Inactivation efficace d’un gène dans le foie par injection intrasplénique d’un petit ARN en épingle à cheveux délivré par le virus adéno-associé de sérotype 8 (AAV8)
1 novembre 2024
Ce protocole décrit comment l’injection intrasplénique de petits ARN en épingle à cheveux délivrés par AAV8 atteint la même efficacité d’inactivation génique dans le foie que l’injection dans la veine porte, représentant une procédure plus simple avec une mortalité et des complications périopératoires et postopératoires beaucoup plus faibles.
Notre objectif de recherche est d’améliorer la compréhension de la progression des troubles complexes à l’aide de méthodes computationnelles et expérimentales. Nous nous concentrons sur l’élaboration de stratégies visant à ralentir ou à inverser la progression de maladies complexes telles que les troubles métaboliques, le vieillissement et le cancer. La question clé que nous essayons de résoudre ici est de savoir pourquoi certaines lésions précancéreuses se transforment en cancer, pourquoi certains tissus adultes peuvent se régénérer après une blessure et ce qui motive le processus de vieillissement. Ces technologies comprennent le séquençage du génome entier, le séquençage de cellules uniques, des algorithmes de calcul et d’apprentissage automatique robustes, la modélisation de l’IA et des modèles animaux expérimentaux pertinents pour les maladies humaines. Ce protocole décrit une méthode d’in-vivo Gene Knockdown utilisant des injections intraspléniques d’AAV8, délivrée par une construction d’ARN en épingle à cheveux courte ciblant la souche nucléaire. La souche nucléaire est un facteur d’auto-renouvellement des cellules souches qui joue un rôle important dans le développement embryonnaire, le développement du cancer et la régénération des tissus adultes. Nous avons montré que lors de la transplantation, les injections d’AAV8 délivrent de courts ARN en épingle à cheveux et atteignent la même efficacité de neutralisation. Une série d’injections d’AAV8 dans la veine porte permet d’obtenir une construction, mais elle est associée à beaucoup moins de complications et la procédure est beaucoup plus simple.
[Instructeur] Pour commencer, transférez les souris anesthésiées dans la zone chirurgicale aseptique en position couchée latérale droite. À l’aide d’une lame chirurgicale, faites une incision de 15 millimètres sur la paroi abdominale supérieure gauche, suivie d’une incision de 10 millimètres sur le péritoine. À l’aide d’une pince, exposez doucement la rate et placez un morceau de gaze humide en dessous pour la maintenir en place. Ensuite, à l’aide d’une aiguille de calibre 30, injectez 50 microlitres de virus AAV8 dans la rate à une profondeur de trois millimètres sous la surface sur une période de 30 secondes. Ensuite, couvrez le site avec un coton-tige et compressez-le pendant une minute. Ensuite, suturez la paroi abdominale à l’aide d’une suture résorbable 4-0. Fermez ensuite la peau à l’aide d’une suture non résorbable 4-0. Après l’anesthésie, les souris effectuent une laparotomie en pratiquant une incision médiane sur la peau, puis dans le péritoine. Placez un tampon de gaze stérile imbibé de solution saline stérile sur le côté gauche de la souris. À l’aide d’un coton-tige stérile, retirez doucement le gros et l’intestin grêle. Placez les intestins sur un tampon de gaze humide et couvrez-les pour éviter le dessèchement ou le contact avec la peau. Ensuite, à l’aide d’une aiguille stérile de calibre 32, injectez 50 microlitres de virus AAV8 dans la veine porte à un angle de moins de cinq degrés. Insérez l’aiguille de trois à cinq millimètres dans la veine porte et laissez le sang s’écouler au-delà de l’aiguille pendant cinq secondes pour éviter le reflux. Ensuite, placez un coton-tige stérile sur le site d’injection et appliquez une légère pression jusqu’à ce que la veine soit complètement fermée et qu’aucun saignement ne se produise. Ensuite, ramenez doucement les organes internes dans la cavité abdominale. Ensuite, fermez la paroi abdominale à l’aide d’une suture résorbable 4-0 et la peau avec une suture non résorbable 4-0. Les injections intraspléniques et dans la veine porte ont montré une efficacité statistiquement équivalente de l’ARNm, sans qu’aucune différence significative n’ait été observée entre les deux méthodes.
Aperçu
Ce protocole décrit une méthode de silençage génique in vivo utilisant des injections intraspléniques d'ARN court en épingle à cheveux délivré par AAV8. Cette approche permet d'obtenir une efficacité de silençage génique comparable à celle de l'injection dans la veine porte, tout en étant plus simple et associée à moins de complications.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Thérapie génique
- Neurosciences
- Médecine régénérative
Contexte
- La compréhension des techniques d'interférence génique est essentielle pour l'étude des maladies complexes.
- AAV8 est un vecteur viral utilisé pour la livraison de matériel génétique.
- Les facteurs nucléaires de souche jouent un rôle important dans divers processus biologiques.
- La réduction des complications chirurgicales est essentielle pour améliorer les résultats expérimentaux.
Objectif de l'étude
- Comparer l'efficacité des injections intraspléniques et de celles de la veine porte pour l'inhibition génique.
- Simplifier la procédure tout en conservant son efficacité.
- Réduire les complications périopératoires et postopératoires.
Méthodes utilisées
- Injection intrasplénique d'ARN court en épingle à cheveux délivré par AAV8.
- Injection dans la veine porte d'AAV8 comme méthode comparative.
- Utilisation de souris anesthésiées pour les interventions chirurgicales.
- Analyse statistique pour comparer l'efficacité d'extinction génique.
Résultats principaux
- Les deux méthodes d'injection ont permis d'obtenir une efficacité de silençage génique statistiquement équivalente.
- L'injection intrasplénique était associée à moins de complications.
- La procédure était plus simple par rapport à l'injection dans la veine porte.
- Les résultats appuient l'utilisation de l'injection intrasplénique comme alternative viable.
Conclusions
- L'injection intrasplénique d'AAV8 est une méthode efficace pour l'extinction génique.
- Cette méthode peut stimuler la recherche en thérapie génique et en médecine régénérative.
- Des études ultérieures pourraient explorer les effets à long terme de cette technique.
Questions fréquemment posées
Pertinence industrielle pour les cadres
L'extinction efficace et peu invasive des gènes dans le foie est essentielle pour la validation des cibles et l'atténuation des risques mécanistiques dans les recherches sur le métabolisme, la régénération et l'oncologie. Le protocole de livraison intrasplénique d'AAV8-shARN permet une inhibition génique robuste avec un risque procédural réduit, soutenant ainsi une génomique fonctionnelle fiable dans des modèles pertinents pour la maladie. Cette approche simplifie les étapes précoces de la découverte et les flux de travail précliniques en minimisant les obstacles techniques et les complications périopératoires.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Permet l'interrogation fonctionnelle des gènes cibles en pathophysiologie hépatique à l'aide de modèles in vivo.
- Facilite la détection mécanistique des risques en assurant un silençage génique fiable avec des effets hors cible minimaux.
- Permet un test rapide d'hypothèses sur la fonction des gènes dans les voies métaboliques et régénératives.
Développement de tests et de criblages
- Offre un système validé pour générer des modèles d'extinction génique adaptés à l'écranage de composés en aval.
- Garantit une réduction reproductible et quantitative de l'expression génique, soutenant la standardisation des tests.
- Réduit la variabilité des procédures, améliorant l'évolutivité et la réutilisation de la plateforme pour plusieurs cibles.
Recherche translationnelle et préclinique
- S'aligne sur des systèmes in vivo pertinents pour la maladie afin de découvrir des biomarqueurs translationnels.
- Assure une continuité depuis la phase de découverte précoce jusqu'à la validation préclinique en permettant une modulation génique cohérente.
- Permet de prendre des décisions d'avancement adaptées au niveau de risque en minimisant les facteurs de confusion techniques et biologiques.
Intégration du pipeline et du flux de travail
Ce protocole d'AAV8-shARNi intrasplénique s'intègre dans la continuité découverte-préclinique, permettant une validation efficace des cibles et la génération de modèles pour l'identification de candidats-médicaments et les études translationnelles.
- Découverte en biologie : Accélère le test des hypothèses et la clarification des voies biologiques en permettant une inhibition rapide des gènes in vivo.
- Criblage : Assure une inhibition reproductible des gènes, favorisant la préparation des tests et la génération de résultats quantitatifs.
- Analytique : Fournit des mesures statistiquement robustes de la réduction de l'expression génique pour des analyses comparatives.
- Recherche translationnelle : Garantit une modulation de gènes pertinents pour la maladie dans des modèles précliniques, soutenant l'alignement des biomarqueurs.
- Réutilisation en entreprise : Propose un protocole standardisé et peu complexe, adaptable à diverses cibles géniques et modèles de maladies.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive et réduit l'ambiguïté mécanistique dans la validation des cibles.
- Valeur opérationnelle : Améliore la reproductibilité, la standardisation et la sécurité procédurale dans les protocoles d'extinction génique.
- Valeur stratégique : Améliore la qualité des décisions de poursuite ou d'abandon et l'efficacité du capital en réduisant les taux d'échec technique.
- Impact sur le portefeuille : Permet une priorisation et une avancée ajustées au risque des cibles validées vers les filières précliniques.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en chirurgie sur petits animaux et en manipulation de vecteurs viraux.
- Requiert un accès aux plateformes de production d'AAV8 et d'analyse quantitative de l'expression génique.
- Exige une standardisation interéquipes pour l'exécution du protocole et l'interprétation des données.
- Adaptable à diverses cibles géniques, mais peut nécessiter une optimisation selon les modèles de maladie.
- Les limites potentielles incluent l'immunogénicité du vecteur et les contraintes procédurales spécifiques au modèle.
