Un modèle murin de transformation hémorragique induite par une hyperglycémie aiguë combinée à une ischémie focale transitoire

Dans la recherche actuelle, nous visons à fournir un protocole complet et détaillé pour établir un modèle animal hautement reproductible de transformation radicale humaine en utilisant la reperfusion d’occlusion de l’artère cérébrale moyenne chez des souris C57BL/6 atteintes d’hyperglycémie aiguë.

Par rapport à d’autres techniques, notre protocole présente une bonne répétabilité, une grande stabilité et une faible mortalité animale, ce qui le rend adapté à une utilisation généralisée dans la recherche préclinique sur la transformation hémorragique.

À l’avenir, nous nous concentrerons sur l’étude de l’impact de la transformation hémorragique sur les phénomènes neurologiques et sur l’exploration du mécanisme sous-jacent.

[Instructeur] Pour commencer, essuyez la plate-forme chirurgicale et la zone de travail environnante avec de l’éthanol à 75 %. Allumez l’interrupteur de chauffage et réglez la température à 37 degrés Celsius. Déplacez la souris anesthésiée sur la plate-forme chirurgicale en position couchée et fixez ses membres à l’aide de ruban adhésif. Ensuite, 15 minutes avant l’intervention chirurgicale, administrez par voie intrapéritonéale du glucose à 30 % ou une solution saline normale aux souris. À l’aide d’un scalpel, faites une incision horizontale avec une ouverture de 1,5 centimètre le long de la ligne médiane du cou. Effectuez une dissection contondante dans la zone du triangle inversé pour identifier et séparer l’artère carotide commune gauche. À l’aide d’une pince ophtalmique, disséquez le nerf vague adjacent à l’artère carotide commune et le tissu muqueux entourant les vaisseaux sanguins. Avec une suture absorbable à l’acide polyglycolique 5-0, faites une sonnerie sur l’artère carotide commune, en gardant la suture non tendue. Ensuite, séparez-vous vers le haut le long de l’artère carotide commune. Maintenant, séparez la bifurcation pour exposer complètement l’artère carotide externe et interne. Enroulez et attachez fermement une suture absorbable d’acide polyglycolique 5-0 autour de l’artère carotide externe distalement à partir de la bifurcation. Ensuite, à l’aide de deux pinces artérielles micro serrafines légères, clampez temporairement l’artère carotide commune et l’artère carotide interne pour bloquer le flux sanguin. Ensuite, étirez l’attache de suture sur l’artère carotide externe distale et l’artère carotide commune pour redresser le segment de l’artère carotide externe. Maintenant, utilisez des micro-ciseaux pour faire une petite incision entre les deux attaches de suture sur l’artère carotide externe. Insérez une suture monofilament recouverte de silicone de 30 millimètres de long dans l’artère carotide externe. Enroulez et attachez légèrement une deuxième suture absorbable à l’acide polyglycolique 5-0 sur l’artère carotide externe près de la bifurcation pour empêcher la suture monofilament de reculer. Ensuite, coupez complètement l’artère carotide externe distale à la ligature permanente et retirez la pince à artère de l’artère carotide interne. Ensuite, retirez la suture à la bifurcation de l’artère carotide commune. Rétractez et tournez avec précaution le moignon de l’artère carotide externe. Ajustez la direction de la suture et insérez-la à 9 à 10 millimètres de la bifurcation de l’artère carotide commune dans l’artère carotide interne pour bloquer l’artère cérébrale moyenne. Ensuite, resserrez la deuxième suture absorbable par l’acide polyglycolique autour de l’artère carotide externe et retirez la pince artérielle de l’artère carotide commune. Après avoir ré-anesthésié la souris, à l’aide d’une pince artérielle microclip, clampez l’artère carotide commune. Rétractez partiellement le monofilament de l’artère carotide interne jusqu’à ce que l’extrémité recouverte de silicium devienne visible à travers l’artère carotide interne. Ensuite, placez une autre pince d’artère à microclip sur l’artère carotide interne au-dessus de l’extrémité recouverte de silicone. Retirez complètement le monofilament et légez étroitement le moignon de l’artère carotide externe. Enfin, retirez la pince artérielle microclip de l’artère carotide interne et de l’artère carotide commune respectivement. Pour commencer, essuyez la queue de la souris avec une boule de coton imbibée d’alcool pour rendre la veine de la queue complètement hyperémique. À l’aide de ciseaux chirurgicaux, coupez le bout de la queue d’un à deux millimètres. Pressez doucement le long de la racine de la queue jusqu’à la pointe pour faciliter la circulation sanguine hors de l’incision. Ensuite, positionnez le réservoir d’absorption d’échantillon du papier réactif sur le bord de la gouttelette de sang. Lisez la lecture du lecteur de glycémie et notez le résultat. Pour la mesure du débit sanguin cérébral, tenez la pointe de la sonde de débitmétrie laser Doppler perpendiculairement à la surface du crâne pariétal gauche jusqu’à ce qu’un flux stable soit lu, et enregistrez cette valeur. Après avoir retiré le cerveau de la souris MCAO euthanasiée, placez le tissu cérébral dans une matrice cérébrale de rongeur et coupez-le en tranches coronales de deux millimètres. Transférez les tranches dans une plaque à 24 puits et incuberez-les avec une solution de chlorure de 2,3,5-triphényltétrazolium à 2 % à 37 degrés Celsius pendant 15 minutes. Ensuite, découpez les sections de tissu de la plaque à 24 puits à l’aide d’une pince incurvée et disposez-les sur la plaque de balayage en verre. Colorez la tranche de cerveau fixe avec une solution d’hématoxyline pendant trois minutes. Différenciez-le en immergeant la tranche dans de l’alcool à 5 % d’acide chlorhydrique pendant cinq secondes. Ensuite, déshydratez et hyalisez la tranche à l’aide de solutions d’éthanol dégradé et de xylène. Montez la section avec des résines neutres. 23 heures après l’obtention du MCAO, injectez la solution d’Evans Blue à 2 % dans la souris et récoltez le cerveau. Après avoir homogénéisé et centrifugé le tissu, transférez le liquide surnageant dans un autre tube à centrifuger et diluez-le quatre fois avec de l’éthanol. Mesurer l’absorbance du liquide surnageant à 620 nanomètres à l’aide d’un spectrophotomètre. Injectez le FITC-dextran dans la veine de la queue 24 heures après l’ACMC et laissez-le circuler dans le sang pendant 10 minutes. Après avoir fixé le tissu cérébral, enfoncez le tissu cérébral à l’aide d’un composé à température de coupe optimale et coupez-le en sections de 30 micromètres d’épaisseur. Transférez les coupes sur une lame de microscope à l’aide d’une boucle d’inoculation, en vous assurant qu’elles adhèrent à la surface de la lame. Montez les coupes de tissu cérébral à l’aide d’un support de montage contenant du 4',6-diamidino-2-phénylindole. La glycémie a considérablement augmenté après l’ACMOO chez les souris ayant reçu une injection de glucose par rapport aux groupes salins. Aucun infarctus visible n’a été observé sur des tranches de cerveau dans le groupe placebo avec solution saline ou placebo avec glucose. Le MCAO avec le groupe glucose a montré un volume d’infarctus cérébral significativement plus important par rapport au groupe MCAO avec solution saline. De multiples hémorragies ponctuées ont été observées dans l’hémisphère ischémique du MCAO avec le groupe glucose, qui étaient absents dans les autres groupes. Une infiltration significative de cellules sanguines a été notée dans les régions d’infarctus du cortex et du striatum dans le groupe MCAO avec glucose. La perméabilité au bleu d’Evans et la fuite de FITC-dextran étaient nettement plus élevées dans le groupe MCAO avec glucose que dans le groupe MCAO avec solution saline.