Analyse par cytométrie en flux de l’expression des facteurs tissulaires dans les plaquettes humaines

Dans ce protocole, nous proposons un tutoriel étape par étape pour mesurer le facteur tissulaire associé aux plaquettes par cytométrie du flux sanguin total, évaluer la protéine dans le compartiment intracellulaire, les conditions d’arrêt et à la surface de la cellule, à la fois au repos et lors de l’activation. Si des plaquettes positives pour facteur tissulaire sont mesurées dans du plasma riche en plaquettes PRP ou dans des plaquettes lavées, ce sous-ensemble peut être perdu lors de la préparation de l’échantillon. Ce risque ne se produit pas lorsque cette évaluation est réalisée en mur.

Le facteur tissulaire associé aux plaques sanguines a été controversé depuis le premier rapport publié au début du siècle en raison de problèmes pré-analytiques et méthodologiques. Ce protocole met en lumière ces questions et est également utilisé pour mener un projet international soutenu par la Société internationale de thrombose et d’hémostase ISDH pour normaliser la mesure des facteurs tissulaires associés aux plaquettes ou la cytométrie du flux sanguin est effectuée sur quelques microlitres de sang, permettant une analyse des facteurs tissulaires associés aux plaquettes adaptée en milieu clinique. De plus, la possibilité de fixer l’échantillon et de l’étiqueter par la suite, rend cette analyse réalisable pour de nombreux hôpitaux et laboratoires.

Pour commencer, préparez un tube à essai pour chaque volume d’anticorps. Pour tester, ajoutez une goutte de billes négatives et une goutte de billes positives dans chaque tube à essai. Ajoutez 20 microlitres de chaque dilution d’anticorps dans le tube à essai et le vortex.

Incuber immédiatement les tubes à essai dans l’obscurité à température ambiante pendant 20 minutes. Ajoutez ensuite un millilitre de PBS sans calcium et magnésium pH 7,4 dans chaque tube et vortex, retournez doucement le citrate de sodium vacutainer cinq fois pour bien mélanger le sang et l’anticoagulant. Transférez 50 microlitres de sang dans un tube de 1,5 millilitre.

Ajoutez ensuite 950 microlitres d’aldéhyde paraforme à 1 %. Mélangez doucement et incubez l’échantillon pendant 90 minutes à température ambiante. Centrifugez maintenant l’échantillon à 1 500 G pendant cinq minutes avec une pause à température ambiante.

Après avoir retiré le surnageant Reese, suspendez la pastille dans un millilitre de PBS sans calcium ni magnésium. À un pH de 7,4, versez 100 microlitres de sang fixe dans chaque tube et centrifugez-les à 1 500 g pendant cinq minutes. Avec pause à température ambiante, retirez ensuite le surnageant.

Suspendre la pastille dans 100 microlitres de 0,1 % Triton PBS pour permer les échantillons et incuber pendant 10 minutes à température ambiante. Pour commencer, préparez un tube pour la fluorescence moins un témoin et un tube pour la coloration du facteur tissulaire. Ajoutez des anticorps à 100 microlitres de sang total fixe et permanent dans chaque tube.

Ajoutez 300 microlitres de PBS sans calcium ni magnésium à pH 7,4 dans chaque tube et mélangez. Ensuite, stockez les échantillons colorés dans l’obscurité jusqu’à ce que l’analyse par cytométrie en flux dilue alpha CD 1 42 HTF un anticorps monoclonal et Alexa Fluer 6 33 chèvre anti immunoglobuline G de souris dans PBS sans calcium ni magnésium. Ensuite, préparez trois tubes d’échantillon et distribuez du PBS sans calcium ni magnésium.

À pH 7,4, distribuez 7,5 microlitres d’alpha CD 1 42 htf dilué un anticorps monoclonal et ajoutez cinq microlitres d’adénosine diphosphate. Retournez doucement le citrate vacutainer cinq fois pour bien mélanger le sang et l’anticoagulant. Versez cinq microlitres de sang total dans chaque tube.

Mélangez délicatement les échantillons et incubez pendant 20 minutes à température ambiante. Pour la fixation de l’échantillon, ajouter 300 microlitres de 1 % de PFA dans chaque tube et centrifuger à 1 500 G pendant cinq minutes avec pause à température ambiante. Une fois le surnageant éliminé, réanimez la pastille en suspension dans 90 microlitres de PBS sans calcium ni magnésium.

À pH 7,4, par pipetage doux, versez cinq microlitres d’immunoglobuline G diluée Alexa Fluer 6 33 et cinq microlitres d’alpha CD 41 PE dans chaque tube. Incuber les échantillons pendant 15 minutes dans l’obscurité à température ambiante. Ajoutez ensuite 300 microlitres de PBS sans calcium et magnésium à pH 7,4 dans chaque tube et mélangez.

Pour commencer, créez un diagramme à points de zone de diffusion vers l’avant et une zone de diffusion latérale sur une échelle logarithmique affichant tous les événements, créez un graphique à points de zone de dispersion latérale CD 61 A et à une échelle logarithmique affichant tous les événements. Pour visualiser la population plaquettaire, réglez le seuil à environ 2000 sur la hauteur de diffusion latérale et 1000 sur le par CP B six 90 H.Ajustez le gain PE Y 5 8 5 et par CP B six 90 en fonction du contrôle de qualité quotidien et réglez le débit sur faible. Dessinez maintenant une région entre 10 rayons à la puissance trois et 10 rayons à la puissance cinq, appelée CD 61 positive.

Pour identifier la population plaquettaire, dupliquez le FMO et renommez-le TFIC. Acquérez les échantillons et enregistrez un fichier de données de 10 000 événements à l’intérieur de la porte positive du CD 61. Créez un graphique à points de zone de diffusion vers l’avant et de zone de diffusion latérale sur une échelle logarithmique affichant tous les événements.

Créez un graphique à points de CD 41 A et de zone de dispersion latérale sur une échelle logarithmique affichant tous les événements. Ajustez ensuite le gain de l’Alexa floor 6 33 et le gain du PE wifi 5 8 5 en fonction du contrôle qualité quotidien. Réglez le seuil à environ 1000 sur la hauteur de diffusion latérale et à 2 500 sur PEY 5 85 H.To visualiser la population plaquettaire, réglez le débit sur faible.

Dessinez maintenant une région entre 10 rayons à la puissance quatre et 10 élevés à la puissance cinq appelés CD 41 positifs pour identifier la population plaquettaire. Créez ensuite un tube pour chaque échantillon et nommez TF Unstimulated et TF Stimulated. Acquérez les échantillons et enregistrez un fichier de données de 10 000 événements dans la centrifugeuse à marche positive CD 41.

Le citrate de sodium 0,129 molaire vacutainer à 100 G pendant 10 minutes sans interruption à température ambiante. Retirez ensuite le vacutainer de la centrifugeuse. Prélevez le plasma riche en plaquettes obtenu, transférez-le dans un tube en polypropylène de 10 millilitres et enregistrez le volume collecté en comptant les plaquettes deux fois dans le plasma riche en plaquettes à l’aide d’un compteur de cellules sanguines.

La population plaquettaire identifiée par coloration par anticorps alpha CD 61 a montré qu’environ 26,8 % des plaquettes circulantes contenaient un facteur tissulaire intracellulaire L’analyse cytométrique en flux a indiqué que le facteur tissulaire est exprimé par environ 2,8 % des plaquettes au repos et augmente à 24,5 % lors de l’activation avec l’adénosine diphosphate. Il a été démontré que les plaquettes de plus grande taille expriment des niveaux de facteurs tissulaires plus élevés, les points verts représentant le plus grand sous-ensemble de plaquettes. L’analyse par cytométrie en flux a démontré que le plasma riche en plaquettes préparé à l’aide d’une centrifugation de 100 g préservait une population similaire à celle du sang total, en conservant des plaquettes de plus grande taille avec une positivité du facteur tissulaire plus élevée.

Une force de centrifugation plus élevée a entraîné une perte de plaquettes positives pour les facteurs tissulaires plus gros, comme l’indique la réduction de la diffusion vers l’avant dans la population PRP.