Mesure de l’activité enzymatique d’enzymes désubiquitylantes associées à des troubles neurodéveloppementaux au moyen d’un test de clivage de la chaîne d’ubiquitine in vitro

Nous nous intéressons à la définition de la base moléculaire des troubles neurodéveloppementaux associés à des variantes génétiques dans les enzymes du système ubiquitine. Nous utilisons des techniques de pointe pour disséquer les voies de signalisation contrôlées par ces enzymes et pour déterminer l’impact des variantes génétiques sur la biologie des protéines. L’avantage de cette méthode est qu’il s’agit d’une technique indépendante du substrat qui ne nécessite pas de connaissance préalable des substrats régulés par un DUB spécifique.

De cette façon, nous pouvons mesurer directement l’impact de la variance génétique associée aux troubles neurodéveloppementaux sur l’activité catalytique des DUB et suggérer d’éventuels mécanismes pathogènes. Étant donné que les fonctions cellulaires de la plupart des DUB sont mal comprises, notre laboratoire se concentrera sur l’identification des voies de signalisation que ces enzymes médient et sur la façon dont les variantes génétiques associées aux maladies génétiques affectent ces processus. Pour commencer, décongelez 20 microlitres de cellules d’Escherichia coli Rosetta 2 chimiquement compétentes sur de la glace immédiatement avant utilisation.

Ajoutez un à 10 nanogrammes du plasmide d’expression pGEX6P1 USP27X et incubez pendant cinq minutes sur de la glace. Électrocutez les cellules pendant 30 secondes à 42 degrés Celsius dans un bain sec. Ensuite, incubez les cellules sur de la glace pendant deux minutes.

Ajoutez 80 microlitres de milieu SOC à température ambiante dans les cellules. Incuber pendant 60 minutes à 37 degrés Celsius avec une rotation de 200 tr/min dans un agitateur de paillasse à température contrôlée de 19 millimètres. Ensuite, plaquez 50 microlitres de la culture sur une plaque de gélose LB, complétée par du chloramphénicol et de l’ampicilline.

Incuber pendant 20 heures à 37 degrés Celsius, couvercle vers le bas, dans un incubateur à température contrôlée. Choisissez une seule colonie de bactéries transformées et ajoutez-la à 10 millilitres de milieu LB stérile complété par du chloramphénicol et de l’ampicilline. Incuber pendant 20 heures comme indiqué précédemment.

Ajoutez ensuite 10 millilitres de culture de nuit à un litre de milieu antituberculeux complété par du chloramphénicol et de l’ampicilline. Incuber jusqu’à ce que la densité optique à 600 nanomètres atteigne 0,5 à 0,6. Ensuite, ajoutez de l’isopropyl bêta-d-1-thiogalactopyranoside de 50 micromolaires à la culture pour induire l’expression.

Après avoir refroidi l’échantillon à 16 degrés Celsius, incuber pendant 20 heures à 16 degrés Celsius avec une rotation de 200 tr/min. Ensuite, centrifugez les cellules pendant 20 minutes à 3000 G ou plus à quatre degrés Celsius pour granuler les cellules de la culture d’expression. Enfin, conservez les granulés à moins 80 degrés Celsius pendant au moins une heure.

Pour commencer, fixez la colonne d’écoulement par gravité vide dans un support d’autoclave. Remplissez la colonne avec deux à trois millilitres de résine d’agarose gluthathione pour purifier une pastille cellulaire recueillie à partir d’un litre de culture d’expression. Lavez la colonne avec un volume de lit de résine de 20% d’éthanol.

Après avoir lavé la colonne, décongelez la pastille de cellule à quatre degrés Celsius. Ajoutez 30 millilitres de tampon MS500 à la pastille décongelée et incubez avec une rotation douce de bout en bout. Maintenant, sonisez les cellules lysées dans un tube à centrifuger de 50 millilitres sur de la glace jusqu’à ce que le lysat s’écoule librement lorsqu’il est distribué à partir d’une pointe de pipette.

Centrifugez pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius et 20 000 g ou plus pour éliminer le surnageant. Ensuite, décantez le surnageant dans un bécher et chargez le lysat clair sur la colonne. Faites passer le lysat à travers la colonne par écoulement gravitaire tout en recueillant l’écoulement.

Ensuite, lavez la colonne avec au moins deux volumes de lit de résine de tampon de lavage MS500 et collectez le flux de lavage en fractions de cinq millilitres. Ensuite, ajoutez un microlitre de chaque fraction à 100 microlitres de réactif Bradford pour vérifier la présence de protéines. Récupérez la protéine en faisant passer le tampon d’élusion MS500 dans la colonne et en recueillant cinq fractions d’élution de quelques millilitres.

Pour précipiter la protéine, ajoutez deux volumes de sulfate d’ammonium à quatre molaires à l’éluat et retournez doucement le tube jusqu’à ce qu’il devienne trouble. Centrifuger pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius et 20 000 G ou plus. Retirer le surnageant après chaque centrifugation sans perturber la pastille de protéine.

Ensuite, dissolvez à nouveau la protéine dans le tampon MS500 complété par 25% de glycérol avant de la stocker. Préparez 10 microlitres d’USP27X purifié étiqueté GST dans un tampon d’activation de l’enzyme de désubiquitylation pour chaque point temporel de chaque enzyme de désubiquitylation. Avant d’ajouter des chaînes d’ubiquitine, ajoutez sept microlitres de tampon de chargement SDS-PAGE à l’échantillon de temps zéro pour empêcher la réaction de désubiquitylation de commencer.

À chaque point temporel de chaque enzyme de désubiquitylation, ajoutez 375 nanogrammes de chaînes de di-ubiquitine liées à K63 diluées dans 10 microlitres de tampon d’activation enzymatique. Incuber les tubes à 30 degrés Celsius, en arrêtant chaque point temporel en ajoutant sept microlitres de tampon de chargement SDS-PAGE. Effectuez SDS-PAGE à l’aide d’un gel de gradient de quatre à 12 %.

Le type sauvage USP27X a clivé les chaînes de di-ubiquitine liées à K63 en mono-ubiquitine après une heure d’incubation. Les variances F313V, Y381H et S404N associées à XLID-105 n’ont pas clivé les chaînes de di-ubiquitine liées à K63 après une heure d’incubation.