Étude multimodale du remodelage cardiovasculaire murin : imagerie quadridimensionnelle par ultrasons et spectrométrie de masse

Notre laboratoire utilise l’imagerie par ultrasons précliniques pour étudier la biomécanique cardiovasculaire dans diverses maladies et états physiologiques. Nous utilisons également l’imagerie par spectrométrie de masse pour étudier la distribution spatiale des lipides dans les tissus cardiovasculaires et cérébraux. Nous essayons de voir où dans les tissus nous avons des changements fonctionnels et moléculaires.

Bien que les techniques d’imagerie moléculaire courantes, comme l’histologie et l’immunohistochimie, puissent fournir des données moléculaires, elles sont limitées par les colorants et les anticorps actuellement disponibles. D’autre part, l’imagerie par spectrométrie de masse est une approche non ciblée pour les études multiomiques qui maintient l’intégrité spatiale du tissu. Grâce à notre technique, nous pouvons étendre la multiomique pour inclure les lipides, les glycanes et les peptides, et les coupler avec des techniques d’imagerie fonctionnelle, telles que les ultrasons.

Grâce à ces techniques, les chercheurs peuvent désormais coupler l’imagerie fonctionnelle avec des techniques d’imagerie moléculaire. Dans notre laboratoire, nous nous concentrons principalement sur les maladies cardiovasculaires, et l’un d’eux est l’étude du remodelage cardiaque avec des crises cardiaques ou des traitements contre le cancer, donc la cardiotoxicité. Et notre deuxième grand objectif cardiovasculaire est d’examiner le vieillissement et l’impact du vieillissement sur le système vasculaire.

Pour effectuer une échographie cardiaque quadridimensionnelle, placez la souris en position couchée sur la plaque d’imagerie. Ensuite, placez le transducteur dans le support en position semi-verrouillée. Alignez le point en relief sur le transducteur avec le point bleu sur l’écran, en le positionnant vers le côté droit de la souris.

Tournez le transducteur pour l’aligner le long du plan sagittal de la souris avec l’encoche surélevée pointant vers la queue. Appliquez une quantité généreuse de gel à ultrasons sur la surface ventrale de la cavité thoracique pour le couplage acoustique avec une sonde. Abaissez le transducteur jusqu’à ce qu’il entre en contact avec le gel à ultrasons.

Effectuez des réglages précis avec les boutons XY à la base de la plaque pour un réglage précis. Ensuite, assurez-vous que la vue péristernale sur le grand axe à l’écran comprend l’apex, la voie d’écoulement ventriculaire gauche et l’aorte, alignées horizontalement pour une imagerie précise. Sélectionnez Nom de l’image dans le coin inférieur de l’écran pour enregistrer l’image dans la série actuelle.

Faites pivoter la sonde de 90 degrés dans le sens des aiguilles d’une montre pour obtenir une vue péristernale à court axe. Assurez-vous que le ventricule gauche est clairement défini dans l’image et que les muscles papillaires sont visibles. Sélectionnez l’icône du cube dans le coin supérieur gauche de l’écran pour configurer une image en quatre dimensions.

Après avoir réinitialisé le transducteur, ajustez la position de départ juste en dessous de l’apex et la position d’arrêt à l’arc aortique. Réglez la taille du pas sur 0,08 à 0,13 millimètre et la fréquence d’images sur 200 à 300 hertz. Assurez-vous que les signes vitaux et le signal ECG restent stables avant de lancer l’examen.

Une fois le balayage et le traitement terminés, activez l’option Enregistrer les données EKV/4D et Breath Gating pour le post-traitement. Sélectionnez Nom de l’image dans le coin inférieur droit et incluez l’ID de la souris dans le nom. Pour visualiser chaque plan de vue à travers le cycle cardiaque, sélectionnez Plus de commandes, puis choisissez Charger en quadridimensionnel.

Examinez chaque vue plane du cœur, en confirmant que le centre du cœur reste stable tout au long du cycle cardiaque. Pour commencer, préparez des bateaux en papier d’aluminium pour la congélation instantanée des tissus de souris. À l’aide d’une pince, tentez la peau de la souris euthanasiée et coupez la peau de la tente avec des ciseaux sur le cou pour l’accès vasculaire ou juste en dessous du sternum pour l’accès cardiaque.

Continuez à couper à travers la peau et les couches musculaires pour exposer le système vasculaire. Pour l’ablation du cœur, coupez l’os pour exposer le cœur. À l’aide d’une dissection contondante avec des cotons-tiges, isolez le cœur ou le système vasculaire des tissus environnants, y compris la graisse.

Séparez soigneusement le vaisseau carotidien du nerf. Ensuite, retirez le cœur ou le système vasculaire à l’aide d’outils chirurgicaux. Placez le vaisseau carotidien, le cœur et le système vasculaire sur un bateau en papier d’aluminium pré-étiqueté.

Ensuite, placez les bateaux dans de l’azote liquide pour la congélation instantanée. Pour commencer, remplissez un bécher d’eau HPLC et mettez-le de côté avec des seringues de cinq litres et un millilitre. Ensuite, réglez la température du cryostat à moins 25 degrés Celsius et insérez la lame.

Placez une paire de pinces à l’intérieur de la chambre du cryostat pour refroidir avant de monter le tissu. Prélevez cinq millilitres d’eau HPLC dans une seringue et placez-la dans le cryostat pour congeler partiellement l’eau. Avant que l’eau de la seringue ne gèle complètement, versez-la sur le mandrin en métal et laissez-la geler complètement.

Maintenant, remplissez une seringue d’un millilitre d’eau HPLC et placez-la dans le cryostat. Après 30 à 60 secondes, placez une petite noisette d’eau partiellement solidifiée au centre du mandrin. À l’aide d’une pince, placez rapidement le cœur de souris extrait dans la gouttelette d’eau et maintenez-le à cet endroit jusqu’à ce que l’eau environnante soit complètement gelée.

Pour commencer, sortez la diapositive avec le cœur de souris monté du congélateur et placez-la dans un dessiccateur pour qu’elle sèche. Allumez le pulvérisateur HTX M3+. Ouvrez l’application HTX sur l’ordinateur portable et, dans la méthode, réglez la température de la buse à 75 degrés Celsius, le débit à 100 microlitres par minute et la pression à 10 psi.

Notez le nom de l’échantillon, la polarité, la matrice, le solvant et la concentration dans le cahier de laboratoire. Ensuite, calculez la quantité de matrice requise pour la concentration souhaitée. Ensuite, pesez la quantité souhaitée d’acide 2,5-dihydroxybenzoïque pour la matrice en mode positif.

Dissoudre la matrice dans du méthanol à 70 % dans un tube de 15 millilitres. Soniquez la solution matricielle pendant 10 minutes. Pendant la sonication, retirez la lame du dessiccateur.

Ouvrez le plateau du pulvérisateur. Ensuite, placez la diapositive dans le coin inférieur gauche et collez les bords. Sélectionnez la zone de pulvérisation de l’échantillon et fermez le plateau.

À l’aide d’une seringue et d’un filtre, aspirez la solution matricielle dans la seringue. Filtrez la solution matricielle à travers la seringue dans le flacon avec le couvercle noir situé sur le côté gauche du pulvérisateur. Remettez le flacon à l’endroit désigné sur le pulvérisateur et insérez solidement le tube de la ligne D dans le flacon.

Ensuite, allumez le gaz inerte et confirmez que la jauge du pulvérisateur indique 10 psi. Appuyez sur Start, et une fois que le pulvérisateur atteint la température réglée, sélectionnez le bouton Start clignotant pour commencer à pulvériser. Une fois la pulvérisation terminée, retirez l’échantillon du pulvérisateur et placez-le dans le porte-lames MALDI.

Numérisez le support de diapositives MALDI et la diapositive à l’aide d’un scanner. Enregistrez l’image sur une clé USB pour l’utiliser avec l’imagerie par spectrométrie de masse. Sélectionnez l’option Lavage sur le pulvérisateur et déplacez la ligne D du flacon de matrice au bécher.

Enfin, vaporisez du méthanol sur le plateau du pulvérisateur et essuyez-le. Coupez l’azote. L’imagerie par spectrométrie de masse MALDI du tissu myocardique infarctus a identifié une masse d’ions moléculaires à charge 577,52, correspondant probablement à COHb en C ou D, suggérant une implication dans le remodelage myocardique.

L’image échographique quadridimensionnelle a montré des régions myocardiques avec une amplitude de contrainte inférieure à 20 % de la surface, visualisées sous forme de tissu vert-jaune, indiquant des zones infarctuses. Dans la vue longitudinale du tissu de l’infarctus du myocarde, la délocalisation des lipides était visible, ce qui compliquait la corrélation entre la biomécanique tissulaire et la composition moléculaire.