Name: Interférence de l’ARN larvaire chez le ver à soie Bombyx mori par l’administration de nanoparticules de chitosane/ARNdb (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-04T14:55:00.000+00:00
Duration: 5 min 36 s
Description: Découvrez une méthode d'interférence ARN par administration orale de nanoparticules de chitosane/ARNdb chez les larves de Bombyx mori. Cette technique permet d'obtenir un silençage génique efficace de 79% sans injection.

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<meta charset="utf8"></head><body>Alimentation à ARNdb médiée par des nanoparticules pour le silençage génique chez les larves de vers à soie

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<li>Terenius, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rna+interference+in+Lepidoptera%3A+An+overview+of+successful+and+unsuccessful+studies+and+implications+for+experimental+design%5BTitle%5D)+AND+%22J+Insect+Physiol%22%5BJournal%5D)">Rna interference in Lepidoptera: An overview of successful and unsuccessful studies and implications for experimental design.</a> J Insect Physiol. 57 (2), 231-245 (2011).</li>
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</ol>

<table><tbody><tr><td>Tube à centrifuger de 1,5 mL</td><td>Sangon</td><td>F601620</td><td>pour réaction d’ARNdb ou de nanoparticules</td></tr><tr><td>10 &mu ; l pipette</td><td>Eppendorf</td><td>P13473G</td><td>pour aspirer ou remettre en suspension le liquide</td></tr><tr><td>100 &mu ; l pipette</td><td>Eppendorf</td><td>Q12115G</td><td>pour aspirer ou remettre en suspension le liquide</td></tr><tr><td>2.5 &mu ; l pipette</td><td>Eppendorf</td><td>P20777G</td><td>pour aspirer ou remettre en suspension le liquide</td></tr><tr><td>20 &mu ; l pipette</td><td>Eppendorf</td><td>H19229E</td><td>pour aspirer ou remettre en suspension le liquide</td></tr><tr><td>200 &mu ; l pipette</td><td>Eppendorf</td><td>H20588E</td><td>pour aspirer ou remettre en suspension liquide</td></tr><tr><td>6 puits Transparent traité TC Plaques à puits multiples</td><td>Costar</td><td>3516</td><td>pour l’élevage individuel du ver à soie</td></tr><tr><td>Acide acétique</td><td>Aladdin</td><td>A116165</td><td>pour fabriquer TAE</td></tr><tr><td>Agarose M</td><td>BBI Life Sciences</td><td>A610013</td><td>pour l’électrophose sur gel d’agarose</td></tr><tr><td>Balance analytique</td><td>Sartorius</td><td>BSA224S</td><td>pour peser les ingrédients</td></tr><tr><td>Centrifugeuse&nbsp ;</td><td>Sartorius</td><td>Centrisart A-14C</td><td>à centrifuger pour former des ARNdb ou des nanoparticules</td></tr><tr><td>Chitosan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3646</td><td>à combiner avec de l’ARNdb pour la préparation de nanoparticules</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sangon</td><td>A500895</td><td>pour fabriquer des TAE</td></tr><tr><td>Éthanol</td><td>Aladdin</td><td>E130059</td><td>pour fabriquer des TAE, ou pour la précipitation d’ARNdb</td></tr><tr><td>Congélateur</td><td>Siemens</td><td>iQ300</td><td>pour stocker des ARNdb ou nanoparticules</td></tr><tr><td>GoTaq Green Master Mix</td><td>Promega</td><td>M712</td><td>pour réaction</td></tr><tr><td>PCR GoTaq qPCR Master Mix</td><td>Promega</td><td>A6002</td><td>pour réaction qRT-PCR</td></tr><tr><td>Isopropanol&nbsp ;</td><td>Aladdin</td><td>I112011</td><td>pour la précipitation de l’ARNdb</td></tr><tr><td>Spectrophotomètre UV-Vis NanoDrop Microvolume</td><td>ThermoFisher</td><td>One</td><td>pour déterminer la concentration de l’ARNdb</td></tr><tr><td>ph-mètre</td><td>Sartorius</td><td>&nbsp ; PB-10</td><td>pour préparer des tampons</td></tr><tr><td>Colonne SanPrep Kit de purification de produit PCR</td><td>Sangon</td><td>B518141</td><td>pour la purification de produits PCR</td></tr><tr><td>Acétate</td><td>de sodium Sigma-Aldrich</td><td>S2889</td><td>pour fabriquer un tampon d’acétate de sodium de 100 mM</td></tr><tr><td>Sulfate de sodium&nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>239313</td><td>pour fabriquer un tampon de sulfate de sodium de 100 mM</td></tr><tr><td>T7 Système ARNi RiboMAX Express</td><td>Promega</td><td>P1700</td><td>pour la synthèse d’ARNdb</td></tr><tr><td>ThermoMixer</td><td>Eppendorf</td><td>C</td><td>pour la génération d’ARNdb ou le chauffage de nanoparticules</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sangon</td><td>A501492</td><td>pour fabriquer un</td></tr><tr><td>vortex</td> TAE.<td>IKA</td><td>Vortex 3</td><td>pour préparer des nanoparticules de chitosane/ARNdb</td></tr></tbody></table>

interférence de l’arn larvaire chez le ver à soie bombyx mori par l’administration de nanoparticules de chitosane/arndb

Larval RNA Interference in Silkworm Bombyx mori through Chitosan/dsRNA Nanoparticle Delivery

Pour évaluer l’efficacité de l’ARNi, un gène immunitaire ciblant BmToll9-2 a été choisi pour l’analyse. Le gène BmToll9-2 est bien caractérisé en laboratoire, et le silençage génique par injection d’ARNdb permet d’obtenir des larves plus légères et plus petites dans notre récente publication20. Pour confirmer l’efficacité de l’ARNi par ingestion à travers des nanoparticules de chitosane/ARNdb, des nanoparticules de chitosane ont été utilisées comme contrôle, et l’ARNdb nu a été comparé en même temps.
Par rapport au contrôle, les nanoparticules de chitosane sans ARNdb, l’ARNdb nu ciblant le gène BmToll9-2 ne montre aucun effet de silence. L’alimentation de nanoparticules de chitosane/ARNdb dans le ver à soie inhibe significativement le transcrit, avec un knockdown de 79 % (Figure 1). L’inhibition du transcrit relatif indique que le gène BmToll9-2 a été réduit au silence avec succès par l’ingestion de chitosane/ARNdb.
L’inhibition du gène BmToll9-2 affecte considérablement la croissance du ver à soie. En observant les larves, les larves silencieuses de BmToll9-2 sont plus petites que les larves témoins (figure 2A). Lorsque l’on compare les cocons, les cocons silencieux de BmToll9-2 sont également plus petits (Figure 2B). Les nanoparticules de chitosane/dsRNA montrent des effets réussis de l’ARNi à la fois dans le transcrit et le phénotype chez le ver à soie.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67360/67360fig01v2.jpg"> Figure 1 : Transcrit relatif de BmToll9-2 après ingestion de nanoparticules de chitosane/dsBmToll9-2 dans des larves de B. mori du 5e stade. Les niveaux relatifs d’ARNm de BmToll9-2 chez les larves nourries avec des nanoparticules de chitosane comme contrôle, des nanoparticules d’ARNdb nues et des nanoparticules de chitosane/ARNdb. Les données ont été représentées sous forme de moyennes ±écart-type de trois réplications biologiques. Pour chaque réplication biologique, il y avait trois réplications techniques. Différentes lettres sur les barres indiquent des différences significatives sur la base de l’analyse ANOVA à un facteur. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67360/67360fig01largev2.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67360/67360fig02v2.jpg"> Figure 2 : Observation du phénotype après alimentation avec des nanoparticules de chitosane/dsBmToll9-2. Les nanoparticules de chitosane sont utilisées comme contrôle. (A) L’apparition de larves de vers à soie après l’ingestion de nanoparticules. (B) L’apparition de cocons de vers à soie après l’ingestion de nanoparticules. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67360/67360fig02largev2.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>

Interférence de l’ARN larvaire chez le ver à soie Bombyx mori par l’administration de nanoparticules de chitosane/ARNdb

The silkworm, Bombyx mori, is an important economic insect with thousands of years of history in China. Meanwhile, the silkworm is the model insect of ...

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