Name: Un test de co-invasion macrophage-tumeur sphéroïde (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-01-24T13:50:00.000+00:00
Duration: 9 min 1 s
Description: Découvrez un test de co-invasion macrophage-tumeur sphéroïde pour étudier les interactions cellulaires dans une matrice de collagène 3D. Cette méthode permet d'analyser l'influence de KIF16B sur l'invasion tumorale.

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<meta charset="utf8"></head><body>Examen des interactions macrophage-sphéroïde tumoral dans une configuration de matrice de collagène 3D

<ol><li>Lendeckel, U., Venz, S., Wolke, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages%3A+shapes+and+functions%5BTitle%5D)+AND+%22ChemTexts%22%5BJournal%5D)">Macrophages: shapes and functions.</a> ChemTexts. 8 (2), 12(2022).</li>
<li>Dallavalasa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+tumor+associated+macrophages+%28TAMs%29+in+cancer+progression%2C+chemoresistance%2C+angiogenesis+and+metastasis+-+Current+status%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">The role of tumor associated macrophages (TAMs) in cancer progression, chemoresistance, angiogenesis and metastasis - Current status.</a> Curr Med Chem. 28 (39), 8203-8236 (2021).</li>
<li>Pan, Y., Yu, Y., Wang, X., Zhang, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-associated+macrophages+in+tumor+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Tumor-associated macrophages in tumor immunity.</a> Front Immunol. 11, 583084(2020).</li>
<li>Boutilier, A. J., Elsawa, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+Polarization+States+in+the+Tumor+Microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Macrophage Polarization States in the Tumor Microenvironment.</a> Int J Mol Sci. 22 (13), 6995(2021).</li>
<li>Wenzel, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intercellular+transfer+of+cancer+cell+invasiveness+via+endosome-mediated+protease+shedding%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Intercellular transfer of cancer cell invasiveness via endosome-mediated protease shedding.</a> Nat Commun. 15 (1), 1277(2024).</li>
<li>Anfray, C., Ummarino, A., Calvo, A., Allavena, P., Torres Andon, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+analysis+of+tumor-associated+macrophages+in+the+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">In vivo analysis of tumor-associated macrophages in the tumor microenvironment.</a> Methods Mol Biol. 2614, 93-108 (2023).</li>
<li>Hey, S., Wiesner, C., Barcelona, B., Linder, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KIF16B+drives+MT1-MMP+recycling+in+macrophages+and+promotes+co-invasion+of+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Sci+Alliance%22%5BJournal%5D)">KIF16B drives MT1-MMP recycling in macrophages and promotes co-invasion of cancer cells.</a> Life Sci Alliance. 6 (11), e202302158(2023).</li>
<li>Wu, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasticity+of+cancer+cell+invasion%3A+Patterns+and+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Transl+Oncol%22%5BJournal%5D)">Plasticity of cancer cell invasion: Patterns and mechanisms.</a> Transl Oncol. 14 (1), 100899(2021).</li>
<li>Shi, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+insights+and+therapeutic+intervention+of+tumor+metastasis%3A+latest+developments+and+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Signal+Transduct+Target+Ther%22%5BJournal%5D)">Mechanism insights and therapeutic intervention of tumor metastasis: latest developments and perspectives.</a> Signal Transduct Target Ther. 9 (1), 192(2024).</li>
<li>Li, G. N., Livi, L. L., Gourd, C. M., Deweerd, E. S., Hoffman-Kim, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+and+morphological+changes+of+neuroblastoma+cells+in+response+to+three-dimensional+matrices%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">Genomic and morphological changes of neuroblastoma cells in response to three-dimensional matrices.</a> Tissue Eng. 13 (5), 1035-1047 (2007).</li>
<li>Lin, Y. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+cancer+cell+invasion+and+T-cell+cytotoxicity+in+3D+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Monitoring cancer cell invasion and T-cell cytotoxicity in 3D culture.</a> J Vis Exp. 160, e61392(2020).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Angiogenèse sur 15 micro-lames&nbsp ;</td><td>ibidi</td><td>81506</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Invitrogen</td><td>00-4555-56</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 Phalloïdine&nbsp ;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A12380</td><td></td></tr><tr><td>CD14 MicroBeads</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-050-201</td><td></td></tr><tr><td>CO2</td><td>Incubateur Liant</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Collagène I Queue de Rat&nbsp ;</td><td>Corning</td><td>354236</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>AppliChem</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM (1x) + GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>31966-021</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Anprotec</td><td>MS01Y71003</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Bio& Cellule</td><td>FBS. S 0613</td><td></td></tr><tr><td>Fidji&nbsp ;</td><td>NIH</td><td>ImageJ 2 Version : 2.3.0/1.53s</td><td></td></tr><tr><td>Formaldéhyde 37 %&nbsp ;</td><td>252549-500ml</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td></tr><tr><td>H1299-GFP lignée</td><td></td><td></td><td></td>cellulaire</tr><tr>Sigma-Aldrich<td>Albumine sérique humaine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5843</td><td></td></tr><tr><td>Leica TCS SP8 X</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>l-glutamine&nbsp ;</td><td>Gibco</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>Milieu de séparation des lymphocytes (LSM) 1077</td><td>PromoCell</td><td>C-44010</td><td></td></tr><tr><td>MS Colonnes</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-201</td><td></td></tr><tr><td>acides aminés non essentiels&nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>Pen Strep</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640&nbsp ;</td><td>Gibco</td><td>81275-034</td><td></td></tr><tr><td>TC-Platte 96 Puits, BIOFLOAT, R&nbsp ;</td><td>SARSTEDT</td><td>83,39,25,400</td><td></td></tr><tr><td>VORTEX-GENE 2&nbsp ;</td><td>Industries</td><td></td><td></td> scientifiques</tr></tbody></table>

un test de co-invasion macrophage-tumeur sphéroïde

A Macrophage-Tumor Spheroid Co-Invasion Assay

La figure 1 montre un sphéroïde H1299-GFP imagé aux jours respectifs d’incubation dans une matrice de collagène I. Une image en fond clair correspondante, prise au jour 0, montre également les macrophages humains primaires cocultivés avec le sphéroïde. L’image représentative enregistrée au jour 3 de l’expérience est agrandie après traitement. Différents paramètres pouvant être analysés sont indiqués, notamment le nombre de cellules envahissantes, les sites d’invasion collective et le périmètre des sphéroïdes. Le tableau ci-joint montre les résultats obtenus à partir de cette image. Le nombre de signaux détectés correspond à l’impression visuelle. Aucune perturbation du sphéroïde central n’est visible, ce qui indique une véritable invasion de cellules cancéreuses individuelles plutôt que des cellules dérivées de débris de sphéroïdes. Les résultats de différents sphéroïdes et conditions peuvent maintenant être comparés par analyse statistique.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67374/67374fig01.jpg"> 
Figure 1 : Résultats représentatifs. (panneau du haut) Imagerie du sphéroïde H1299-GFP au jour 0, au jour 1, au jour 2 et au jour 3 de l’incubation dans une matrice de collagène I. (Panneau central gauche) Une image en fond clair du sphéroïde montrant les macrophages humains primaires cocultivés. (Panneau central droit) Une image représentative acquise au jour 3 agrandie après traitement, montrant les différents paramètres pouvant être analysés (périmètre du sphéroïde en rouge ; tracé manuellement pour une meilleure visualisation). (Panneau inférieur) Les résultats obtenus à partir de l’image du panneau central droit. Remarque : Les macrophages ne sont pas visibles, car seul le canal GFP a été enregistré pour élucider le comportement des cellules cancéreuses. Barres d’échelle : 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67374/67374fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>

Un test de co-invasion macrophage-tumeur sphéroïde

The interaction of immune and cancer cells and their respective impact on metastasis represents an important aspect of cancer research. So far, only a few ...

Nous voulons étudier l’interaction entre les cellules cancéreuses et immunitaires afin de mieux comprendre comment elles interagissent pendant les métastases. Dans la plupart des cas, les modèles in vivo sont le moyen habituel de poursuivre des questions de recherche concernant l’invasion 3D des cellules cancéreuses dans le contexte du système immunitaire, ou des composants isolés du système sont au centre de l’attention. Une méthode permettant l’analyse du comportement cellulaire qui imite la complexité de la situation in vivo, mais permet une manipulation plus directe de caractéristiques environnementales spécifiques au microscope.Nous démontrons que les cellules cancéreuses non altérées réduisent l’invasion dans la matrice de collagène I 3D lorsqu’elles sont co-cultivées avec des macrophages qui ont été appauvris pour la protéine motrice KIF16B. Cela indique un rôle du recyclage des protéines de surface des macrophages par KIF16B dans le microenvironnement tumoral. Nous aimerions continuer à améliorer notre méthode de manière à permettre la visualisation de la dégradation matricielle à l’interface du contexte des cellules cancéreuses de macrophages, obtenant ainsi une meilleure compréhension des mécanismes de dégradation et d’adhésion.Pour commencer, cultivez des cellules GFP H1299 avec un milieu de cellules cancéreuses dans un flacon de culture cellulaire de 25 centimètres carrés à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone jusqu’à ce qu’elles atteignent 80 % de confluence. Lavez les cellules une fois avec du DPBS et ajoutez un millilitre de trypsine-EDTA pendant deux à trois minutes jusqu’à ce que les cellules se détachent. Arrêtez la réaction enzymatique en ajoutant deux millilitres de milieu cellulaire cancéreux.Ensuite, centrifugez la suspension cellulaire détachée dans un tube de 15 millilitres à 245 G pendant cinq minutes. Retirez la solution de surnageant contenant de la trypsine avant de laver la pastille avec cinq millilitres de DPBS. Après la centrifugation, remettre la pastille en suspension dans cinq millilitres de milieu cellulaire cancéreux.Comptez les cellules à l’aide d’une chambre de Neubauer. Transférez 8 000 cellules dans une plaque à très faible adhérence de 96 puits dans un volume final de 25 microlitres de milieu cellulaire cancéreux. Incuber les cellules pendant trois jours à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone.Après trois jours, vérifiez l’uniformité des sphéroïdes au microscope. Après avoir prélevé l’échantillon de sang humain, transférez 20 millilitres de sang d’une poche de transfusion dans un tube de réaction de 50 millilitres. Ajoutez 15 millilitres de milieu de séparation des lymphocytes dans un nouveau tube de 50 millilitres.Transférez soigneusement 20 millilitres de sang dans le tube contenant le milieu de séparation des lymphocytes sans mélanger, et centrifugez le mélange à 450 G pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius. Pendant la centrifugation, ajoutez 10 millilitres de RPMI 1640 Medium froid dans un nouveau tube de 50 millilitres. Après la centrifugation, transférez la phase blanche dense du tube contenant du sang dans le tube contenant du RPMI préparé et remplissez-le jusqu’à 50 millilitres de RPMI froid.Centrifugez la suspension à 450 G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius et jetez le surnageant. Remettez le granulé en suspension dans 10 millilitres de RPMI froid et remplissez-le jusqu’à 50 millilitres de RPMI 1640. Centrifugez à nouveau le mélange et remettez la pastille en suspension dans 50 millilitres de RPMI.Encore une fois, centrifugez l’échantillon et remettez en suspension la pastille cellulaire dans 1,5 millilitre de tampon monocytaire froid. Ensuite, ajoutez 250 microlitres de microbilles anti-CD14 dans la suspension cellulaire et incubez pendant 15 minutes sur de la glace. Pendant l’incubation, préparez une colonne de séparation en fixant un filtre à un support de séparateur magnétique.Ajoutez 900 microlitres de tampon monocytaire dans la colonne pour l’équilibre. Après l’incubation, versez la suspension cellulaire sur le filtre et laissez-la s’écouler par gravité dans un tube à déchets. Ajoutez un millilitre de tampon monocytaire pour laver la colonne contenant les cellules liées aux billes magnétiques.Remplacez le tube de déchets sous la colonne par un tube neuf de 50 millilitres contenant 20 millilitres de RPMI. Ajoutez trois millilitres de tampon monocytaire dans la colonne. Retirez la colonne du support magnétique et fixez le tampon.Pressez les cellules dans le tube de 50 millilitres préparé et remplissez-le jusqu’à 30 millilitres avec RPMI. Comptez les cellules à l’aide d’une chambre de comptage Neubauer au microscope optique et ajustez le nombre de cellules à deux fois 10 à la puissance six cellules par millilitre avec RPMI. Semez un millilitre de suspension cellulaire dans chaque puits d’une chambre à six puits et incubez pendant deux à quatre heures à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone.Après l’incubation, vérifiez si les cellules ont bien adhéré et remplacez l’IPRP par 1,5 millilitre de monomilieu. Poursuivre l’incubation jusqu’à six jours jusqu’à ce que les monocytes se différencient en macrophages. Après avoir dérivé des macrophages humains primaires à partir d’échantillons de sang de donneur dans une plaque à six puits, ajoutez 500 microlitres d’Accutase et incubez pendant 40 minutes pour détacher les macrophages.Ajoutez ensuite 500 microlitres de fluide et transférez-le dans un tube à centrifuger de 15 millilitres pour la centrifugation. Ensuite, lavez une fois les cellules avec deux millilitres de DPBS et comptez-les avec une chambre Neubauer. Diluez le nombre souhaité de macrophages dans 40 microlitres de collagène que je mélange, et vortex brièvement le tube.Pour laver les sphéroïdes, ajoutez 300 microlitres de DPBS dans les puits d’une plaque à 96 puits. Utilisez une pointe de pipette bleue d’un millilitre avec une extrémité coupée pour recueillir le stéroïde avec DPBS. Une fois que le stéroïde s’est installé dans la pointe, poussez brièvement la pipette au fond de la chambre d’imagerie pour transférer le stéroïde tumoral par tension superficielle.Éliminez autant que possible le DPBS résiduel transféré avec le stéroïde. Ajoutez rapidement 40 microlitres de mélange de macrophages de collagène I sur la chambre d’imagerie contenant des stéroïdes. Incuber la plaque pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone dans des conditions humides pour polymériser complètement le mélange de collagène.Après la polymérisation, ajoutez soigneusement 25 microlitres de milieu cellulaire cancéreux dans chaque puits et poursuivez l’incubation pendant trois jours. Imagez l’échantillon vivant à l’aide d’un microscope à balayage laser aux points temporels souhaités. La surface du sphéroïde H1299 GFP a été mesurée à 40 307 micromètres carrés le troisième jour de l’invasion, tandis que le périmètre du sphéroïde s’est avéré être de 1700,17 micromètres, indiquant une croissance au fil du temps.Une invasion collective de cellules cancéreuses à partir du sphéroïde a été observée. 51 particules isolées ont été identifiées, servant d’indicateur de l’invasion individuelle des cellules cancéreuses. Le sphéroïde a maintenu un rapport d’aspect de 1,10 et une circularité de 0,18, montrant une faible déformation.

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Recherche

JoVE Journal

Cancer Research

Recherche sur le cancer

Un test pour mesurer quantitativement Transforming Growth Factor (TGF)-β-induite invasion dans des gels de collagène en 3 dimensions est décrite. Ce test prend avantage de la série MCF10A de lignées cellulaires, qui représentent les différentes étapes du développement du cancer du sein. Cette méthode peut être adoptée pour être utilisé avec d'autres lignées cellulaires et pourraient être utilisées pour étudier d'autres activateurs ou des inhibiteurs potentiels de l'invasion.

Assay Sphéroïde pour mesurer le TGF-β induit Invasion

Cette vidéo présente une méthode permettant d’établir une co-culture tridimensionnelle de sphéroïdes tumoraux et de lymphocytes T. Un moulage à l’agarose avec des micropuits contenant des sphéroïdes tumoraux est préparé, suivi de l’ajout de lymphocytes T. Après l’incubation, cette configuration permet d’étudier l’interaction des lymphocytes T avec les sphéroïdes tumoraux dans un environnement tridimensionnel contrôlé.

Un modèle de co-culture tridimensionnelle de lymphocytes T infiltrants dans des sphéroïdes tumoraux

L’invasion des tissus normaux environnants est une caractéristique déterminante des tumeurs malignes. Nous fournissons ici un test simple et semi-automatisé sur microplaque d’invasion dans une biomatrice 3D naturelle qui a été illustré par un certain nombre de modèles de cancers humains avancés.

Tridimensionnelle (3D) Tumor Spheroid Invasion Assay

Cette méthode évalue l’invasion des cellules cancéreuses des sphéroïdes dans une matrice 3D environnante.  Les sphéroïdes sont générés par la méthode de culture de gouttes suspendues, puis intégrés dans une matrice composée de matériaux de membrane basale et de collagène de type I.  L’invasion des sphéroïdes est ensuite surveillée.

Une cellule cancéreuse Spheroid test pour évaluer Invasion dans un Cadre 3D

Pour comprendre le comportement malin du cancer, il faut créer des modèles précis de la façon dont les cellules tumorales interagissent avec les composants du microenvironnement tumoral, tels que les macrophages. Ici, nous décrivons deux méthodes pour étudier l’interaction des cellules de glioblastome avec les macrophages associés aux tumeurs et la microglie où l’effet sur l’invasion du glioblastome est évalué.

Coculture Assays pour étudier macrophage et microglie Stimulation de glioblastome Invasion

Le microenvironnement tumoral est une partie essentielle de la croissance du cancer et de l’invasion. Pour imiter la progression du carcinome, une matrice humaine biologiquement pertinente est nécessaire. Ce protocole introduit une amélioration pour le test in vitro d’invasion de sphéroïdes en trois dimensions en appliquant une matrice humaine à base de leiomyoma. Le protocole introduit également une analyse d’invasion cellulaire basée sur ordinateur.

Matrice entièrement humaine basée sur la tumeur dans l’essai d’invasion de sphéroïdes en trois dimensions

Cet article représente un analyse in vitro utile pour évaluer la capacité du milieu conditionné des cellules de tumeur pour attirer des macrophages.

In Vitro Assay to Study Tumor-macrophage Interaction (en)

L'objectif de ce protocole est d'établir un modèle in vitro 3D pour étudier la différenciation des fibroblastes associés au cancer (CAF) dans un environnement en vrac tumoral, qui peut être abordé dans différents systèmes d'analyse, tels que l'immunofluorescence, la transcription l'analyse et l'imagerie des cellules de vie.

Un modèle sphéroïde 3D comme un système plus physiologique pour les fibroblastes associés au cancer différenciation et l'invasion des études in vitro

Ici, nous présentons une méthode utilisant des supports perméables de membrane pour faciliter l'étude de la signalisation de paracrine de non-contact employée par des cellules de tumeur pour supprimer la réponse immunitaire. Le système est disposé à étudier le rôle des facteurs tumeur-sécrétés en amortissant l'activation de macrophage.

Étudier les effets des ligands paracriné sécrétés par les tumeurs sur l'activation du macrophage à l'aide de la co-culture avec des supports membranaires perméables

L’approche présentée évalue simultanément l’invasion de cellules cancéreuses dans les essais sphéroïdes 3D et la cytotoxicité de cellule T. Les sphéroïdes sont générés dans un jet de multi-microwell sans échafaudage. La co-culture et l’intégration dans la matrice de collagène de type I sont effectuées dans le même dispositif qui permet de surveiller l’invasion des cellules cancéreuses et la cytotoxicité médiée par cellules T.

Surveillance de l’invasion des cellules cancéreuses et de la cytotoxicité des lymphocytes T dans la culture 3D

Présenté ici est un protocole pour la fabrication d’un dispositif d’imagerie sphéroïde. Ce dispositif permet l’imagerie dynamique ou longitudinale de fluorescence des sphéroïdes de cellules cancéreuses. Le protocole offre également une procédure simple de traitement d’image pour l’analyse de l’invasion des cellules cancéreuses.

Imagerie et analyse de fluorescence résolues dans le temps de l’invasion des cellules cancéreuses dans le modèle sphéroïde 3D

Découvrez un test de co-invasion macrophage-tumeur sphéroïde pour étudier les interactions cellulaires dans une matrice de collagène 3D. Cette méthode permet d'analyser l'influence de KIF16B sur l'invasion tumorale.

Un test de co-invasion macrophage-tumeur sphéroïde

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