice EPS recouvrant les cellules de sorte que leur morphologie n’est pas facilement distinguable. (C) Microbiote colonisant le substrat formant des groupes tridimensionnels, constituant des biofilms mono ou multimorphologiques, mettant en évidence dans certains cas la matrice EPS. Illustrations de Mariana Barcoto. Abréviation : EPS = matrice exopolysaccharidique. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67334/67334fig03largev2.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67334/67334fig04v2.jpg"> 
Figure 4 : Imagerie infructueuse. Des images de mauvaise qualité produisant des résultats inefficaces et/ou entravant l’interprétation des motifs architecturaux. (A) La diffusion des électrons déforme l’image, entravant sa résolution et, par conséquent, l’identification morphologique. Cela a été observé fréquemment dans les échantillons revêtus par pulvérisation cathodique une seule fois et a été réduit par un revêtement supplémentaire. (B) La fixation d’échantillons de jardin frais avec de la vapeur de tétroxyde d’osmium (OsO4) comme fixateur primaire 44,50,51,52,53,54 a apparemment préservé l’aspect lisse des biofilms. Cependant, il a provoqué un aplatissement important des hyphes et du microbiote, endommageant les modèles architecturaux des jardins. (C) La préparation des échantillons à l’aide du fixateur de Karnovsky a donné des images de meilleure qualité par rapport aux préparations utilisant OsO4, préservant la majeure partie de la structure des hyphes, la distribution du microbiote et les modèles spatiaux des jardins. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67334/67334fig04largev2.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>

Microbiote des jardins de fourmis attines : visualisation d’un paysage microbien par microscopie électronique à balayage

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