Name: Exploiter la puissance des cargaisons de microARN dans de petites vésicules extracellulaires libérées par des sections de cerveau humain fraîchement congelées (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-08T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 55 s
Description: Découvrez une méthode efficace pour extraire des microARN de vésicules extracellulaires à partir de tissu cérébral humain congelé. Ce protocole reproductible facilite l'identification de biomarqueurs pour le diagnostic précoce des troubles neurologiques.

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<meta charset="utf8"></head><body>Isolement efficace des sEVs cérébraux à partir de tissus minimaux pour la découverte de biomarqueurs

<ol><li>Jia, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+extracellular+vesicles+isolation+and+separation%3A+Current+techniques%2C+pending+questions+and+clinical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">Small extracellular vesicles isolation and separation: Current techniques, pending questions and clinical applications.</a> Theranostics. 12 (15), 6548-6575 (2022).</li>
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<li>Constantinides, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CSF+A%CE%B242+and+A%CE%B242%2F+A%CE%B240+ratio+in+Alzheimer%27s+disease+and+frontotemporal+dementia%5BTitle%5D)+AND+%22Diagnostics%22%5BJournal%5D)">CSF Aβ42 and Aβ42/ Aβ40 ratio in Alzheimer's disease and frontotemporal dementia.</a> Diagnostics. 13 (4), 783(2023).</li>
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<li>Vella, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rigorous+method+to+enrich+for+exosomes+from+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Extracell+Vesicles%22%5BJournal%5D)">A rigorous method to enrich for exosomes from brain tissue.</a> J Extracell Vesicles. 6 (1), 1348885(2017).</li>
<li>Yousif, G., Qadri, S., Parray, A., Akhthar, N., Shuaib, A., Haik, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+derived+neuronal+markers%3A+Immunoaffinity+isolation+and+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Neuromolecular+Med%22%5BJournal%5D)">Exosomes derived neuronal markers: Immunoaffinity isolation and characterization.</a> Neuromolecular Med. 24 (3), 339-351 (2022).</li>
<li>Kumar, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+microfluidic+approaches+for+the+isolation+and+detection+of+exosomes%5BTitle%5D)+AND+%22TRAC-Trend+Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Recent advances in microfluidic approaches for the isolation and detection of exosomes.</a> TRAC-Trend Anal Chem. 159, 116912(2023).</li>
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<li>Gomes, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+isolation+method+for+spontaneously+released+extracellular+vesicles+from+brain+tissue+and+its+implication+for+stress-driven+brain+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Commun+Signal%22%5BJournal%5D)">A novel isolation method for spontaneously released extracellular vesicles from brain tissue and its implication for stress-driven brain pathology.</a> Cell Commun Signal. 21 (1), 35(2023).</li>
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</ol>

<table><tbody><tr><td>Albumine sérique bovine</td><td>Merck</td><td>A9418-100G</td><td></td></tr><tr><td>Masque cellulaire Coloration à membrane plasmique orange</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>C10045</td><td></td></tr><tr><td>Collagénase de type III</td><td>StemCell Technologies</td><td>07422</td><td></td></tr><tr><td>Colonnes ExoSpin et systèmes</td> de guidage de cellules tampons <td>Ltd.</td><td>EX01-50</td><td>Ce kit contient des colonnes SEC utilisées dans cette expérience, un tampon de précipitation et un PBS sans EV.</td></tr><tr><td>Cocktail d’inhibiteurs de protéase Halt (100x)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>78429</td><td></td></tr><tr><td>Hibernate-E Medium</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A1247601</td><td></td></tr><tr><td>Laemmli Sample Buffer (4x)</td><td>BioRad</td><td>1610747</td><td></td></tr><tr><td>Lexogen Small RNA-Seq Library Prep Kit</td><td>Lexogen</td><td>052.24</td><td>Ce kit contient une petite boîte de réactifs de préparation d’ARN avec une plaque d’amorce d’index i7.&nbsp ;</td></tr><tr><td>miRNeasy Micro Kit (50)</td><td>Qiagen</td><td>217084</td><td>Ce kit contient un réactif de lyse de récupération d’ARN de haute qualité (Qiazol), des colonnes d’isolement d’ARN, des tampons d’isolement (RWT, RPE) et de l’eau sans RNase.</td></tr><tr><td>Kit de réactifs MiSeq v3</td><td>Illumina</td><td>MS-102-3001</td><td>Il s’agit du kit de préparation Illumina</td></tr><tr><td>Membrane nitrocellulosique, 0,45 &mu ; m</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>88018</td><td></td></tr><tr><td>PE/Dazzle 594 Anticorps CD63 anti-humain</td><td>BioLegend</td><td>143914</td><td>Utilisé pour l’analyse fNTA</td></tr><tr><td>PE/Dazzle 594 Anticorps CD81 anti-humain</td><td>BioLegend</td><td>349520</td><td>Utilisé pour l’analyse fNTA</td></tr><tr><td>PE/Dazzle 594 Anticorps CD9 anti-humain</td><td>BioLegend</td><td>312118</td><td>Utilisé pour l’analyse fNTA</td></tr><tr><td>PhosSTOP</td><td>Merck</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4906845001 Pierce BCA Kit de dosage des protéines</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25530049</td><td></td></tr><tr><td>Qubit Kit de dosage des microARN</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Q32880</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 1X dsDNA HS Kit de dosage</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Q33230</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 3.0</td><td>Fluoromètre ThermoFisher Scientific</td><td>Q33216</td><td></td></tr><tr><td>Tampon de lyse et d’extraction RIPA</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>89901</td><td></td></tr><tr><td>RNase A</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>EN0531</td><td></td></tr><tr><td>SuperSignal West Femto Sensibilité maximale</td><td>Substrat ThermoFisher Scientific</td><td>34094</td><td></td></tr></tbody></table>

exploiter la puissance des cargaisons de microarn dans de petites vésicules extracellulaires libérées par des sections de cerveau humain fraîchement congelées 

Harnessing the Power of MicroRNA Cargoes in Small Extracellular Vesicles Released from Fresh-Frozen Human Brain Sections

Pour confirmer la présence de BDsEVs, trois techniques ont été utilisées : le western blot, le NTA et le TEM (figure 3). Les résultats du transfert Western (figure 3A et fichier supplémentaire 1) montrent la présence des cinq marqueurs positifs (CD9, CD63, CD81, Flot-1 et TSG101) et l’absence de calnexine dans les sEV (utilisée comme témoin négatif), confirmant l’absence de contamination par le contenu cellulaire. Comme prévu, les homogénats cérébraux (BH) montrent plus de protéines que ce qui a été observé dans les sEV pour les marqueurs testés. Les images TEM ont confirmé la morphologie des BDsEVs et leur taille relative dans l’échantillon (figure 3B), ce qui a été confirmé par l’analyse du suivi des nanoparticules (figure 3C).
La figure 3C (panneau supérieur) montre les tailles de particules isolées comprises entre 50 et 200 nm. D’après les données NTA, en prenant le résultat de la diffusion comme 100 % des particules représentées, CMO représente environ 52,35 % des particules (Figure 3C, panneau inférieur) à avoir une bicouche lipidique. Parmi ces particules colorées au CMO, 34,66 % contenaient du CD9, 15,49 % contenaient du CD63 et 12,01 % contenaient du CD81. Voir le fichier supplémentaire 2 pour les données de contrôle NTA.
Les données de quantification de l’ARN isolé (tableau 2) montrent des niveaux allant de 3,24 à 8,76 (ng/μL), valeurs qui ont été normalisées lors de la génération des banques d’ADNc. Les résultats de l’analyse TapeStation (Figure 4) montrent des pics majeurs d’environ 120-160 pb, avec des pics plus petits en dessous d’environ 50 pb et d’autres pics plus petits qui sont plus élevés d’environ 484 pb.
Les contrôles qualité des données de séquençage de nouvelle génération montrent des lectures de très haute qualité après le découpage de l’adaptateur (Figure 5A). Toutes les positions de séquence montrent un score Phred de &gt;30, indiquant des taux d’erreur inférieurs à 1 sur 1000 nucléotides. La figure 5B montre que la plupart des séquences se situent autour de 21-22 pb, ce qui correspond à la plage de taille attendue pour les microARN. Grâce à une cartographie plus poussée en aval (à l’aide de BowTie2), à l’aide du biooutil d’analyse Flagstat de Samtools, sur 1 304 100 séquences alignées, 1 116 264 (85 %) ont été cartographiées dans les régions de microARN du génome humain (build hg38 ; Tableau 3).
Sur le total des miARN, 808 miARN ont été exprimés dans les 3 échantillons, dont 344 entre les trois échantillons (~43 %), 5 entre le contrôle 1 et le témoin 2, 183 entre le témoin 1 et le témoin 3, et 16 partagés entre le témoin 2 et le témoin 3 (figure 6). D’après ces données, les miARN les plus élevés exprimés dans les trois BDsEV sont has-let-7b-5p, has-miR-143-3p, has-miR-30a-5p, has-miR-221-3p et has-let7i-5p. De même, les 5 miARN les moins différentiellement exprimés dans les échantillons de BDsEVs (lectures &gt;10) sont has-miR-128-2-5p, has-miR-182-5p, has-miR-193b-5p, has-miR-448 et has-miR-505-3p. Tous les comptes de lecture bruts et normalisés sont donnés dans le fichier supplémentaire 3.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67379/67379fig01.jpg"> 
Figure 1 : Flux de travail de traitement des tissus. La figure montre le processus par étapes d’isolement des sEVs dérivés du cerveau (BDsEVs) à partir de sections de cerveau fraîchement congelées à l’aide de la chromatographie d’exclusion stérique. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67379/67379fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67379/67379fig02.jpg"> 
Figure 2 : Flux de travail d’isolement d’ARN à partir de BDsEV. La figure montre le processus par étapes d’isolement de l’ARN total des BDsEV, y compris l’étape de prétraitement consistant à éliminer tout ARN extracellulaire à l’aide de la protéinase K et de la RNase A. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67379/67379fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67379/67379fig03.jpg"> 
Figure 3 : Flux de travail de caractérisation BDsEV. La figure montre différentes méthodes pour caractériser les BDsEVs. (A) Western blot pour détecter les marqueurs protéiques spécifiques de sEV. BH Homogénat cérébral. La calnexine est un contrôle négatif pour les sEVs - l’absence dans sEV et la présence dans BH confirment la pureté de l’échantillon sEV. Pour d’autres marqueurs, comme prévu, la quantité de protéines est plus élevée dans les échantillons BH que dans les échantillons sEV (20 μg de protéines chargées par puits). (B) Image représentative de microscopie électronique à transmission (MET) pour les BDsEVs à l’échelle de 200 μM, confirmant la morphologie attendue avec une membrane bicouche lipidique. (C) Graphique de distribution granulométrique pour l’analyse de suivi des nanoparticules (NTA) pour toutes les particules (panneau supérieur). Chaque point de données représente la variation sur trois répétitions. Proportions normalisées pour les particules biologiques (sEV) et proportions relatives pour des marqueurs de surface spécifiques (panneau inférieur) (données indiquées sous forme de moyenne ± SEM des puits triples (n = 3)). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67379/67379fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67379/67379fig04.jpg"> 
Figure 4 : Contrôle de la qualité de la préparation de la banque d’ADNc. Analyse par bandestation d’échantillons individuels après préparation de la banque d’ADNc. Les pics affichés dans chaque graphique affichent la taille de chaque préparation (axe horizontal, en bp) et l’intensité respective de chaque pic (axe vertical, FU). Les pics attendus de la petite banque d’ARN se situent autour de 120-160 pb, comme le montre la figure. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67379/67379fig04large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67379/67379fig05.jpg"> 
Figure 5 : Contrôle de la qualité du séquençage des micronomes. (A) Tracé FASTQC pour la qualité de lecture des échantillons individuels après le découpage de l’adaptateur. L’axe horizontal représente la position des nucléotides et l’axe vertical celui des scores Phred. Les boîtes à moustaches pour chaque position montrent la distribution du score Phred sur toutes les lectures pour chaque position. Toutes les distributions à l’intérieur de la zone verte confirment des données de très haute qualité (&gt;Q30) impliquant une préparation d’échantillon de haute qualité. (B) La distribution de la longueur de séquence pour chaque échantillon montre que pour les trois échantillons, la majorité des lectures étaient d’environ 21-22 nucléotides - la plage de taille attendue pour les microARN. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67379/67379fig05large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67379/67379fig06.jpg"> 
Figure 6 : Chevauchement de l’expression des microARN dans tous les échantillons. Le diagramme de Venn indique le nombre de miARN détectés dans chaque échantillon (nombre de lectures ≥ 10) et de microARN spécifiques partagés dans plus d’un échantillon. Toutes les lectures brutes et normalisées sont affichées dans le fichier supplémentaire 3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67379/67379fig06large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Épitope de l’anticorps</td>
			<td>Facteur de dilution de l’anticorps </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Souris Anti-CD9</td>
			<td>1:2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Souris Anti-CD63</td>
			<td>1:2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Souris Anti-CD81</td>
			<td>1:2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-flottille souris 1</td>
			<td>1:2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Souris Anti-TSG101</td>
			<td>1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Calnexine de souris</td>
			<td>1:10 000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anticorps secondaire anti-souris</td>
			<td>1:3000</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tableau 1 : Épitopes d’anticorps utilisés pour la caractérisation des BDsEV et leurs facteurs de dilution respectifs. 
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Échantillon</td>
			<td>Concentration de miARN (ng/μL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td>8.76</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2</td>
			<td>3.24</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3</td>
			<td>5.33</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tableau 2 : Données de quantification de l’ARN isolé.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Échantillon</td>
			<td>Séquences alignées</td>
			<td>MiARN cartographiés</td>
			<td>Pourcentage ( %)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Échantillon de contrôle 1</td>
			<td>1 444 665</td>
			<td>1 133 437</td>
			<td>78.46</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Échantillon de contrôle 2</td>
			<td>442 808</td>
			<td>381 631</td>
			<td>86.18</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Échantillon de contrôle 3</td>
			<td>2 024 828</td>
			<td>1 983 726</td>
			<td>97.97</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Moyenne</td>
			<td>1 304 100.33</td>
			<td>1 166 264.67</td>
			<td>89.43</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tableau 3 : Quantité de séquences de miARN alignées et cartographiées avec succès. 
Fichier supplémentaire 1 : Données supplémentaires d’analyse par transfert de Western. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67379/Supplementary%20File%201.pdf" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>
Fichier supplémentaire 2 : Données de contrôle supplémentaires de la NTA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67379/Supplementary%20File%202.pdf" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>
Fichier supplémentaire 3 : Nombre de lectures brutes et normalisées de l’analyse de l’expression des miARN. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67379/Supplementary%20File%203.xlsx" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>
Fichier supplémentaire 4 : Données supplémentaires sur la concentration en protéines. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67379/Supplementary%20File%204.pdf" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>

Exploiter la puissance des cargaisons de microARN dans de petites vésicules extracellulaires libérées par des sections de cerveau humain fraîchement congelées 

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Nous fournissons un protocole pour l'isolement des microglies de différentes régions disséquées d'un hémisphère de cerveau de souris adulte, suivi de la préparation semi-automatisée de bibliothèque pour le séquençage profond d'ARN unicellulaire des transcriptomes pleine longueur. Cette méthode aidera à élucider l'hétérogénéité fonctionnelle des microglies dans la santé et la maladie.

Isolement des microglies spécifiques à la région de l'hémisphère cérébral d'une souris adulte pour le séquençage profond de l'ARN à une seule cellule

Cette procédure décrit la collecte de régions cérébrales congelées discrètes pour obtenir des protéines et de l’ARN de haute qualité à l’aide d’outils peu coûteux et couramment disponibles.

Collection de régions de cerveau de rongeur congelés pour des analyses en aval

Ici, nous décrivons un système de nucléofection conçu pour améliorer l’efficacité de l’administration de gènes dans les cellules souches neurales (NSC) élargies isolées de la zone sous-ventriculaire murine adulte. Les résultats démontrent que cette méthode améliore considérablement la perturbation des gènes dans les CSN, surpassant l’efficacité des protocoles de transfection traditionnels et augmentant le taux de survie cellulaire.

Isolement, expansion et nucléofection de cellules souches neurales de la zone sous-ventriculaire murine adulte

Découvrez une méthode efficace pour extraire des microARN de vésicules extracellulaires à partir de tissu cérébral humain congelé. Ce protocole reproductible facilite l'identification de biomarqueurs pour le diagnostic précoce des troubles neurologiques.

Exploiter la puissance des cargaisons de microARN dans de petites vésicules extracellulaires libérées par des sections de cerveau humain fraîchement congelées (Vidéo) | JoVE Journal

Exploiter la puissance des cargaisons de microARN dans de petites vésicules extracellulaires libérées par des sections de cerveau humain fraîchement congelées

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