Name: Mesure de l’activité enzymatique d’enzymes désubiquitylantes associées à des troubles neurodéveloppementaux au moyen d’un test de clivage de la chaîne d’ubiquitine in vitro (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-27T14:55:00.000+00:00
Duration: 7 min 5 s
Description: Découvrez comment mesurer l'activité enzymatique des DUBs associés aux troubles neurodéveloppementaux par purification de protéines recombinantes et tests de clivage de chaînes d'ubiquitine. Cette méthode permet d'évaluer directement l'impact des variants génétiques sur l'activité catalytique.

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Le protocole suivant peut être adapté aux protéines recombinantes en utilisant divers marqueurs d’affinité exprimés dans différentes souches de cellules compétentes. Selon la protéine exprimée, les conditions de culture et d’expression pendant la nuit peuvent nécessiter l’optimisation de la DO600 au niveau de l’induction de l’expression, du temps d’expression, de la température d’expression et de la concentration IPTG. La figure 1 illustre une vue d’ensemble du protocole. Les détails des réactifs et de l’équipement utilisés dans cette étude sont énumérés dans la table des matériaux.
1. Transformation de cellules E. coli Rosetta 2 compétentes avec le plasmide d’expression recombinant GST-USP27X
REMARQUE : Pour maintenir la stérilité de la culture bactérienne, effectuez des étapes où les récipients de milieu sont ouverts sous une flamme de bec Bunsen. Pour permettre un transfert optimal de l’oxygène, effectuez l’agitation de la culture bactérienne dans un agitateur de paillasse à température contrôlée avec une orbite de 19 mm à 50 mm et une vitesse de 200 tr/min29.
<ol>
	<li>Décongeler 20 μL de cellules E. coli Rosetta 2 chimiquement compétentes sur de la glace immédiatement avant utilisation. Ajoutez 1 à 10 ng du plasmide d’expression pGEX6P1-USP27X (codant pour la glutathion-S-transférase N-terminale (GST)30 marquée USP27X et contenant une résistance à l’ampicilline) et incubez 5 min sur de la glace.</li>
	<li>Choc thermique pendant 30 s à 42 °C dans un bain sec. Incuber sur glace pendant 2 min.</li>
	<li>Ajouter 80 μL de fluide SOC à température ambiante (RT). Incuber pendant 60 min à 37 °C avec une rotation de 200 tr/min dans un agitateur de paillasse à température contrôlée de 19 mm.</li>
	<li>Plaque de 50 μL de culture sur une plaque de gélose LB complétée par 25 μg/L de chloramphénicol et 50 μg/L d’ampicilline. Incuber pendant 20 h à 37 °C, couvercle vers le bas, dans un incubateur à température contrôlée.</li>
</ol>
2. Expression bactérienne nocturne de la protéine recombinante à partir du plasmide d’expression
REMARQUES : Pour maintenir la stérilité de la culture bactérienne, effectuez des étapes où les récipients de milieu sont ouverts sous une flamme de bec Bunsen. Pour permettre un transfert optimal de l’oxygène, effectuez l’agitation de la culture bactérienne dans un agitateur de paillasse à température contrôlée avec une orbite de 19 mm à 50 mm et une vitesse de 200 tr/min29. Mesurez la culture OD600 à l’aide d’un spectrophotomètre.
<ol>
	<li>Préparez 1 L de milieu Terrific Broth (TB) en ajoutant 47,6 g de poudre de TB à 1 L d’eau ultrapure avec 0,4 % de glycérol dans une fiole de culture à chicanes de 2 L. Autoclave moyen pendant 30 min et refroidir à RT.</li>
	<li>Prélever une seule colonie de bactéries transformées et l’ajouter à 10 ml de milieu LB stérile complété par 25 μg/L de chloramphénicol et 50 μg/L d’ampicilline. Incuber pendant 20 h à 37 °C avec une rotation de 200 tr/min dans un agitateur de paillasse à température contrôlée de 19 mm.</li>
	<li>Ajouter 10 mL de culture de nuit à 1 L de milieu TB complété par 25 μg/L de chloramphénicol et 50 μg/L d’ampicilline (rapport de 1:100 entre la culture initiale et la culture d’expression). Incuber à 37 °C avec une rotation de 200 tr/min dans un agitateur de paillasse à température contrôlée de 19 mm jusqu’à ce que la quantité de culture OD600 soit comprise entre 0,5 et 0,6.</li>
	<li>Ajouter 50 μM d’IPTG à la culture pour induire l’expression, refroidir à 16 °C et incuber pendant 20 h à 16 °C avec une rotation de 200 tr/min.</li>
	<li>Cellules en granulés issues de la culture d’expression par centrifugation pendant 20 min à ≥3 000 x g et 4 °C. Conservez le granulé à -80 °C pendant au moins 1 h. REMARQUE : À ce stade, l’expérience peut être interrompue et recommencée plus tard (de préférence la même semaine). Le granulé peut être stocké à long terme à -80 °C.</li>
</ol>
3. Purification des protéines par colonne d’affinité gravité-flux
REMARQUE : Les tampons de résine, de liaison, de lavage, d’élution et de stockage appropriés pour chaque purification dépendront de la protéine recombinante purifiée. Prélevez des échantillons de la pastille cellulaire, du surnageant, de l’écoulement, des fractions de lavage et des fractions d’élution dans le tampon SDS-PAGE. Effectuer la coloration SDS-PAGE et Coomassie des échantillons afin d’évaluer le succès de la purification. Effectuer la purification à 4 °C et manipuler les fractions sur glace. Le clivage des marqueurs protéiques peut être effectué sur ou hors de la colonne à l’aide de la protéase appropriée pour cibler le site de clivage spécifique à la protéase pertinent.
<ol>
	<li>Fixez la colonne d’écoulement par gravité vide dans le support de l’autoclave et remplissez-la de résine de glutathion et d’agarose. Utilisez 2 à 3 ml de résine pour purifier une pastille cellulaire recueillie à partir de 1 L de culture d’expression.</li>
	<li>Lavez la colonne avec un volume de lit de résine à 20 % d’éthanol. Laver la colonne 3 fois avec un volume de lit de résine de tampon MS500 (20 mM de Tris pH 7,5, 500 mM de NaCl, 0,5 mM de TCEP). Arrêtez la colonne pour que la résine reste recouverte d’un tampon pour éviter le dessèchement lors de la préparation de la pastille de cellule.</li>
	<li>Décongeler la pastille cellulaire à 4 °C. Ajouter 30 mL de tampon MS500 (20 mM de Tris pH 7,5, 500 mM de NaCl, 0,5 mM de TCEP, 60 mg de lysozyme et un comprimé d’inhibiteur de protéase) à la pastille décongelée. Laisser reposer pendant 30 min à 4 °C avec une rotation douce d’un bout à l’autre.</li>
	<li>Sonicate lyse les cellules dans un tube à centrifuger de 50 mL ou un bécher métallique sur de la glace jusqu’à ce que le lysat s’écoule librement lorsqu’il est distribué à partir d’une pointe de pipette. Centrifuger pendant 30 min à 4 °C et ≥20 000 x g pour éliminer le surnageant. REMARQUE : Déterminez les paramètres du sonicateur de manière empirique. Réglez le sonicateur de telle sorte qu’un temps total de 120 s soit suffisant pour réduire le lysat visqueux en un liquide fluide et transparent.</li>
	<li>Décantez le surnageant dans un bécher et chargez le lysat dégagé sur la colonne. Faites passer le lysat à travers la colonne par écoulement par gravité tout en recueillant le flux. Chargez la colonne avec le flux collecté et faites-le passer à travers la colonne.</li>
	<li>Laver la colonne avec au moins deux volumes de tampon de lavage MS500 (20 mM de Tris pH 7,5, 500 mM de NaCl, 0,5 mM de TCEP) 5 fois. Recueillir le flux de lavage en fractions de 5 ml. Ajoutez 1 μL de chaque fraction à 100 μL de réactif Bradford pour vérifier visuellement la présence de protéines. Lavez jusqu’à ce qu’il n’y ait plus de protéines non liées lors du dernier lavage, en ajoutant des étapes de lavage supplémentaires si nécessaire.</li>
	<li>Récupérez la protéine en faisant passer le tampon d’élution MS500 (tampon MS500 complété par 10 mM de glutathion et 10 mM de NaOH) à travers la colonne, en collectant 5 mL de fractions d’élution. Vérifiez la présence de protéines en ajoutant 1 μL d’éluat à 100 μL de réactif Bradford. Arrêtez de collecter des fractions lorsque le réactif de Bradford n’indique plus la présence de protéines.</li>
	<li>Effectuer l’échange de tampon par précipitation et centrifugation. Précipiter la protéine en ajoutant 2 volumes de 4 M de sulfate d’ammonium à l’éluat, en l’inversant doucement jusqu’à ce qu’il soit trouble, puis en centrifugeant pendant 30 minutes à 4 °C et ≥20 000 x g , puis à nouveau pendant 5 minutes supplémentaires. Retirer le surnageant après chaque centrifugation sans perturber la pastille de protéine.</li>
	<li>Redissolvez et stockez les protéines dans MS500 complété par 25% de glycérol. Conservez les granulés de protéines ou les protéines dans un tampon de stockage à -80 °C.</li>
</ol>
4. Essai in vitro de clivage de la chaîne d’ubiquitine
REMARQUE : Sélectionner la longueur de la chaîne d’ubiquitine et les types de liaison en fonction de la spécificité DUB décrite dans les rapports précédents31 ou déterminée empiriquement. Si nécessaire, ce protocole pourrait être utilisé pour tester l’activité de la DUB de type sauvage d’intérêt sur un panel de chaînes d’ubiquitine disponibles dans le commerce de longueur et de type de liaison définis. Une quantité de chaîne de di-ubiquitine de 375-750 ng et une concentration de DUB de 1-2 μM peuvent être utilisées comme points de départ pour le test27.
<ol>
	<li>Préparez 10 tampons d’activation DUB (500 mM de Tris-HCl pH 7,5, 500 mM de NaCl et 100 mM de TCEP).</li>
	<li>Pour chaque point temporel de chaque DUB, préparez un total de 10 μL de 2 μM de GST-USP27X purifié dans 1 tampon d’activation DUB (mélange DUB). Préparez des mixages maîtres et divisez-les en points temporels.</li>
	<li>Incuber le mélange DUB pendant 10 min à RT.</li>
	<li>Ajoutez 7 μL de tampon de chargement SDS-PAGE au temps 0 avant d’ajouter des chaînes d’ubiquitine pour empêcher la réaction de désubiquitylation de démarrer.</li>
	<li>À chaque point temporel de chaque DUB, ajoutez 375 ng de chaînes de di-ubiquitine K-63 diluées dans 10 μL 1x tampon d’activation DUB. Le volume total est de 20 μL par réaction.</li>
	<li>Incuber les tubes à 30 °C, en arrêtant chaque point temporel avec 7 μL de tampon de chargement SDS-PAGE.</li>
	<li>Effectuer SDS-PAGE avec un gel à gradient de 4 % à 12 % et l’immunoblot 7,32 pour l’ubiquitine et l’USP27X afin d’analyser le changement de la présence de mono-ubiquitine à des points temporels sélectionnés.</li>
</ol>
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67367/67367fig01v2.jpg"> 
Figure 1 : Schéma du plan d’étude. (A) Transformation de cellules E. coli compétentes avec un plasmide d’expression de protéines recombinantes. (B) Expression bactérienne nocturne de la protéine deubiquitylase recombinante. (C) Purification protéique de la deubiquitylase recombinante à l’aide d’une colonne d’affinité gravité-flux. (D) Essai in vitro de clivage de la chaîne d’ubiquitine pour évaluer l’activité de désubiquitylation. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67367/67367fig01largev2.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>

<meta charset="utf8"></head><body>Évaluation des variants DUB dans les troubles neurodéveloppementaux à l’aide d’un test de clivage

<ol><li>Morris-Rosendahl, D. J., Crocq, M. -A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurodevelopmental+disorders%3A+the+history+and+future+of+a+diagnostic+concept%5BTitle%5D)+AND+%22Dialogues+Clin+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neurodevelopmental disorders: the history and future of a diagnostic concept.</a> Dialogues Clin Neurosci. 22 (1), 65-72 (2020).</li>
<li>Ebstein, F., Küry, S., Papendorf, J. J., Krüger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurodevelopmental+disorders+%28NDD%29+caused+by+genomic+alterations+of+the+ubiquitin-proteasome+system+%28UPS%29%3A+the+possible+contribution+of+immune+dysregulation+to+disease+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Mol+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neurodevelopmental disorders (NDD) caused by genomic alterations of the ubiquitin-proteasome system (UPS): the possible contribution of immune dysregulation to disease pathogenesis.</a> Front Mol Neurosci. 14, 733012(2021).</li>
<li>Hershko, A., Ciechanover, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ubiquitin+system%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">The ubiquitin system.</a> Annu Rev Biochem. 67 (10), 425-479 (1998).</li>
<li>Pickart, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+underlying+ubiquitination%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Mechanisms underlying ubiquitination.</a> Annu Rev Biochem. 70 (1), 503-533 (2001).</li>
<li>Komander, D., Clague, M. J., Urbé, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breaking+the+chains%3A+structure+and+function+of+the+deubiquitinases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Breaking the chains: structure and function of the deubiquitinases.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 10 (8), 550-563 (2009).</li>
<li>Yau, R., Rape, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+increasing+complexity+of+the+ubiquitin+code%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The increasing complexity of the ubiquitin code.</a> Nat Cell Biol. 18 (6), 579-586 (2016).</li>
<li>Koch, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((USP27X+variants+underlying+X-linked+intellectual+disability+disrupt+protein+function+via+distinct+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Sci+Alliance%22%5BJournal%5D)">USP27X variants underlying X-linked intellectual disability disrupt protein function via distinct mechanisms.</a> Life Sci Alliance. 7 (3), e202302258(2024).</li>
<li>Hao, Y. -H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((USP7+acts+as+a+molecular+rheostat+to+promote+WASH-dependent+endosomal+protein+recycling+and+is+mutated+in+a+human+neurodevelopmental+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">USP7 acts as a molecular rheostat to promote WASH-dependent endosomal protein recycling and is mutated in a human neurodevelopmental disorder.</a> Mol Cell. 59 (6), 956-969 (2015).</li>
<li>Fountain, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenic+variants+in+USP7+cause+a+neurodevelopmental+disorder+with+speech+delays%2C+altered+behavior%2C+and+neurologic+anomalies%5BTitle%5D)+AND+%22Genet+Med%22%5BJournal%5D)">Pathogenic variants in USP7 cause a neurodevelopmental disorder with speech delays, altered behavior, and neurologic anomalies.</a> Genet Med. 21 (8), 1797-1807 (2019).</li>
<li>Santiago-Sim, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biallelic+variants+in+OTUD6B+cause+an+intellectual+disability+syndrome+associated+with+seizures+and+dysmorphic+features%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">Biallelic variants in OTUD6B cause an intellectual disability syndrome associated with seizures and dysmorphic features.</a> Am J Hum Genet. 100 (4), 676-688 (2017).</li>
<li>Beck, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linkage-specific+deubiquitylation+by+OTUD5+defines+an+embryonic+pathway+intolerant+to+genomic+variation%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Adv%22%5BJournal%5D)">Linkage-specific deubiquitylation by OTUD5 defines an embryonic pathway intolerant to genomic variation.</a> Sci Adv. 7 (4), eabe2116(2021).</li>
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<li>Hadari, T., Warms, J. V. B., Rose, I. A., Hershko, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+ubiquitin+C-terminal+isopeptidase+that+acts+on+polyubiquitin+chains%3A+Role+in+protein+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">A ubiquitin C-terminal isopeptidase that acts on polyubiquitin chains: Role in protein degradation.</a> J Biol Chem. 267 (2), 719-727 (1992).</li>
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<li>Ritorto, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+of+DUB+activity+and+specificity+by+MALDI-TOF+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Screening of DUB activity and specificity by MALDI-TOF mass spectrometry.</a> Nat Commun. 5, 4763(2014).</li>
<li>Bustos, F., Bustos, F. Immunoblotting using precast gels. , protocols.io (2024).</li>
<li>Wingfield, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overview+of+the+purification+of+recombinant+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">Overview of the purification of recombinant proteins.</a> Curr Protoc Protein Sci. 80, 6.1.1-6.1.35 (2015).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Amersham Protran 0.45 NC 200 mm &times ; 200 mm 25/PK</td><td>Cytiva</td><td>10600041</td><td></td></tr><tr><td>Sulfate d’ammonium</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC205872500</td><td></td></tr><tr><td>Ampicilline</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1760 25</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Ubiquitine (Souris monoclonale)</td><td>Biolegend</td><td>Cat# 646302, RRID :AB_1659269</td><td>(WB : 1:1000)</td></tr><tr><td>Anti-GST (Mouton polyclonal)</td><td>MRC-PPU Réactifs et services</td><td>Cat# S902A Troisième purge</td> <td>(WB : 1:1000) https://mrcppureagents.dundee.ac.uk/</td></tr> <tr><td>Fioles de culture à chicanes 2 L</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-042-5N</td><td></td></tr><tr><td>Bradford Reagent</td><td>Millipore Sigma</td><td>B6916-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Chloramphénicol</td><td>Gold Biotechnology</td><td>C-105-25</td><td></td></tr><tr><td>Complete, Inhibiteur de protéase</td><td>Comprimés Millipore Sigma</td><td></td><td></td>5056489001</tr><tr><td>Econo-Column 1.5 &times ; 5 cm</td><td>Bio-Rad</td><td>7371507</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf ThermoMixer F1.5&nbsp ;</td><td>Eppendorf</td><td>5384000020</td><td></td></tr><tr><td>Excel</td><td>Microsoft</td><td></td><td>https://www.microsoft.com/en-us/microsoft-365/excel</td></tr><tr><td>Glycérol</td><td>Genesee Scientific</td><td>18-205</td><td></td></tr><tr><td>Illustrator</td><td>Adobe</td><td></td><td>https://www.adobe.com/products/illustrator.html</td></tr><tr><td>Image Studio</td><td>LI-COR Biosciences</td><td></td><td>https://www.licor.com/bio/image-studio/ </td></tr><tr><td>Inkscape</td><td>Inkscape</td><td></td><td>https://inkscape.org/</td></tr> <tr><td>Invitrogen 4-12 % NuPAGE 1mm 12 well gel</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NP0322BOX</td><td></td></tr><tr><td>IPTG (Isopropyl-b-D-Thiogalactopyranoside)</td><td>Genesee Scientific</td><td>20-109</td><td></td></tr><tr><td>IRDye 800CW Donkey anti-Goat IgG Anticorps secondaire</td><td>LI-COR Biosciences</td><td>Cat# 926-32214</td><td>(WB : 1:10000)</td></tr><tr><td>IRDye 800CW Donkey anti-Mouse IgG Anticorps secondaire</td><td>LI-COR Biosciences</td><td>Cat# 926-32212</td><td>(WB : 1:10000)</td></tr><tr><td>Isotemp Digital Dry Bath</td><td>Fisher Scientific</td><td>88860022</td><td></td></tr><tr><td>K63 Di-Ubiquitin</td><td>South Bay Bio LLC</td><td>SBB-UP0072</td><td></td></tr><tr><td>LB Agar</td><td>Genesee Scientific</td><td>11-119</td><td></td></tr><tr><td>LB Broth</td><td>Genesee Scientific</td><td>11-118</td><td></td></tr><tr><td>Lysozyme</td><td>Gold Biotechnology</td><td>L-040-100</td><td></td></tr><tr><td>MaxQ 4000 Agitateur orbital de paillasse</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SHKE4000-7 MES-SDS</td><td></td></tr><tr><td>Tampon courant</td><td>Boston Bioproducts Inc</td><td>BP-177</td><td></td></tr><tr><td>Mini Tube</td><td>Rotator Fisher Scientific</td><td>88-861-051</td><td></td></tr><tr><td>NuPage LDS Tampon d’échantillon 4x</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NP0007</td><td></td></tr><tr><td>Odyssée&nbsp ; Fc Imager</td><td>LI-COR Biosciences</td><td>43214</td><td></td></tr><tr><td>PageRuler Plus Ladder</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>26620</td><td></td></tr><tr><td>pGEX6P1 humain USP27X</td><td>MRC-PPU Réactifs et services</td><td>DU21193</td><td>https://mrcppureagents.dundee.ac.uk/</td></tr> <tr><td>pGEX6P1 humain USP27X F313V</td><td>Addgene</td><td>225715</td><td>Koch et at 2024 (PMID : 38182161)</td></tr><tr><td>pGEX6P1 humain USP27X S404N</td><td>Addgene</td><td>225717</td><td>Koch et at 2024 (PMID : 38182161)</td></tr><tr><td>pGEX6P1 human USP27X Y381H</td><td>Addgene</td><td>225716</td><td>Koch et at 2024 (PMID : 38182161)</td></tr><tr><td>Pierce Glutathione Agarose</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16100</td><td></td></tr><tr><td>PMSF (Phenylmethylsulfonyl fluorure)</td><td>Gold Biotechnology</td><td>P-470-10</td><td></td></tr><tr><td>Polysorbate 20 (Tween 20)</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC233360010</td><td></td></tr><tr><td>Rosetta 2 Cellules Compétentes</td><td>Millipore Sigma</td><td>71402-M</td><td></td></tr><tr><td>SimplyBlue SafeStain</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>LC6060</td><td></td></tr><tr><td>SmartSpec 3000</td><td>Bio-Rad</td><td>170-2501</td><td></td></tr><tr><td>SOC medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15544034</td> Chlorure de <td></td></tr><tr><td>sodium</td><td>Genesee Scientific</td><td>18-216</td><td></td></tr><tr><td>Sonifier 250</td><td>Branson</td><td>100-132-135</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse Sorvall RC 6 Plus</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>46910</td><td></td></tr><tr><td>TCEP (chlorhydrate de tris-(carboxyéthyl)phosphine)</td><td>Gold Biotechnology</td><td>TCEP10</td><td></td></tr><tr><td>Formidable bouillon en poudre</td><td>Genesee Scientific</td><td>18-225</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Genesee Scientific</td><td>18-146</td><td></td></tr><tr><td>Mini-cellule XCell SureLock et module de transfert XCell II&nbsp ;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EI0002</td><td></td></tr></tbody></table>

mesure de l’activité enzymatique d’enzymes désubiquitylantes associées à des troubles neurodéveloppementaux au moyen d’un test de clivage de la chaîne d’ubiquitine in vitro

Measuring Enzymatic Activity of Neurodevelopmental Disorder-Associated Deubiquitylating Enzymes via an In Vitro Ubiquitin Chain Cleavage Assay

Pour déterminer l’impact des variants associés à la XLID105 sur l’activité catalytique de l’USP27X, les protéines USP27X de type sauvage marquées GST et les protéines USP27X des variants F313V, Y381H et S404N associées à la XLID105 ont été purifiées à partir de bactéries. Ces variantes sont situées dans le domaine catalytique USP de l’USP27X (Figure 2A). Étant donné qu’USP27X avait déjà été signalé pour cliver les chaînes d’ubiquitineK63 31, l’USP27X de type sauvage et les variantes associées à la XLID105 les protéines USP27V F313V, Y381H et S404N ont été incubées avec des chaînes de di-ubiquitine liées à K63 pendant 1 h. Ces échantillons ont été séparés par SDS-PAGE32, et les protéines ubiquitine et USP27X ont été analysées par immunoblot. L’USP27X de type sauvage induit le clivage de la di-ubiquitine, générant de la mono-ubiquitine (Figure 2B et Figure supplémentaire 1). Les protéines variantes F313V, Y381H et S404N USP27X associées à XLID105 n’ont pas clivé ces chaînes. Étant donné que les variants F313V, Y381H et S404N perturbent l’activité catalytique de l’USP27X, la perturbation fonctionnelle de l’USP27X semble être le principal mécanisme sous-jacent à l’XLID1057. Des quantifications supplémentaires et des expériences complémentaires ont déjà été signalées7.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67367/67367fig02v2.jpg"> 
Figure 2 : Impact des variants XLID105 sur l’activité de désubiquitylation de l’USP27X. (A) Schéma de la structure de la protéine USP27X humaine, montrant le nombre de résidus et l’emplacement des variants XLID105 évalués dans le domaine USP (violet). (B) Les variantes USP27X et XLID105 de type sauvage marquées GST (F313V, Y381H et S404N) ont été incubées avec des chaînes de di-ubiquitine K63 pendant les temps indiqués. L’analyse immunoblot a été effectuée à l’aide d’anticorps anti-GST (USP27X) et d’ubiquitine. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67367/67367fig02largev2.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
Figure supplémentaire 1 : Taches non rognées de la figure 2B. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67367/R1%20Koch%202024%20Jove%20supplemental%20Figure.zip" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>

Mesure de l’activité enzymatique d’enzymes désubiquitylantes associées à des troubles neurodéveloppementaux au moyen d’un test de clivage de la chaîne d’ubiquitine in vitro

Neurodevelopmental disorders (NDDs) are associated with impairments in nervous system function but often remain poorly understood at the molecular level. ...

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L'ubiquitination est une modification post-traductionnelle clés réalisée par un ensemble de trois enzymes. Des mutations de gènes impliqués dans cette modification sont associés à différentes pathologies humaines. Ici, nous décrivons les protocoles pour détecter l'ubiquitination de protéines dans des cellules en...

La détection des protéines ubiquitination

Le protocole actuel détaille un procédé pour mesurer l'activité des enzymes fonctionnellement homologue désubiquitination. Sondes spécialisées modifier de manière covalente l'enzyme et permettent de détecter. Cette méthode a le potentiel d'identifier de nouvelles cibles thérapeutiques.

Méthode de mesure de l&#39;activité des enzymes de dé-ubiquitination dans des lignées cellulaires et des échantillons de tissus

L'ubiquitination est une modification post-traductionnelle qui joue un rôle important dans les processus cellulaires et est étroitement coordonnée par la désubiquitination. Les défauts dans les deux réactions sous-tendent les pathologies humaines. Nous fournissons des protocoles pour mener la réaction d'ubiquitination et de deubiquitination in vitro utilisant des composants purifiés.

In Vitro Ubiquitination and Deubiquitination Assays of Nucleosomal Histones In Vitro Ubiquitination and Deubiquitination Assays of Nucleosomal Histones In Vitro Ubiquitination and Deubiquitination Assays of Nucleosomal Histones In Vitro

Ce protocole est conçu pour quantifier efficacement l'activité du système ubiquitine-protéasome (UPS) dans différents compartiments cellulaires du cerveau des rongeurs. Les utilisateurs sont en mesure d'examiner le fonctionnement de l'UPS en fractions nucléaires, cytoplasmiques et synaptiques chez le même animal, ce qui réduit le temps et le nombre d'animaux nécessaires pour effectuer ces analyses complexes.

Quantification de l'activité subcellulaire ubiquitine-protéasome dans le cerveau des rongeurs

Cette méthode décrit l’évaluation des changements mondiaux dans la topologie de chaîne d’ubiquitine. L’évaluation est effectuée par l’application d’une approche protéomique ciblée basée sur la spectrométrie de masse.

Analyse en chaîne de l’ubiquitine par surveillance parallèle des réactions

La présente étude fournit des protocoles détaillés de dosage d’ubiquitylation in vitro pour l’analyse de l’activité catalytique de l’ubiquitine ligase E3. Les protéines recombinantes ont été exprimées à l’aide de systèmes procaryotes tels que la culture d’Escherichia coli.

In vitro Analyse de la fonction E3 Ubiquitin Ligase

Une méthode simple et évolutive a été développée pour évaluer la signification fonctionnelle des variantes faux-sens dans Ube3a, un gène dont la perte et le gain de fonction sont liés à la fois au syndrome d’Angelman et au trouble du spectre autistique.

Une méthode évolutive basée sur des cellules pour l’évaluation fonctionnelle des variantes d’Ube3a

L’expérience utilisée ici montre une méthode d’amarrage moléculaire combinée à des technologies de sonde pour prédire et valider l’interaction entre de petites molécules de la médecine traditionnelle chinoise et des cibles protéiques.

Criblage de composés de médecine traditionnelle chinoise pour inhiber l’activité d’UCHL3 sur la base de la technologie des sondes enzymatiques d’amarrage moléculaire et de désubiquitination

Un test à haut débit pour le criblage enzymatique est décrit. Ce kit de dosage multiplexé prêt à l’emploi comprend des substrats pré-choisis de l’iomasseB hromogèneC (CPH) et des substrats complexes Inon solubles de l’iomasse Bhromogène (ICB). Les enzymes cibles sont les endoenzymes et les protéases qui dégradent les polysaccharides.

Criblage à haut débit d&#39;Enzymes Glucides dégradant Utilisation Novel Insoluble chromogénique Substrat Assay Kits

Kinase cycline-dépendante 1 (Cdk1) intervient dans la phase G2 du cycle cellulaire et régule les nombreuses voies cellulaires. Ici, nous présentons un protocole de test in vitro kinase Cdk1, qui permet l’identification des sites de phosphorylation de Cdk1 spécifiques pour l’établissement de cibles cellulaires de cette kinase importante.

Identification de la Kinase cycline-dépendante 1 Sites de Phosphorylation spécifique par une Kinase In Vitro d’analyse

Découvrez comment mesurer l'activité enzymatique des DUBs associés aux troubles neurodéveloppementaux par purification de protéines recombinantes et tests de clivage de chaînes d'ubiquitine. Cette méthode permet d'évaluer directement l'impact des variants génétiques sur l'activité catalytique.

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Mesure de l’activité enzymatique d’enzymes désubiquitylantes associées à des troubles neurodéveloppementaux au moyen d’un test de clivage de la chaîne d’ubiquitine in vitro

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